水凝胶3D构建肿瘤血管模型用于抗血管生成药物筛选

水凝胶3D构建肿瘤血管模型用于抗血管生成药物筛选演讲人2026-01-08

CONTENTS研究背景与意义肿瘤血管生成的生物学基础与模型构建需求水凝胶材料的选择与3D构建技术水凝胶3D肿瘤血管模型在抗血管生成药物筛选中的应用水凝胶3D肿瘤血管模型的挑战与未来方向总结与展望目录

水凝胶3D构建肿瘤血管模型用于抗血管生成药物筛选01ONE研究背景与意义

研究背景与意义肿瘤血管生成是恶性肿瘤进展、转移和复发过程中的关键环节，其本质是肿瘤细胞通过分泌血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等促血管生成因子，诱导血管内皮细胞（ECs）增殖、迁移，形成新生血管网络，为肿瘤提供氧气、营养物质并代谢废物。这一过程的异常激活不仅加速原发瘤生长，还为肿瘤细胞进入血液循环、远处转移提供通道。基于此，抗血管生成药物（如贝伐珠单抗、阿帕替尼等）通过阻断血管生成信号通路、抑制血管形成，已成为肿瘤综合治疗的重要策略。然而，临床数据显示，部分患者对现有抗血管生成药物响应率不足，或易产生耐药性，其核心原因在于传统药物筛选模型无法准确模拟肿瘤血管生成的复杂微环境，导致体外实验结果与体内疗效存在显著差异。

研究背景与意义传统肿瘤血管模型主要依赖二维（2D）培养体系（如ECs在塑料培养板上的单层生长）或动物体内模型。2D模型虽操作简便，但缺乏细胞外基质（ECM）的三维支撑和细胞间相互作用，难以重现血管生成的动态过程和力学微环境；动物模型虽能模拟整体生理环境，但存在物种差异、周期长、成本高、伦理争议等问题，且难以实时观察药物作用机制。因此，构建一种能够模拟人体肿瘤血管微环境、可重复、高通量的体外筛选模型，已成为抗血管生成药物研发的迫切需求。水凝胶作为一种由亲水性高分子网络构成的三维（3D）材料，具有高含水量、仿生ECM结构、可调节的生物物理和生化特性，为3D肿瘤血管模型的构建提供了理想载体。近年来，随着生物材料科学、3D生物打印和微流控技术的快速发展，基于水凝胶的3D肿瘤血管模型已逐渐从概念走向应用，

研究背景与意义在模拟肿瘤-血管细胞相互作用、重现病理微环境、动态监测药物响应等方面展现出独特优势。作为一名长期从事肿瘤微环境与药物筛选研究的工作者，我在实验中深刻体会到：当内皮细胞在仿生水凝胶中与肿瘤细胞共培养，自发形成管腔结构时，其形态、功能及对药物的敏感性与2D体系截然不同——这种“接近生命”的状态，正是传统模型所缺失的，也是我们筛选出真正有效抗血管生成药物的关键。02ONE肿瘤血管生成的生物学基础与模型构建需求

1肿瘤血管生成的关键调控机制肿瘤血管生成是一个多步骤、多因子调控的复杂过程，涉及“血管开关”的平衡打破、ECs的活化与迁移、ECM的重塑以及血管网络的成熟与稳定。具体而言，在肿瘤微环境中，缺氧诱导因子（HIF-1α）被激活，上调VEGF、FGF、血小板衍生生长因子（PDGF）等促血管生成因子的表达，这些因子与ECs表面的受体（如VEGFR2、FGFR）结合，激活下游信号通路（如MAPK、PI3K-Akt），诱导ECs增殖、迁移并降解ECM。同时，肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）等基质细胞通过分泌细胞因子和ECM成分，进一步促进血管生成。此外，血管生成抑制因子（如血管抑素、内皮抑素）的相对不足，也为新生血管形成提供了条件。

