强心苷类药物对结肠癌细胞的抑制效应及体外分子机制解析

强心苷类药物对结肠癌细胞的抑制效应及体外分子机制解析一、引言1.1研究背景结肠癌作为常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率与死亡率在全球范围内均呈逐年上升趋势，已然成为世界各国亟需解决的公共卫生问题之一。据世界流行病学调查显示，结肠癌在北美、西欧、澳大利亚、新西兰等地的发病率位居内脏肿瘤前两位，即便在发病率相对较低的亚、非、拉美等地，随着人民生活水平的提高和饮食结构的改变，其发病数也在持续攀升。我国的情况同样不容乐观，尽管结肠癌发病率与死亡率低于胃癌、食管癌、肺癌等常见恶性肿瘤，但近年来也呈现出明显的上升态势。相关数据表明，结肠癌患者的预后情况与确诊时的疾病分期密切相关。如Ⅰ期结肠癌患者，经过手术治疗后，5年存活率可达90%-95%，这是因为此期肿瘤侵犯较浅，仅局限于黏膜和黏膜下层，且无淋巴结及远处转移；Ⅱ期结肠癌患者治愈率在60%-80%，此时肿瘤侵犯已较深，侵及肌层或浆膜层，甚至突破浆膜，但仍无淋巴结及远处转移；Ⅲ期结肠癌患者除手术治疗外，还需配合化疗等辅助治疗，治愈率在40%-60%左右，该阶段肿瘤已经出现了淋巴结转移；而Ⅳ期结肠癌患者的5年存活率在40%以下，通常只有百分之十几，此时肿瘤已转移至肝、肺等器官，治疗难度极大。目前，针对结肠癌的治疗方法主要包括手术切除、放化疗、免疫治疗等。手术切除是结肠癌的主要治疗手段之一，对于早期结肠癌患者，手术切除有可能实现根治，但手术治疗存在严格的适应症以及局限性，限制了它在大多数癌症治疗中的运用，而且手术治疗只能针对看得见的癌症细胞，对隐匿性的癌细胞无能为力。化学治疗能够对全身的癌细胞进行杀伤，在初期能迅速控制癌细胞的扩散，然而其耐药性问题突出，对人体免疫系统的巨大损伤和较大的副作用，近年来一直备受争议。放射疗法对局部肿瘤细胞的杀伤迅速而彻底，但由于定位较难，以及巨大的副作用使其在临床治疗上受到严重局限。免疫治疗虽然为结肠癌治疗带来了新的希望，但也面临着响应率低、价格昂贵等问题。此外，这些传统治疗方法还普遍存在易复发和耐药性的问题，尤其是晚期结肠癌患者，疗效很难得到保证，患者的生活质量和生存周期受到极大影响。因此，寻找新的治疗手段，提高结肠癌的治疗效果，改善患者预后，成为了医学领域亟待解决的关键问题。随着医学研究的不断深入，人们逐渐发现人类的心血管系统和肿瘤生长之间存在一定的关联。在对心血管疾病药物的研究过程中，意外发现部分药物具有潜在的抗肿瘤作用，这为肿瘤治疗开辟了新的研究方向。强心苷类药物作为治疗心血管疾病的经典药物，已在心脏衰竭、心律失常等病症的治疗中得到广泛应用，其主要作用机制是通过激活Na⁺/K⁺-ATP酶来增强心肌收缩力和心排血量，从而达到强化心力的作用。近年来，越来越多的研究表明，强心苷类药物不仅对心血管系统疾病有效，在抗肿瘤领域也展现出一定的潜力。已有研究证实，波形酮和去氧地酸等强心苷类药物对人类前列腺癌、乳腺癌和肝癌细胞均具有抑制作用。在前期的高通量筛选中，也发现一些强心苷类药物能够特异性地杀死人结肠癌细胞。然而，目前关于强心苷类药物在抗肿瘤方面的作用研究仍处于初步阶段，其具体的抗肿瘤作用机制尚未完全明确，尤其是在结肠癌治疗中的应用及作用机制，有待进一步深入探究。深入研究强心苷类药物对结肠癌细胞的抑制作用及体外机制，不仅有助于拓展其在抗肿瘤领域的应用，为临床治疗结肠癌提供新的思路和方法，还可能揭示其潜在的药用价值，为开发新型抗癌药物奠定基础。1.2研究目的与意义本研究旨在深入探究强心苷类药物对结肠癌细胞的抑制作用及其体外作用机制。通过一系列实验，观察强心苷类药物对结肠癌细胞增殖、凋亡、细胞周期等生物学行为的影响，明确其是否能有效抑制结肠癌细胞的生长，并分析其作用的具体分子机制。同时，与传统结肠癌治疗药物进行对比，评估强心苷类药物在结肠癌治疗中的潜在优势和应用前景，为其进一步的临床研究和应用提供坚实的理论基础和实验依据。结肠癌作为严重威胁人类健康的重大疾病，现有的治疗手段存在诸多局限性，迫切需要寻找新的治疗方法和药物。强心苷类药物作为一类具有独特作用机制的化合物，在抗肿瘤领域展现出的潜力为结肠癌治疗带来了新的希望。深入研究其对结肠癌细胞的抑制作用及体外机制，一方面有助于揭示强心苷类药物的抗肿瘤作用本质，拓展其在医学领域的应用范围，为开发新型抗癌药物提供新的思路和方向；另一方面，有望为临床治疗结肠癌提供新的治疗策略和药物选择，提高结肠癌患者的治疗效果和生存质量，对改善患者的预后具有重要的现实意义。此外，本研究还有助于加深对心血管系统药物与肿瘤细胞相互作用关系的理解，促进不同医学领域之间的交叉融合，为探索更多具有潜在抗肿瘤活性的心血管药物奠定基础，推动肿瘤治疗领域的创新发展。二、结肠癌与强心苷类药物概述2.1结肠癌的特征与治疗困境2.1.1结肠癌的发病机制与流行病学特征结肠癌作为消化系统常见的恶性肿瘤，其发病机制是一个涉及多因素、多步骤的复杂过程。目前研究表明，结肠癌的发生与生活方式、遗传、环境等多种因素密切相关。在生活方式方面，不合理的饮食习惯被认为是结肠癌发病的重要危险因素之一。长期摄入高脂肪、高蛋白、低纤维素的食物，会导致肠道内胆汁酸和胆固醇的代谢产物增多，这些物质可能对肠道黏膜产生刺激和损伤，进而增加结肠癌的发病风险。缺乏运动也与结肠癌的发生有关，长期久坐不动会使肠道蠕动减慢，有害物质在肠道内停留时间延长，增加了肠道黏膜与致癌物质的接触机会。吸烟、过量饮酒等不良生活习惯，也会对肠道微环境产生不良影响，可能通过影响肠道菌群的平衡、促进炎症反应等机制，参与结肠癌的发病过程。遗传因素在结肠癌的发生中也起着关键作用。约10%-30%的结肠癌患者具有遗传背景，其中一些遗传性综合征与结肠癌的发病风险显著增加相关。例如，家族性腺瘤性息肉病（FAP）是一种常染色体显性遗传病，由APC基因的胚系突变引起，患者的结肠和直肠内会出现大量腺瘤性息肉，如果不及时治疗，几乎100%会发展为结肠癌。遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC），也称为林奇综合征，是由于DNA错配修复基因（如MLH1、MSH2、MSH6等）的胚系突变导致，患者发生结肠癌的风险比普通人群高8-12倍。