直接抗人球蛋白试验标准操作流程

一、试验背景与目的直接抗人球蛋白试验（DirectAntiglobulinTest，DAT）是检测红细胞膜表面结合的不完全抗体（如IgG）或补体成分（如C3d）的核心技术，广泛应用于自身免疫性溶血性贫血、新生儿溶血病、药物性溶血性贫血及输血不良反应的诊断。本流程通过规范操作环节，确保试验结果的准确性与可重复性，为临床诊疗提供可靠依据。二、试验原理红细胞表面若结合有不完全抗体（如IgG类抗体，无法在盐水介质中直接凝集红细胞）或补体片段（如C3d），常规盐水凝集试验呈阴性。抗人球蛋白试剂（Coombs试剂）含有的抗IgG或抗补体抗体，可与红细胞表面的相应抗原特异性结合，通过“桥联作用”使致敏红细胞发生肉眼可见的凝集，从而判断红细胞是否被不完全抗体/补体致敏。三、试剂与器材（一）试剂1.抗人球蛋白血清：多特异性（含抗IgG、抗C3d等）或单特异性（如抗IgG、抗C3d），按说明书要求保存（通常2-8℃，避免反复冻融）。2.0.9%生理盐水：新鲜配制，无细菌污染（建议24小时内使用）。3.质控红细胞：阳性对照：含已知IgG致敏的红细胞（用于验证试剂活性）；阴性对照：未致敏的正常红细胞（用于排除非特异性凝集）。（二）器材一次性试管（10×75mm）、微量移液器（10-100μL）；离心机（转速≥1000×g，可调节时间）；光学显微镜、试管架、记号笔等。四、样本要求1.采集：静脉血，使用EDTA-K₂抗凝管（避免肝素干扰，防止体外补体激活），采集后4小时内处理；若需延迟，2-8℃保存不超过24小时（避免红细胞形态改变）。2.质量：样本无明显溶血、脂血或细菌污染；若患者近期输血，需注明输血史（避免供者红细胞干扰）。五、操作步骤（一）红细胞洗涤取抗凝全血2-3mL，加入等体积生理盐水，轻轻颠倒混匀后，以1000×g离心3分钟，弃上清（保留压积红细胞）。重复洗涤3次，末次洗涤后弃尽上清，制备约5%红细胞悬液（或压积红细胞，依试剂要求）。（二）加样与反应1.标记试管：取3支洁净试管，分别标记“待检”“阴性对照”“阳性对照”（若仅做基础试验，可省略阳性对照，但需定期验证试剂）。2.加样：待检管：加洗涤后红细胞悬液50μL+抗人球蛋白试剂50μL；阴性对照管：加红细胞悬液50μL+生理盐水50μL；阳性对照管：加阳性对照红细胞50μL+抗人球蛋白试剂50μL。（三）离心与观察将试管置于离心机，按试剂推荐参数（通常1000-1500×g离心15-30秒）离心后，立即取出试管，轻轻晃动（或用竹签轻挑），观察凝集情况：肉眼可见凝集：直接判读；肉眼无凝集：转移至载玻片，显微镜下观察细微凝集（需排除假阴性）。六、结果判读（一）阴性结果待检管与阴性对照管均无凝集（显微镜下红细胞散在，无典型凝集块）；阳性对照管凝集明显（试剂活性验证合格）。（二）阳性结果待检管出现肉眼可见的凝集块，显微镜下红细胞聚集呈网状/块状。可根据凝集强度分级（如+：细沙状凝集；++：中等凝集块；+++：粗大凝集块，液体澄清），结合临床进一步分析。（三）结果验证若待检管凝集、阴性对照管不凝集、阳性对照管凝集，结果可靠；若阴性对照管凝集，需重新洗涤红细胞或更换试剂，排除非特异性干扰。七、质量控制（一）试剂质控每批试验前，用阳性/阴性对照红细胞验证试剂：阳性对照应凝集，阴性对照应无凝集。若质控失败，禁止使用该试剂。（二）操作质控红细胞洗涤充分（至少3次），弃尽上清（避免血浆蛋白残留导致假阳性）；离心参数严格按要求（避免离心不足/过度导致假阴/阳性）；加样量准确（使用校准移液器）。（三）结果质控结合患者临床信息（如溶血症状、胆红素水平）验证结果合理性，必要时重复试验或换用单特异性试剂（如抗IgG、抗C3d）分析。八、注意事项1.样本处理：采集后尽快分离红细胞，避免体外补体激活；洗涤用生理盐水需新鲜、pH中性，防止红细胞形态破坏。2.试剂使用：抗人球蛋白试剂需按说明书保存，使用前平衡至室温，避免反复冻融。3.结果解释：DAT阳性仅提示红细胞致敏，需结合临床（如贫血、黄疸）、间接抗人球蛋白试验（IAT）等综合判断病因。4.安全防护：操作时戴手套、口罩，废弃样本按生物安全要求处理。九、