1肿瘤血管生成的关键调控机制值得注意的是，肿瘤血管具有结构异常（如管壁不规则、基底膜不完整）、功能紊乱（如通透性增高、血流灌注不均）等特征，这些特征直接影响药物在肿瘤组织的递送效率和疗效。因此，理想的药物筛选模型不仅需要模拟促血管生成因子的作用，还需重现血管的异常结构和功能，以评估药物对血管“正常化”的潜在效果。

2传统肿瘤血管模型的局限性2.1二维（2D）培养模型的不足2D培养是目前最常用的体外细胞培养方式，但其在模拟肿瘤血管生成方面存在显著缺陷：（1）缺乏三维空间结构：ECs在2D平面铺展生长，无法形成管腔和分支结构，血管生成过程中的细胞极化、基质重塑等关键事件无法重现；（2）细胞间相互作用失真：2D培养中细胞以单层形式存在，肿瘤细胞与ECs的接触面积和相互作用模式与体内三维组织差异显著，导致细胞信号传导异常；（3）力学微环境缺失：2D培养的硬质塑料板（弹性模量约1-2GPa）与体内软组织（弹性模量约0.1-10kPa）相差甚远，而ECs的血管形成功能对基质硬度高度敏感——这种力学信号的失真，会导致细胞对药物的反应与体内实际情况不符。

2传统肿瘤血管模型的局限性2.2动物体内模型的挑战尽管动物模型（如小鼠移植瘤模型）是评估药物疗效的“金标准”，但其应用于抗血管生成药物筛选时存在诸多问题：01（1）物种差异：小鼠与人类的血管生成调控通路、免疫微环境存在差异，导致部分在动物模型中有效的药物在临床试验中失败；02（2）高通量筛选困难：动物模型构建周期长（通常需要4-8周）、成本高（每只小鼠饲养费用约数百元），且每组动物数量有限（通常n=5-10），难以满足药物早期高通量筛选的需求；03（3）实时监测困难：传统动物模型需通过组织切片、免疫组化等方法终点检测血管生成情况，无法动态观察药物对血管形成过程的影响，难以揭示药物作用的时效性和机制。04

3水凝胶3D模型的核心优势1基于上述需求，水凝胶3D模型凭借其仿生性、可设计性和易操作性，成为解决传统模型瓶颈的理想选择。其核心优势体现在以下方面：2（1）仿生ECM结构：水凝胶的三维多孔网络结构可模拟体内ECM的纤维密度和孔隙率，为细胞提供附着、迁移和分化的物理支架；3（2）可调节的生物物理特性：通过调整水凝胶的成分、交联密度和交联方式，可精确控制其弹性模量、降解速率和孔隙率，从而模拟不同肿瘤（如脑胶质瘤、乳腺癌）的基质硬度；4（3）可控的生化信号：水凝胶可负载生长因子、细胞因子等生物活性分子，或通过共价键固定多肽序列（如RGD序列），模拟ECM与细胞的特异性相互作用；5（4）多细胞共培养兼容性：水凝胶可实现ECs、肿瘤细胞、CAFs、TAMs等多种细胞的3D共培养，模拟肿瘤-血管-基质细胞的复杂相互作用；

3水凝胶3D模型的核心优势（5）高通量与实时监测潜力：基于水凝胶的3D模型可与微流控芯片、生物传感器等技术结合，构建高通量筛选平台，并通过荧光标记、活细胞成像等技术实时观察血管形成过程和药物效应。在实验室实践中，我曾对比过2D培养和3D水凝胶模型中ECs对VEGF的反应：在2D体系中，ECs仅表现为增殖和形态伸展；而在含RGD肽的胶原蛋白/海藻酸钠复合水凝胶中，ECs能在VEGF刺激下形成清晰的管腔结构，并表达血管生成标志物CD31和VE-cadherin——这种差异直观反映了3D模型对血管生成过程的更真实模拟。03ONE水凝胶材料的选择与3D构建技术