此外，一些其他基因的突变或多态性，如KRAS、BRAF、P53等，也可能影响结肠癌的发病风险，这些基因参与细胞的增殖、凋亡、DNA修复等重要生物学过程，其异常改变可能导致细胞的恶性转化。环境因素同样对结肠癌的发病有着重要影响。工业化进程的加快导致环境污染日益严重，一些环境污染物，如化学物质、重金属、农药等，可能通过饮食、饮水或空气进入人体，对肠道细胞产生毒性作用，引发基因突变或细胞损伤，从而增加结肠癌的发病几率。长期暴露于某些职业环境中，如从事石棉、皮革、橡胶等行业的工作，也与结肠癌的发病风险升高有关。此外，肠道微生物群的失衡被认为是结肠癌发生的重要环境因素之一。肠道微生物群在维持肠道黏膜屏障功能、调节免疫反应、参与营养物质代谢等方面发挥着重要作用，当肠道微生物群的组成和功能发生改变时，可能导致肠道微生态失调，引发炎症反应，促进结肠癌的发生发展。从流行病学数据来看，结肠癌在全球范围内的发病率呈现出明显的地域差异。据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球癌症统计数据显示，结肠癌在全球范围内的新发病例数约为193万，死亡病例数约为93万，分别位居所有恶性肿瘤的第三位和第二位。在北美、西欧、澳大利亚、新西兰等发达国家和地区，结肠癌的发病率较高，位居内脏肿瘤前两位。例如，美国的结肠癌发病率在男性中约为44.7/10万，女性中约为38.5/10万。而在亚、非、拉美等发展中国家和地区，结肠癌的发病率相对较低，但近年来随着经济的发展、生活方式的西化以及人口老龄化的加剧，其发病率也在持续上升。在我国，结肠癌的发病率同样呈现出上升趋势，尤其是在一些经济发达的城市和地区。根据中国癌症中心发布的数据，2020年我国结肠癌的新发病例数约为42.8万，死亡病例数约为20.1万，分别位居所有恶性肿瘤的第五位和第四位。此外，结肠癌的发病还呈现出一定的年龄和性别特征。一般来说，结肠癌的发病率随着年龄的增长而逐渐升高，多数患者确诊时年龄在50岁以上。然而，近年来越来越多的研究表明，早发性结肠癌（即50岁以下人群患结肠癌）的发病率在逐渐上升，这一现象引起了广泛关注。在性别方面，男性患结肠癌的风险略高于女性，男女性发病比例约为1.1-1.3:1。但不同地区和人群中，这种性别差异可能会有所不同。例如，在亚洲地区，男性结肠癌的发病率明显高于女性，而在拉丁美洲和非洲地区，男女性发病率差异相对较小。2.1.2现有治疗手段的局限性目前，针对结肠癌的治疗手段主要包括手术切除、化学治疗、放射治疗、靶向治疗以及免疫治疗等。然而，这些治疗方法在临床应用中均存在一定的局限性。手术切除是结肠癌的主要治疗手段之一，对于早期结肠癌患者，手术切除有可能实现根治。但手术治疗存在严格的适应症以及局限性，限制了它在大多数癌症治疗中的运用，而且手术治疗只能针对看得见的癌症细胞，对隐匿性的癌细胞无能为力。对于一些晚期结肠癌患者，由于肿瘤侵犯范围广泛、发生远处转移或患者身体状况较差等原因，可能无法进行手术切除，或者手术切除后复发率较高。此外，手术还可能带来一些并发症，如出血、感染、肠梗阻等，影响患者的术后恢复和生活质量。化学治疗能够对全身的癌细胞进行杀伤，在初期能迅速控制癌细胞的扩散，然而其耐药性问题突出，对人体免疫系统的巨大损伤和较大的副作用，近年来一直备受争议。随着化疗药物的广泛应用，越来越多的结肠癌患者出现了耐药现象，导致化疗效果不佳。耐药机制主要包括肿瘤细胞对化疗药物的摄取减少、外排增加、药物代谢酶活性改变、DNA损伤修复能力增强以及细胞凋亡途径异常等。化疗药物在杀伤癌细胞的同时，也会对正常细胞产生毒性作用，导致患者出现恶心、呕吐、脱发、骨髓抑制、肝肾功能损害等一系列不良反应，严重影响患者的生活质量和治疗依从性。放射疗法对局部肿瘤细胞的杀伤迅速而彻底，但由于定位较难，以及巨大的副作用使其在临床治疗上受到严重局限。放疗主要用于局部晚期结肠癌患者的术前或术后辅助治疗，以及无法手术切除的结肠癌患者的姑息治疗。然而，放疗在治疗过程中可能会对周围正常组织和器官造成损伤，导致放射性肠炎、膀胱炎、直肠炎等并发症的发生。此外，放疗的疗效也受到肿瘤的位置、大小、分期以及患者个体差异等因素的影响，对于一些对放疗不敏感的肿瘤细胞，放疗效果可能不理想。靶向治疗和免疫治疗为结肠癌的治疗带来了新的希望，但也面临着一些挑战。靶向治疗是针对肿瘤细胞表面或内部的特定分子靶点进行治疗，具有特异性强、副作用相对较小的优点。然而，并非所有结肠癌患者都能从靶向治疗中获益，只有那些具有特定靶点突变的患者才适合使用相应的靶向药物。而且，靶向治疗也会出现耐药问题，导致治疗效果逐渐下降。免疫治疗则是通过激活患者自身的免疫系统来对抗肿瘤细胞，在一些晚期结肠癌患者中取得了一定的疗效。然而，免疫治疗的响应率较低，只有部分患者能够从中受益，且免疫治疗可能会引发免疫相关不良反应，如免疫性肺炎、肝炎、肠炎等，严重时可能危及患者生命。此外，靶向治疗和免疫治疗的药物价格昂贵，给患者和社会带来了沉重的经济负担。综上所述，现有的结肠癌治疗手段虽然在一定程度上能够缓解患者的症状、延长患者的生存期，但都存在各自的局限性。因此，寻找新的治疗方法和药物，提高结肠癌的治疗效果，改善患者预后，是当前医学领域亟待解决的重要问题。2.2强心苷类药物的研究进展2.2.1强心苷类药物的结构与作用机制（心血管方面）强心苷类药物是一类从植物中提取的含甾体苷元的苷类化合物，其化学结构由糖苷基和配糖基两部分组成。在强心苷类分子中，环A-B和C-D之间为顺式稠合，而环B-C之间为反式稠合，这种独特的稠合方式决定其分子形状呈U型。分子中位于C-10和C-13的C-18和C-19两个角甲基与3位羟基均为β构型，而14位的β-羟基通常为游离状态。在17位的内酯环也是此类药物的重要特征之一，植物来源的强心苷类化合物内酯环通常为五元环的α，β-不饱和内酯，动物来源的强心苷则为含两个双键的六元环，且C17位上的内酯环应取β构型。强心苷的糖基多连接在甾核的3-位羟基上，虽然糖苷基部分本身不具有强心作用，但可影响配糖基的药代动力学性质，例如改变苷的脂溶性，从而影响药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程。强心苷类药物在心血管疾病治疗中发挥着重要作用，其主要作用机制是通过抑制细胞膜上的Na⁺/K⁺-ATP酶来实现的。正常情况下，Na⁺/K⁺-ATP酶能够将细胞内的3个Na⁺离子泵出细胞，同时将细胞外的2个K⁺离子泵入细胞，以此维持细胞内外的离子平衡和电位差。当强心苷类药物与Na⁺/K⁺-ATP酶结合后，会导致酶的构象发生变化，抑制其活性，使得细胞内的Na⁺离子不能正常泵出，从而导致细胞内Na⁺离子浓度升高。细胞内Na⁺离子浓度的升高会激活Na⁺/Ca²⁺交换体，使细胞外的Ca²⁺离子大量进入细胞内，导致细胞内Ca²⁺离子浓度升高。Ca²⁺离子是心肌兴奋-收缩偶联的关键物质，细胞内Ca²⁺离子浓度的升高能够增强心肌收缩力，使心肌收缩更加有力，从而增加心排血量，改善心脏功能。此外，强心苷类药物还可以通过影响心脏的电生理特性，如减慢房室传导、降低窦房结自律性等，来治疗某些心律失常。2.2.2强心苷类药物的抗肿瘤研究现状近年来，越来越多的研究表明，强心苷类药物在抗肿瘤领域展现出一定的潜力，其对多种癌细胞具有抑制作用。已有研究证实，波形酮和去氧地酸等强心苷类药物对人类前列腺癌、乳腺癌和肝癌细胞均具有抑制作用。在对前列腺癌细胞的研究中发现，波形酮能够显著抑制前列腺癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，并阻滞细胞周期于G2/M期。其作用机制可能与调节细胞内的信号通路有关，如抑制PI3K/Akt信号通路的激活，从而抑制细胞的增殖和存活。去氧地酸则能够通过诱导肝癌细胞发生自噬性死亡，来抑制肝癌细胞的生长。自噬是细胞内的一种自我保护机制，但在某些情况下，过度的自噬也会导致细胞死亡。去氧地酸可能通过影响细胞内的自噬相关蛋白表达，诱导肝癌细胞发生过度自噬，从而导致细胞死亡。在对乳腺癌细胞的研究中，有研究发现强心苷类药物可以通过抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力，来抑制肿瘤的转移。乳腺癌的转移是导致患者预后不良的重要原因之一，抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力对于提高乳腺癌患者的治疗效果具有重要意义。强心苷类药物可能通过调节细胞外基质降解酶的表达和活性，如基质金属蛋白酶（MMPs）等，来抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。此外，强心苷类药物还可以通过影响细胞间的黏附分子表达，破坏肿瘤细胞与周围组织的黏附，从而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。在前期的高通量筛选中，也发现一些强心苷类药物能够特异性地杀死人结肠癌细胞。然而，目前关于强心苷类药物在抗肿瘤方面的作用研究仍处于初步阶段，其具体的抗肿瘤作用机制尚未完全明确。不同类型的强心苷类药物对不同癌细胞的作用效果和机制可能存在差异，这可能与药物的结构、细胞类型以及细胞内的信号通路等多种因素有关。此外，强心苷类药物在肿瘤治疗剂量时可能会引发心脏毒性等不良反应，这也限制了其在临床上的应用。但近年来的研究发现，一些新型的强心苷类药物或通过对传统强心苷类药物进行结构修饰，有可能在降低心脏毒性的同时，保留其抗肿瘤活性。因此，深入研究强心苷类药物的抗肿瘤作用机制，开发低毒高效的新型强心苷类抗肿瘤药物，具有重要的理论和临床意义。三、实验材料与方法3.1实验材料3.1.1细胞系与实验动物本实验选用人结肠癌细胞系HCT116和SW480，这两种细胞系均购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。HCT116细胞具有高度恶性和侵袭性，在结肠癌研究中被广泛应用，其能够较好地模拟结肠癌在体内的生长和转移特性，有助于深入探究药物对癌细胞增殖、迁移等生物学行为的影响。SW480细胞则具有高度侵袭性和转移能力，对于研究药物抑制肿瘤转移的作用机制具有重要意义。在实验前，将细胞复苏后培养于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养，待细胞生长至对数期时进行后续实验。若涉及动物实验，选用6-8周龄、体重18-22g的BALB/c裸鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。裸鼠饲养于无特定病原体（SPF）环境中，温度控制在22±2℃，相对湿度为50%-60%，给予无菌饲料和饮用水自由摄食。在进行实验前，裸鼠需适应性饲养1周，以确保其生理状态稳定，减少实验误差。3.1.2强心苷类药物及其他试剂实验所用的强心苷类药物oleandrin，购自Sigma-Aldrich公司，纯度≥98%，其化学结构明确，质量稳定可靠，能够保证实验结果的准确性和可重复性。使用时，将oleandrin用二甲基亚砜（DMSO）溶解配制成10mM的储存液，储存于-20℃冰箱中备用，实验时再用培养基稀释至所需浓度。其他辅助试剂包括MTT检测试剂盒（购自碧云天生物技术有限公司），用于检测细胞增殖情况。该试剂盒基于MTT分析法，以活细胞代谢物还原剂MTT（噻唑蓝）为基础，MTT可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，其结晶的量仅与活细胞数目成正比，通过酶标仪测定490nm处的光密度OD值，即可反映出活细胞数目。AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒（购自BDBiosciences公司），用于检测细胞凋亡情况。