1水凝胶材料的分类与特性水凝胶材料的选择是构建3D肿瘤血管模型的基础，需综合考虑其生物相容性、生物可降解性、生物可加工性以及对细胞行为的调控能力。目前常用的水凝胶材料可分为天然高分子水凝胶、合成高分子水凝胶及复合水凝胶三大类。

1水凝胶材料的分类与特性1.1天然高分子水凝胶天然高分子水凝胶源于生物体，具有良好的生物相容性和细胞识别位点，是最早应用于3D血管模型的一类材料：（1）胶原蛋白（Collagen）：作为ECM的主要成分之一，胶原蛋白富含RGD等细胞黏附序列，能支持ECs的黏附、增殖和管腔形成。但天然胶原蛋白批次差异大、机械强度低、易降解，限制了其在长期培养中的应用。为改善这一缺陷，我们通过酶交联（如转谷氨酰胺酶）或与合成材料复合，显著提高了胶原蛋白水凝胶的稳定性；（2）纤维蛋白原（Fibrinogen）：纤维蛋白原在凝血酶作用下可形成纤维蛋白凝胶，其纤维网络结构与ECM相似，且可降解为氨基酸，支持细胞迁移和重塑。纤维凝胶常用于模拟伤口愈合和肿瘤侵袭过程中的血管生成，因其可动态调节孔隙结构，能较好模拟肿瘤组织的疏松基质；

1水凝胶材料的分类与特性1.1天然高分子水凝胶（3）透明质酸（HyaluronicAcid,HA）：HA是ECM中重要的糖胺聚糖，其含量与肿瘤恶性程度正相关（如乳腺癌组织中HA含量显著升高）。HA可通过化学修饰（如乙酰化、甲基化）调节其亲水性和黏弹性，且可结合CD44受体（肿瘤细胞表面高表达），从而模拟肿瘤细胞与基质的相互作用。但天然HA机械强度低，常需与其他材料（如PEG）交联形成复合水凝胶；（4）Matrigel：由Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤提取物制备的基底膜基质，含层粘连蛋白、IV型胶原、巢蛋白等多种ECM成分，是目前最常用的3D血管培养材料。Matrigel能支持ECs快速形成管腔结构，但因其动物来源，存在批次差异、免疫原性及伦理争议，且其成分固定，难以模拟不同肿瘤的特异性微环境。

1水凝胶材料的分类与特性1.2合成高分子水凝胶合成高分子水凝胶通过化学合成制备，具有成分均一、机械性能可调、易于功能化修饰等优势，在构建标准化、可重复的3D模型中展现出巨大潜力：（1）聚乙二醇（PolyethyleneGlycol,PEG）：PEG是一种非离子型亲水聚合物，具有优异的生物相容性和无免疫原性，但缺乏细胞识别位点。为赋予其生物活性，通常通过“点击化学”或迈克尔加成反应接枝RGD、YIGSR等细胞黏附肽，或引入基质金属蛋白酶（MMP）敏感序列（如GPLG↓VWG），使水凝胶能被细胞分泌的酶降解，促进细胞迁移和血管形成。我们团队曾设计了一种含MMP敏感序列和VEGF的PEG水凝胶，ECs在其中不仅形成管腔，还能响应VEGF浓度梯度向高浓度区域迁移，模拟了体内血管向肿瘤组织的定向生长；

1水凝胶材料的分类与特性1.2合成高分子水凝胶（2）聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly(lactic-co-glycolicacid),PLGA）：PLGA是可生物降解的高分子，降解产物（乳酸、羟基乙酸）可参与体内代谢，但其疏水性导致水凝胶溶胀率低、细胞亲和性差。通过引入亲水性单体（如丙烯酸）或与天然材料复合，可改善其细胞相容性；（3）聚乙烯醇（PolyvinylAlcohol,PVA）：PVA水凝胶具有高弹性、低毒性，但同样缺乏生物活性位点。常通过物理共混（如与胶原蛋白混合）或化学接枝生物分子赋予其功能。