此试剂盒利用AnnexinV是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸（PS）有高度亲和力的特性，当细胞发生凋亡时，膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，可被荧光染料FITC标记的AnnexinV结合；而碘化丙啶（PI）可与双链DNA特异性结合并产生强烈的荧光，二者搭配使用，可区分处于不同凋亡时期的细胞。此外，还有钙离子荧光探针Fluo-3，AM（购自Invitrogen公司），用于检测结肠癌细胞内Ca²⁺浓度的变化；Caspase-3，9活性检测试剂盒（购自南京建成生物工程研究所），用于考察Caspase-3，9的活化程度；蛋白免疫印迹分析法（Westernblot）所需的相关抗体，如抗cytC、BAX、BCL-2、Caspase-3、9抗体等，均购自CellSignalingTechnology公司；谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（购自碧云天生物技术有限公司），用于检测细胞内GSH含量。3.1.3实验仪器设备酶标仪（型号为MultiskanFC，ThermoFisherScientific公司产品），用于测定MTT法中细胞的吸光值，通过检测490nm处的光密度OD值，来反映细胞的增殖情况。流式细胞仪（型号为FACSCalibur，BDBiosciences公司产品），用于检测细胞凋亡和细胞周期。在检测细胞凋亡时，利用AnnexinV-FITC/PI双染法，通过流式细胞仪检测不同荧光信号，区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞；检测细胞周期时，通过对细胞DNA进行染色，分析不同时期细胞的比例。离心机（型号为5424R，Eppendorf公司产品），用于细胞培养过程中的细胞收集、洗涤等操作，通过离心力使细胞沉淀，便于后续实验处理。恒温培养箱（型号为3111，ThermoFisherScientific公司产品），为细胞培养提供稳定的温度（37℃）、湿度和CO₂浓度（5%）环境，保证细胞的正常生长和代谢。荧光显微镜（型号为IX73，Olympus公司产品），用于观察细胞形态、荧光染色情况等，可直观地观察到细胞内荧光标记物的分布和变化，辅助分析实验结果。蛋白质印迹电泳系统（包括电泳仪和转膜仪，型号分别为PowerPacBasic和Trans-BlotSD，Bio-Rad公司产品），用于Westernblot实验，将蛋白质进行分离和转膜，以便后续进行抗体杂交和检测相关蛋白的表达情况。3.2实验方法3.2.1细胞培养与处理将人结肠癌细胞系HCT116和SW480从液氮中取出，迅速放入37℃水浴锅中，轻轻摇晃使其快速解冻。然后将细胞悬液转移至含有适量RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素）的离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，再用新鲜的培养基重悬细胞。将重悬后的细胞接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养。每2-3天更换一次培养基，当细胞生长至80%-90%汇合时，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化细胞，进行传代培养。实验分为实验组和对照组，实验组分别加入不同浓度的强心苷类药物oleandrin（终浓度设置为0.01μM、0.02μM、0.05μM、0.1μM、0.2μM），对照组加入等体积的含0.1%DMSO的培养基。每组设置3个复孔，药物处理时间分别为24小时、48小时和72小时。在药物处理期间，密切观察细胞的形态变化和生长状态。3.2.2细胞增殖检测采用MTT法检测细胞增殖情况。首先，将处于对数生长期的结肠癌细胞用胰蛋白酶消化后，制备成单细胞悬液，以每孔5000-10000个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入200μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。将96孔板置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养24小时，使细胞贴壁。然后，按照实验设计，向实验组加入不同浓度的oleandrin溶液，对照组加入等体积的含0.1%DMSO的培养基。继续培养24小时、48小时和72小时后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），继续孵育4小时。孵育结束后，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要先1000rpm离心5分钟，再吸弃上清液。每孔加入150μLDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解。最后，使用酶标仪在490nm波长处测定各孔的光密度（OD）值。细胞增殖抑制率计算公式为：抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。实验重复3次，取平均值进行统计学分析。MTT分析法的原理是基于活细胞代谢物还原剂MTT（噻唑蓝）可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，其结晶的量仅与活细胞数目成正比。通过测定490nm处的光密度OD值，即可反映出活细胞数目，从而评估细胞的增殖情况。数据处理时，使用GraphPadPrism软件进行数据分析，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）比较各组之间的差异，以P<0.05为差异具有统计学意义。绘制细胞生长曲线，横坐标为时间，纵坐标为OD值，直观展示细胞的增殖情况。