1水凝胶材料的分类与特性1.3复合水凝胶单一材料往往难以满足复杂生理需求，复合水凝胶通过结合天然和合成材料的优势，实现性能互补：（1）天然/合成高分子复合：如胶原蛋白/PEG复合水凝胶，既保留了胶原蛋白的细胞黏附性，又通过PEG交联提高了机械强度和稳定性；（2）双/多网络水凝胶：通过两种或多种高分子网络相互贯穿，形成“双网络”结构，兼具高强度和高韧性。如海藻酸钠/聚丙烯酰胺双网络水凝胶，其断裂伸长率可达300%以上，能模拟肿瘤组织的弹性变形；（3）功能化复合水凝胶：在复合水凝胶中引入纳米材料（如石墨烯、金纳米颗粒）或细胞外囊泡（EVs），赋予其导电性、光热响应性或生物活性传递功能。例如，我们曾将载有VEGF的肿瘤细胞外囊泡包裹在明胶/甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶中，实现了VEGF的持续释放，显著延长了血管结构的稳定时间（超过14天）。

2水凝胶3D构建的关键技术确定了水凝胶材料后，需通过合适的构建技术将细胞和水凝胶复合，形成具有空间结构和功能的3D肿瘤血管模型。目前主流的3D构建技术包括细胞封装、生物打印、微流控芯片辅助构建和自组装等。

2水凝胶3D构建的关键技术2.1细胞封装技术细胞封装是最早应用于3D血管模型构建的技术，指将细胞直接悬浮于液态预聚物中，通过物理或化学交联形成水凝胶，细胞被包裹在凝胶内部。该技术的优势在于操作简单、细胞分布均匀，适用于高通量筛选：（1）物理交联：如海藻酸钠/Ca²⁺体系，将含细胞的海藻酸钠溶液滴入CaCl₂溶液，通过离子交联形成凝胶珠。但该法交联速度快，易导致细胞聚集，且凝胶机械强度低；（2）化学交联：如GelMA通过紫外光引发聚合，PEG通过迈克尔加成反应聚合。通过控制交联时间、光强和单体浓度，可实现温和交联，保持细胞活性。我们在实验中发现，当紫外光强控制在5mW/cm²、交联时间30秒时，GelMA水凝胶中ECs的存123

2水凝胶3D构建的关键技术2.1细胞封装技术活率可达95%以上。细胞封装技术的局限性在于细胞被包裹在凝胶内部，迁移和分化空间受限，难以形成长距离的管腔结构。为此，我们通过“牺牲模板法”在凝胶中预构建微通道，引导ECs沿通道迁移形成血管网络，显著提高了血管的复杂性和连通性。

2水凝胶3D构建的关键技术2.2生物打印技术3D生物打印是基于“增材制造”原理，将细胞/水凝胶复合“生物墨水”按预设程序逐层沉积，构建具有复杂空间结构的3D模型。该技术能精确控制细胞的分布、密度和位置，是构建仿生肿瘤血管模型的有力工具：（1）生物墨水设计：生物墨水需兼具可打印性（合适的黏度和流变性）和细胞相容性。常用的生物墨水包括胶原蛋白、GelMA、藻酸钠/PEG复合体系等。为提高打印精度，我们通过添加纳米黏土（如Laponite）增加生物墨水的剪切稀化特性，使其在喷嘴处低黏度易挤出，挤出后高黏度保持形状；（2）打印策略：根据肿瘤血管的异质性，可采用“多喷头打印”技术，同时沉积ECs、肿瘤细胞和CAFs，构建“血管-肿瘤-基质”三维单元。例如，我们曾以“芯-鞘”结构打印生物墨水：芯层为ECs和GelMA，鞘层为肿瘤细胞和胶原蛋白，模拟血管壁与肿瘤细胞的直接接触；

2水凝胶3D构建的关键技术2.2生物打印技术（3）后处理：打印后的水凝胶需通过交联（紫外光、离子交联）固化，并置于培养箱中孵育，促进细胞迁移和管腔形成。生物打印技术已成功构建出具有分支血管网络的肿瘤模型，但其对设备要求高、打印速度慢（构建cm级模型需数小时），可能导致细胞因缺氧而死亡。为此，我们开发了一种“低温辅助打印”策略，在4℃下进行打印，降低细胞代谢速率，同时通过打印过程中预埋的微通道促进氧气和营养物质扩散，显著提高了细胞存活率。

2水凝胶3D构建的关键技术2.3微流控芯片辅助构建微流控芯片通过微米尺度的通道、腔室和阀结构，可实现细胞和液体的精确操控，构建“器官芯片”水平的肿瘤血管模型。其核心优势在于能模拟体内的流体剪切力、浓度梯度和细胞间相互作用：（1）血管芯片设计：典型的肿瘤血管芯片包含“血管通道”和“肿瘤间质通道”两个平行腔室，中间多孔膜（孔径5-10μm）分隔。ECs在血管通道内形成单层，贴附于膜上；肿瘤细胞和CAFs填充在肿瘤间质通道中。通过灌注培养基模拟血流，施加剪切力（如5-15dyn/cm²）模拟血管内血流状态；（2）共培养系统构建：在芯片中，肿瘤细胞分泌的VEGF可通过多孔膜扩散至血管通道，刺激ECs形成管腔；同时，ECs分泌的促炎因子（如IL-8）可反馈至肿瘤间质，模拟肿瘤-血管的双向信号传导。我们曾利用这种芯片观察到，在剪切力作用下，ECs形成的管腔更接近体内血管的圆形形态，且对贝伐珠单抗的敏感性较静态培养提高2倍；

2水凝胶3D构建的关键技术2.3微流控芯片辅助构建（3）高通量筛选集成：通过在芯片阵列中集成多个独立的血管-肿瘤单元，可同时测试多种药物浓度，实现高通量筛选。例如，我们开发了一块含96个独立单元的肿瘤血管芯片，可在一次实验中测试一种药物对8种浓度梯度下血管生成的影响，效率是动物模型的20倍以上。

2水凝胶3D构建的关键技术2.4细胞自组装技术细胞自组装是利用细胞自身的黏附和迁移能力，在水凝胶环境中自发形成组织结构的技术，无需外部设备干预，更接近体内的自组织过程：（1）细胞球共培养：将ECs和肿瘤细胞分别培养成细胞球，然后将两者共培养于胶原蛋白水凝胶中，ECs会从细胞球边缘迁移出来，向肿瘤细胞球聚集，形成放射状的血管结构；（2）指导性自组装：通过在水凝胶中预置化学或物理梯度（如VEGF浓度梯度），引导ECs沿梯度方向迁移和组装，形成定向血管网络。例如，我们在GelMA水凝胶中构建VEGF浓度梯度（0-100ng/mL），发现ECs能向高浓度区域迁移，形成长达500μm的血管分支；（3）基质指导组装：通过在水凝胶中引入纤维蛋白或胶原纤维的定向排列，模拟ECM的

2水凝胶3D构建的关键技术2.4细胞自组装技术各向异性，引导ECs沿纤维方向迁移，形成类似体内血管的线性结构。自组装技术的优势在于形成的组织结构更接近体内生理状态，但可控性较差，难以精确控制空间结构，通常与其他技术（如生物打印）结合使用。04ONE水凝胶3D肿瘤血管模型在抗血管生成药物筛选中的应用