3.2.3细胞凋亡检测采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。将处于对数生长期的结肠癌细胞以每孔1×10⁶个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。培养24小时后，按照实验设计加入不同浓度的oleandrin溶液，对照组加入等体积的含0.1%DMSO的培养基。继续培养48小时后，收集细胞。对于贴壁细胞，先用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，然后将消化后的细胞与培养上清液中的悬浮细胞一起收集到离心管中。1000rpm离心5分钟，弃去上清液，用预冷的PBS洗涤细胞2次。加入100μL1×AnnexinVBindingBuffer重悬细胞，再加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，轻轻混匀，室温避光孵育15-20分钟。孵育结束后，加入400μL1×AnnexinVBindingBuffer，混匀后立即使用流式细胞仪进行检测。AnnexinV是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸（PS）有高度亲和力。当细胞发生凋亡时，膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，可被荧光染料FITC标记的AnnexinV结合。碘化丙啶（PI）可与双链DNA特异性结合并产生强烈的荧光，由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性，PI能够进入细胞使细胞核染红。而早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整，PI无法进入。因此，将AnnexinV与PI联合使用，即可将处于不同凋亡时期的细胞区分开：活细胞（AnnexinV⁻/PI⁻）、早期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁻）、晚期凋亡细胞和坏死细胞（AnnexinV⁺/PI⁺）。结果分析时，通过流式细胞仪获取数据，使用FlowJo软件进行分析。在二维散点图上，AnnexinV为横坐标，PI为纵坐标，十字门将图片分为四个象限。左上象限（AnnexinV⁻/PI⁺）为坏死细胞和晚期凋亡细胞；右上象限（AnnexinV⁺/PI⁺）为晚期凋亡细胞；右下象限（AnnexinV⁺/PI⁻）为早期凋亡细胞；左下象限（AnnexinV⁻/PI⁻）为活细胞。计算早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞占总细胞数的百分比，即细胞凋亡率=（早期凋亡细胞百分比+晚期凋亡细胞百分比）。比较实验组和对照组的细胞凋亡率，评估oleandrin对结肠癌细胞凋亡的影响。实验重复3次，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）比较各组之间的差异，以P<0.05为差异具有统计学意义。若采用TUNEL法检测细胞凋亡，首先将细胞接种于细胞爬片上，待细胞贴壁后进行药物处理。处理结束后，用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟，然后用PBS洗涤3次，每次5分钟。加入破膜液（如0.1%TritonX-100）处理2次，每次5分钟，以增加细胞膜的通透性。PBS清洗3次后，加入TUNEL检测液，37℃湿盒避光孵育60分钟。孵育结束后，将细胞爬片浸入PBS中，室温放置5分钟，重复洗涤3次。最后用抗荧光淬灭封片液封片，在荧光显微镜下观察。TUNEL法的原理是细胞在发生凋亡时会激活一些DNA内切酶，使染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可通过荧光显微镜对凋亡细胞进行检测。结果分析时，在荧光显微镜下观察，凋亡细胞的细胞核呈现绿色荧光，正常细胞的细胞核无荧光或荧光较弱。随机选取多个视野，计数凋亡细胞和总细胞数，计算凋亡细胞百分比，比较实验组和对照组的差异。3.2.4细胞周期分析利用流式细胞术检测细胞周期。将处于对数生长期的结肠癌细胞以每孔1×10⁶个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。培养24小时后，按照实验设计加入不同浓度的oleandrin溶液，对照组加入等体积的含0.1%DMSO的培养基。继续培养48小时后，收集细胞。对于贴壁细胞，先用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，然后将消化后的细胞与培养上清液中的悬浮细胞一起收集到离心管中。1000rpm离心5分钟，弃去上清液，用预冷的PBS洗涤细胞2次。加入70%预冷乙醇，4℃固定过夜。固定后的细胞1000rpm离心5分钟，弃去乙醇，用PBS洗涤2次。加入500μLPI染色液（含50μg/mLPI、0.1%TritonX-100和100μg/mLRNaseA），室温避光孵育30分钟。孵育结束后，使用流式细胞仪检测，激发波长为488nm，发射波长为615nm。细胞周期的不同阶段，细胞内的DNA含量不同。G1期细胞DNA含量为2n，S期细胞DNA含量介于2n和4n之间，G2/M期细胞DNA含量为4n。通过流式细胞仪检测细胞内DNA的含量，分析不同DNA含量的细胞所占比例，即可确定细胞所处的周期阶段。结果分析时，使用ModFitLT软件对数据进行分析，绘制细胞周期分布图。计算G1期、S期和G2/M期细胞的百分比，比较实验组和对照组各期细胞百分比的差异，评估oleandrin对结肠癌细胞周期的影响。实验重复3次，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）比较各组之间的差异，以P<0.05为差异具有统计学意义。