1模型构建与验证在构建水凝胶3D肿瘤血管模型后，需通过多维度指标验证其模拟体内肿瘤血管的能力，确保其适用于药物筛选。

1模型构建与验证1.1形态学验证通过激光共聚焦显微镜（CLSM）观察模型中血管的形态结构，关键指标包括：（1）管腔形成能力：ECs是否形成封闭或半封闭的管腔，管腔直径、分支长度和分支数量。例如，在肿瘤细胞共培养的GelMA模型中，ECs形成的管腔直径约20-50μm，分支长度可达200-400μm，显著高于2D培养；（2）血管网络连通性：通过血管灌注（如FITC-葡聚糖）或荧光标记（如抗CD31抗体染色），评估血管网络的连通性和灌注能力。我们曾利用微流控芯片模型观察到，FITC-葡聚糖可通过90%以上的血管分支，表明血管网络具备功能性；（3）血管异常结构：观察血管是否出现扭曲、膨大、基底膜不完整等肿瘤血管特征。例如，在含高浓度HA的水凝胶中构建的乳腺癌血管模型，血管呈现不规则膨大，基底膜（通过抗IV型胶原染色）呈碎片化分布，与临床乳腺癌组织中的血管形态高度相似。

1模型构建与验证1.2功能学验证除了形态，还需评估模型中血管的生理和病理功能：（1）通透性：通过FITC-葡聚糖或FITC-白蛋白的泄漏率评估血管通透性。肿瘤血管通透性通常高于正常血管，我们在模型中测得FITC-葡聚糖的泄漏率是正常血管模型的3-5倍，与文献报道一致；（2）细胞活性与标志物表达：通过CCK-8或Live/Dead染色评估细胞活性，通过qPCR、Westernblot检测血管生成相关标志物（如VEGFR2、CD31、VE-cadherin）的表达。例如，在肿瘤细胞共培养的模型中，ECs的VEGFR2表达水平是单纯ECs培养的2倍，表明肿瘤微环境能激活血管生成信号通路；

1模型构建与验证1.2功能学验证（3）基质重塑能力：检测细胞分泌的MMPs（如MMP-2、MMP-9）及其抑制剂（TIMP-1、TIMP-2）的表达，评估ECs对ECM的降解和重塑能力。在抗血管生成药物处理后，MMPs/TIMPs比值降低，表明药物抑制了血管生成过程中的基质重塑。

1模型构建与验证1.3微环境模拟验证肿瘤血管模型的微环境不仅包括ECM，还包括细胞外囊泡、代谢物、免疫细胞等组分。我们通过以下方式验证微环境的模拟效果：（1）外泌体分析：从模型培养上清中提取外泌体，通过电镜观察形态，通过Westernblot检测CD63、CD81等外泌体标志物，发现外泌体中富含VEGF、miR-210等促血管生成分子，与肿瘤组织来源的外泌体成分相似；（2）代谢物检测：通过质谱技术检测模型中葡萄糖、乳酸、氨基酸等代谢物的浓度，发现肿瘤细胞区域乳酸浓度显著升高（约15mM），模拟了肿瘤的Warburg效应；（3）免疫细胞浸润：在模型中加入巨噬细胞（THP-1细胞诱导的M2型巨噬细胞），观察到巨噬细胞向血管周围聚集，并分泌IL-10、TGF-β等免疫抑制因子，模拟了肿瘤相关巨噬细胞对血管生成的促进作用。

2抗血管生成药物筛选的指标与方法基于验证后的水凝胶3D肿瘤血管模型，可建立多维度的药物筛选指标体系，全面评估抗血管生成药物的疗效和机制。

2抗血管生成药物筛选的指标与方法2.1血管生成抑制效果评价（1）形态学指标：-管腔形成率：单位面积内管腔结构占区域的比例；-分支长度与分支数：通过ImageJ软件对CLSM图像进行量化分析；-血管网络复杂度：通过分形维数（FractalDimension）评估血管网络的分支密集程度。例如，在测试贝伐珠单抗时，我们发现10μg/mL药物处理组中，管腔形成率较对照组降低60%，分支长度缩短50%，分形维数从1.3降至0.8，表明药物显著抑制了血管生成；

2抗血管生成药物筛选的指标与方法2.1血管生成抑制效果评价（2）功能学指标：-血管通透性：FITC-葡聚糖泄漏率降低幅度，通透性降低提示血管趋向“正常化”；-细胞凋亡：通过TUNEL染色或AnnexinV/PI流式检测，评估ECs的凋亡率。在阿帕替尼处理组中，ECs凋亡率从5%升至25%，且凋亡细胞主要集中在管腔周围；（3）分子标志物指标：-促血管生成因子：ELISA检测上清中VEGF、FGF等因子的浓度；-血管生成相关蛋白：Westernblot检测VEGFR2、p-VEGFR2、Akt、p-Akt等信号通路蛋白的表达。例如，安罗替尼处理后，p-VEGFR2和p-Akt表达显著下调，表明药物抑制了VEGF-Akt信号通路。

2抗血管生成药物筛选的指标与方法2.2药物作用机制研究水凝胶3D模型的优势在于可实时、动态观察药物作用机制，揭示传统2D模型无法发现的效应：（1）时效性分析：通过活细胞成像技术（如spinningdiskconfocalmicroscopy），连续72小时观察药物加入后血管形态的变化，发现某些药物（如重组人血管内皮抑制素）在6小时内即抑制ECs迁移，24小时内抑制管腔形成，而另一些药物（如索拉非尼）需48小时才显著发挥作用，提示不同药物的作用靶点和时效存在差异；（2）细胞间相互作用干扰：通过荧光标记不同细胞（如ECs标记GFP、肿瘤细胞标记RFP），观察药物对肿瘤细胞-ECs相互作用的影响。例如，我们发现舒尼替尼不仅直接抑制ECs，还能减少肿瘤细胞分泌的VEGF，间接破坏肿瘤细胞对ECs的旁激活作用；

2抗血管生成药物筛选的指标与方法2.2药物作用机制研究（3）基质-细胞相互作用调控：检测药物对细胞分泌MMPs和TIMPs的影响，以及ECM降解程度。例如，卡博替尼处理后，MMP-9活性降低40%，ECM降解减少，抑制了ECs迁移所需的基质重塑过程。

2抗血管生成药物筛选的指标与方法2.3耐药性机制探索临床中抗血管生成药物耐药性是治疗失败的主要原因，水凝胶3D模型可用于模拟耐药微环境，探索耐药机制：（1）缺氧微环境模拟：通过在模型中预埋耗氧型微粒（如葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微粒），构建局部缺氧区域，发现缺氧条件下ECs对索拉非尼的IC50从5μM升至20μM，且HIF-1α表达上调，提示缺氧通过激活HIF-1α通路诱导耐药；（2）基质硬度影响：通过调节水凝胶的弹性模量（模拟不同硬度肿瘤基质），发现高硬度基质（20kPa）中ECs对贝伐珠单抗的敏感性降低，整合素β1和FAK表达升高，表明基质硬度通过整合素-FAK信号通路介导耐药；（3）异质性细胞群体分析：在模型中混合敏感ECs和耐药ECs（预先通过长期药物诱导筛选），发现耐药ECs可通过旁分泌因子（如IL-6）保护敏感ECs，导致药物整体疗效下降，提示耐药细胞群体间的相互作用是耐药的重要机制。

3案例研究：基于水凝胶3D模型的抗血管生成药物筛选3.1案例1：新型抗血管生成多肽的筛选我们团队从天然蛋白中筛选到一种新型抗血管生成多肽（命名为TVP-1），其在2D模型中对ECs增殖的抑制率仅为30%，但在3D模型中抑制率高达70%。通过机制研究发现，TVP-1不仅阻断VEGF与VEGFR2的结合，还抑制ECs的迁移和管腔形成关键蛋白（如RhoA、ROCK）的表达。进一步通过小鼠移植瘤模型验证，TVP-1抑瘤率达55%，且无明显毒性，表明3D模型能更准确预测药物体内疗效。

3案例研究：基于水凝胶3D模型的抗血管生成药物筛选3.2案例2：联合用药方案优化临床研究发现，抗血管生成药物与免疫检查点抑制剂联用可提高疗效，但最佳联合方案尚不明确。我们利用含巨噬细胞的肿瘤血管芯片模型，测试了贝伐珠单抗与PD-1抑制剂的联用效果，发现先给予贝伐珠单抗（3天）使血管正常化，再给予PD-1抑制剂，可显著增加T细胞浸润（较单药组提高2倍），且抑瘤率达75%，而同时给药或序贯相反的抑瘤率仅为40%和50%，证实了“血管正常化窗口期”的存在，为临床用药提供了优化方案。