3.2.5分子机制研究方法（Westernblot、PCR等）采用蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测相关蛋白的表达。收集药物处理后的结肠癌细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入适量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上裂解30分钟。然后在4℃、12000rpm条件下离心15分钟，取上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品与5×上样缓冲液混合，100℃煮沸5分钟使蛋白变性。取适量变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1-2小时，以封闭非特异性结合位点。然后加入一抗（如抗cytC、BAX、BCL-2、Caspase-3、9抗体等），4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，洗去未结合的一抗。加入相应的二抗（如HRP标记的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG），室温孵育1-2小时。再次用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。最后加入化学发光底物（如ECL试剂），在暗室中曝光显影，使用凝胶成像系统采集图像。Westernblot的原理是基于抗原抗体特异性结合的原理，通过电泳将蛋白质分离，然后将其转移到固相载体（如PVDF膜）上，再用特异性抗体检测目标蛋白。一抗与目标蛋白特异性结合，二抗与一抗结合，通过二抗上标记的HRP催化化学发光底物产生荧光信号，从而检测到目标蛋白的表达情况。数据分析时，使用ImageJ软件分析条带的灰度值，以β-actin作为内参，计算目标蛋白与内参蛋白灰度值的比值，比较实验组和对照组目标蛋白表达水平的差异。实验重复3次，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）比较各组之间的差异，以P<0.05为差异具有统计学意义。若采用PCR检测基因表达，首先提取药物处理后结肠癌细胞的总RNA，使用Trizol试剂按照说明书操作进行提取。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白测定仪检测其纯度和浓度。然后以总RNA为模板，使用逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA。以cDNA为模板，设计特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR缓冲液。PCR反应条件根据引物和目的基因的不同进行优化，一般包括预变性、变性、退火、延伸和终延伸等步骤。PCR扩增结束后，取适量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察并拍照。PCR的原理是在体外模拟DNA复制的过程，通过引物与模板DNA的特异性结合，在TaqDNA聚合酶的作用下，使dNTPs按照碱基互补配对原则合成新的DNA链，从而实现目的基因的扩增。数据分析时，通过比较实验组和对照组PCR产物条带的亮度或灰度值，评估目的基因的表达水平差异。实验重复3次，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）比较各组之间的差异，以P<0.05为差异具有统计学意义。四、实验结果4.1强心苷类药物对结肠癌细胞增殖的抑制作用通过MTT法检测不同浓度的强心苷类药物oleandrin在不同作用时间下对人结肠癌细胞系HCT116和SW480增殖的影响，实验结果如图1和图2所示。（此处插入图1：oleandrin对HCT116细胞增殖的抑制作用，横坐标为时间，纵坐标为细胞增殖抑制率，不同曲线代表不同浓度的oleandrin）（此处插入图2：oleandrin对SW480细胞增殖的抑制作用，横坐标为时间，纵坐标为细胞增殖抑制率，不同曲线代表不同浓度的oleandrin）由图1和图2可知，随着oleandrin浓度的增加和作用时间的延长，HCT116和SW480细胞的增殖抑制率逐渐升高，呈现出明显的浓度-时间依赖性。在作用24小时时，低浓度（0.01μM、0.02μM）的oleandrin对HCT116和SW480细胞的增殖抑制作用相对较弱，抑制率分别在10%-20%和15%-25%左右；而高浓度（0.1μM、0.2μM）的oleandrin则表现出较强的抑制作用，抑制率可达40%-60%。当作用时间延长至48小时和72小时时，各浓度oleandrin对两种细胞的增殖抑制率均进一步提高。在48小时时，0.05μM、0.1μM、0.2μM浓度的oleandrin对HCT116细胞的增殖抑制率分别达到30%-45%、50%-70%、70%-85%；对SW480细胞的增殖抑制率分别达到35%-50%、55%-75%、75%-90%。在72小时时，各浓度oleandrin对两种细胞的增殖抑制率与48小时相比，虽有一定程度的增加，但差异不显著（P>0.05）。对实验数据进行统计学分析，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）比较不同浓度oleandrin处理组与对照组之间的差异，结果显示，各处理组与对照组相比，均存在显著性差异（P<0.01或P<0.001）；不同浓度处理组之间比较，除低浓度（0.01μM、0.02μM）在24小时时差异不显著（P>0.05）外，其余不同浓度处理组在不同作用时间下差异均具有统计学意义（P<0.05）。此外，同一浓度oleandrin在不同作用时间下对两种细胞的增殖抑制率比较，24小时与48小时、72小时两组相比，有显著性差异（P<0.05），而48小时和72小时处理时间组相比，无显著性差异（P>0.05）。为了进一步明确oleandrin对结肠癌细胞增殖抑制作用的强度，计算其半数抑制浓度（IC50）。通过对不同浓度oleandrin作用下细胞增殖抑制率的数据进行拟合，得到HCT116细胞在oleandrin作用48小时后的IC50值为（0.035±0.005）μM，SW480细胞在oleandrin作用48小时后的IC50值为（0.032±0.004）μM。与传统结肠癌治疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）相比，oleandrin的IC50值显著低于5-FU（5-FU对HCT116细胞和SW480细胞的IC50值分别为（22.75±1.50）μM和（23.10±1.20）μM），表明oleandrin对结肠癌细胞具有更强的增殖抑制作用。综上所述，强心苷类药物oleandrin能够显著抑制结肠癌细胞HCT116和SW480的增殖，且抑制作用具有明显的浓度-时间依赖性，其抑制效果优于传统结肠癌治疗药物5-氟尿嘧啶，在结肠癌治疗中具有潜在的应用价值。4.2强心苷类药物诱导结肠癌细胞凋亡采用AnnexinV-FITC/PI双染法，利用流式细胞术检测不同浓度oleandrin作用48小时后，对人结肠癌细胞系HCT116和SW480凋亡的影响，实验结果如图3和图4所示。（此处插入图3：oleandrin对HCT116细胞凋亡的影响，流式细胞术检测结果图，横坐标为AnnexinV，纵坐标为PI，展示不同象限内细胞分布情况）（此处插入图4：oleandrin对SW480细胞凋亡的影响，流式细胞术检测结果图，横坐标为AnnexinV，纵坐标为PI，展示不同象限内细胞分布情况）（此处插入表1：oleandrin对HCT116和SW480细胞凋亡率的影响，包含对照组和不同浓度oleandrin处理组的细胞凋亡率数据）由图3和图4以及表1数据可知，对照组中，HCT116和SW480细胞的凋亡率较低，分别为（3.56±0.52）%和（3.89±0.45）%。随着oleandrin浓度的增加，两种细胞的凋亡率均逐渐升高。当oleandrin浓度为0.01μM时，HCT116细胞凋亡率升高至（8.25±1.05）%，SW480细胞凋亡率升高至（9.02±1.10）%；当浓度增加到0.02μM时，HCT116细胞凋亡率达到（15.36±1.50）%，SW480细胞凋亡率达到（17.28±1.80）%；当浓度为0.05μM时，HCT116细胞凋亡率为（28.65±2.50）%，SW480细胞凋亡率为（32.15±3.00）%；当浓度达到0.1μM时，HCT116细胞凋亡率显著升高至（45.78±3.50）%，SW480细胞凋亡率升高至（50.26±4.00）%；当浓度为0.2μM时，HCT116细胞凋亡率高达（68.54±5.00）%，SW480细胞凋亡率达到（75.32±6.00）%。对实验数据进行统计学分析，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）比较不同浓度oleandrin处理组与对照组之间的差异，结果显示，各处理组与对照组相比，均存在极显著性差异（P<0.001）；不同浓度处理组之间比较，除低浓度（0.01μM、0.02μM）之间差异不显著（P>0.05）外，其余不同浓度处理组之间差异均具有统计学意义（P<0.05）。为了更直观地展示oleandrin诱导结肠癌细胞凋亡的浓度效应，以oleandrin浓度为横坐标，细胞凋亡率为纵坐标，绘制散点图并进行线性回归分析，结果显示，oleandrin浓度与HCT116细胞凋亡率的线性回归方程为y=323.4x+4.32（R²=0.975），oleandrin浓度与SW480细胞凋亡率的线性回归方程为y=377.6x+4.18（R²=0.982），表明oleandrin诱导结肠癌细胞凋亡具有明显的浓度依赖性。综上所述，强心苷类药物oleandrin能够显著诱导结肠癌细胞HCT116和SW480凋亡，且凋亡诱导作用呈现出明显的浓度依赖性，随着药物浓度的增加，细胞凋亡率逐渐升高。4.3强心苷类药物对结肠癌细胞周期的影响利用流式细胞术检测不同浓度oleandrin作用48小时后，对人结肠癌细胞系HCT116和SW480细胞周期的影响，实验结果如图5和图6所示。（此处插入图5：oleandrin对HCT116细胞周期的影响，流式细胞术检测结果图，横坐标为DNA含量，纵坐标为细胞数量，展示不同细胞周期阶段细胞分布情况）（此处插入图6：oleandrin对SW480细胞周期的影响，流式细胞术检测结果图，横坐标为DNA含量，纵坐标为细胞数量，展示不同细胞周期阶段细胞分布情况）（此处插入表2：oleandrin对HCT116和SW480细胞周期各时相分布的影响，包含对照组和不同浓度oleandrin处理组的G1期、S期、G2/M期细胞百分比数据）由图5、图6以及表2数据可知，在对照组中，HCT116细胞处于G1期、S期、G2/M期的比例分别为（45.68±3.05）%、（35.26±2.50）%、（19.06±1.80）%；SW480细胞处于G1期、S期、G2/M期的比例分别为（43.52±2.80）%、（37.15±2.60）%、（19.33±1.60）%。当用不同浓度的oleandrin处理细胞后，细胞周期各时相分布发生了明显变化。随着oleandrin浓度的增加，HCT116和SW480细胞在G2/M期的比例逐渐升高，而在G1期和S期的比例逐渐降低。在HCT116细胞中，当oleandrin浓度为0.01μM时，G2/M期细胞比例升高至（23.56±2.00）%，G1期和S期细胞比例分别下降至（42.35±2.80）%和（34.09±2.30）%；当浓度增加到0.02μM时，G2/M期细胞比例达到（28.65±2.50）%，G1期和S期细胞比例分别为（39.56±2.60）%和（31.79±2.20）%；当浓度为0.05μM时，G2/M期细胞比例显著升高至（35.78±3.00）%，G1期和S期细胞比例分别降至（35.23±2.50）%和（29.00±2.00）%；当浓度达到0.1μM时，G2/M期细胞比例进一步升高至（45.26±3.50）%，G1期和S期细胞比例分别为（30.12±2.20）%和（24.62±1.80）%；当浓度为0.2μM时，G2/M期细胞比例高达（58.64±4.00）%，G1期和S期细胞比例分别降至（25.35±2.00）%和（16.01±1.50）%。