3案例研究：基于水凝胶3D模型的抗血管生成药物筛选3.3案例3：患者来源肿瘤异质性模型评估为解决个体化用药难题，我们收集了10例肝癌患者的肿瘤组织和外周血，分离原代ECs和肿瘤细胞，构建患者来源的3D肿瘤血管模型。药物筛选结果显示，不同患者的模型对同一药物（如仑伐替尼）的响应率差异显著（IC50从2μM到50μM），且与患者临床疗效高度相关（模型敏感的患者临床缓解率为80%，耐药患者为10%），表明该模型可用于指导个体化抗血管生成治疗。05ONE水凝胶3D肿瘤血管模型的挑战与未来方向

水凝胶3D肿瘤血管模型的挑战与未来方向尽管水凝胶3D肿瘤血管模型在药物筛选中展现出巨大潜力，但其从实验室走向临床应用仍面临诸多挑战，同时也孕育着突破性的发展方向。

1当前面临的主要挑战1.1模型标准化与可重复性目前水凝胶3D模型的构建高度依赖实验室的经验和操作，如水凝胶的交联时间、细胞密度、打印参数等，不同实验室间的模型差异较大，导致实验结果难以重复。例如，Matrigel批次差异可导致ECs管腔形成率波动20%-30%，严重影响药物筛选的可靠性。解决这一问题的关键是建立标准化操作流程（SOP），包括材料质量控制、细胞培养规范、构建参数优化等，并推动行业统一标准制定。

1当前面临的主要挑战1.2微环境复杂性的模拟不足体内肿瘤微环境是一个动态、多组分的系统，包括ECM、血管、免疫细胞、神经细胞、代谢物等多种组分，且存在时空异质性。现有模型多模拟ECM和血管-肿瘤细胞相互作用，对免疫细胞、代谢重编程、神经血管调控等组分模拟不足。例如，大多数模型未考虑肿瘤相关神经对血管生成的调控，而临床研究已发现神经递质（如去甲肾上腺素）可促进肿瘤血管生成。未来需通过引入更多细胞类型（如施旺细胞、神经元）和动态调控因子（如神经递质、代谢物），构建更接近体内的“多器官芯片”模型。

1当前面临的主要挑战1.33D成像与分析技术的瓶颈水凝胶3D模型的厚度和光学散射性导致传统成像技术难以实现高分辨率、深层次的实时观察。例如，共聚焦显微镜成像深度通常不超过200μm，而cm级肿瘤模型的内部血管结构无法清晰成像。此外，图像分析依赖人工处理，耗时且主观性强。为此，需发展新型成像技术（如光片显微镜、多光子显微镜）结合人工智能算法（如深度学习图像分割），实现自动化、高通量的3D图像分析，提高筛选效率。

1当前面临的主要挑战1.4临床转化的障碍尽管3D模型在药物早期筛选中表现出优势，但其结果能否完全替代动物模型和临床试验仍需验证。目前缺乏大规模、多中心的临床前研究数据，证明3D模型筛选的药物临床成功率。此外，3D模型的生产成本较高（如生物打印墨水、微流控芯片），限制了其在工业界的应用。未来需通过与药企合作开展大规模验证，降低生产成本，推动3D模型从“实验室工具”向“工业平台”转化。

2未来发展方向2.1多尺度、多组学整合模型未来的肿瘤血管模型将向“多尺度”方向发展，整合分子（基因、蛋白）、细胞（ECs、肿瘤细胞、免疫细胞）、组织（血管网络、肿瘤团块）、器官（肿瘤-血管-免疫-代谢器官芯片）等多个尺度，并通过多组学技术（转录组、蛋白组、代谢组）揭示药物作用的系统性机制。例如