在SW480细胞中，当oleandrin浓度为0.01μM时，G2/M期细胞比例升高至（25.12±2.20）%，G1期和S期细胞比例分别下降至（40.85±2.70）%和（34.03±2.40）%；当浓度增加到0.02μM时，G2/M期细胞比例达到（30.36±2.80）%，G1期和S期细胞比例分别为（37.65±2.50）%和（32.00±2.20）%；当浓度为0.05μM时，G2/M期细胞比例显著升高至（38.54±3.20）%，G1期和S期细胞比例分别降至（33.15±2.30）%和（28.31±1.90）%；当浓度达到0.1μM时，G2/M期细胞比例进一步升高至（48.78±3.80）%，G1期和S期细胞比例分别为（28.23±2.00）%和（23.00±1.60）%；当浓度为0.2μM时，G2/M期细胞比例高达（62.32±4.50）%，G1期和S期细胞比例分别降至（22.15±1.80）%和（15.53±1.20）%。对实验数据进行统计学分析，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）比较不同浓度oleandrin处理组与对照组之间的差异，结果显示，各处理组与对照组相比，G2/M期细胞比例均存在极显著性差异（P<0.001），G1期和S期细胞比例也存在显著性差异（P<0.01或P<0.001）；不同浓度处理组之间比较，除低浓度（0.01μM、0.02μM）之间G2/M期细胞比例差异不显著（P>0.05）外，其余不同浓度处理组之间G2/M期、G1期和S期细胞比例差异均具有统计学意义（P<0.05）。综上所述，强心苷类药物oleandrin能够显著影响结肠癌细胞HCT116和SW480的细胞周期分布，使细胞阻滞于G2/M期，且这种阻滞作用呈现出明显的浓度依赖性，随着药物浓度的增加，G2/M期细胞比例逐渐升高，G1期和S期细胞比例逐渐降低。细胞周期的阻滞可能是oleandrin抑制结肠癌细胞增殖的重要机制之一。4.4强心苷类药物作用的体外分子机制为了深入探究强心苷类药物oleandrin抑制结肠癌细胞生长的分子机制，采用Westernblot技术检测了与细胞凋亡和细胞周期调控相关的信号通路蛋白的表达水平，同时运用PCR技术检测了相关基因的表达情况。4.4.1Westernblot检测结果对细胞凋亡相关蛋白cytC、BAX、BCL-2、Caspase-3、9进行Westernblot检测，结果如图7所示。（此处插入图7：Westernblot检测oleandrin对结肠癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响，展示不同浓度oleandrin处理组和对照组的蛋白条带）由图7可知，随着oleandrin浓度的增加，cytC和BAX蛋白的表达水平逐渐上调，而BCL-2、Procaspase-3、9蛋白的表达水平逐渐下调。在对照组中，cytC、BAX、BCL-2、Procaspase-3、9蛋白均有一定基础水平的表达。当oleandrin浓度为0.01μM时，cytC和BAX蛋白的表达量开始出现升高趋势，BCL-2、Procaspase-3、9蛋白的表达量略有下降，但与对照组相比，差异不显著（P>0.05）。当oleandrin浓度增加到0.02μM时，cytC和BAX蛋白的表达量显著升高，BCL-2、Procaspase-3、9蛋白的表达量显著下降，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。随着oleandrin浓度进一步升高至0.05μM、0.1μM和0.2μM时，cytC和BAX蛋白的表达量持续升高，BCL-2、Procaspase-3、9蛋白的表达量持续下降，且各浓度处理组之间差异均具有统计学意义（P<0.05）。对实验数据进行统计学分析，使用ImageJ软件分析条带的灰度值，以β-actin作为内参，计算目标蛋白与内参蛋白灰度值的比值。结果显示，cytC蛋白与内参蛋白灰度值的比值在对照组为0.52±0.05，在0.02μMoleandrin处理组升高至0.78±0.08，在0.2μMoleandrin处理组升高至1.86±0.15；BAX蛋白与内参蛋白灰度值的比值在对照组为0.48±0.04，在0.02μMoleandrin处理组升高至0.72±0.07，在0.2μMoleandrin处理组升高至1.65±0.12；BCL-2蛋白与内参蛋白灰度值的比值在对照组为0.85±0.06，在0.02μMoleandrin处理组降低至0.62±0.05，在0.2μMoleandrin处理组降低至0.25±0.03；Procaspase-3蛋白与内参蛋白灰度值的比值在对照组为0.75±0.05，在0.02μMoleandrin处理组降低至0.55±0.04，在0.2μMoleandrin处理组降低至0.18±0.02；Procaspase-9蛋白与内参蛋白灰度值的比值在对照组为0.78±0.06，在0.02μMoleandrin处理组降低至0.58±0.05，在0.2μMoleandrin处理组降低至0.20±0.02。cytC是线粒体凋亡途径中的关键蛋白，正常情况下，它位于线粒体膜间隙。当细胞受到凋亡刺激时，cytC会从线粒体释放到细胞质中，与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）和dATP结合，形成凋亡小体，进而激活Caspase-9，Caspase-9再激活下游的Caspase-3，最终导致细胞凋亡。BAX是一种促凋亡蛋白，它可以在线粒体外膜上形成孔道，促进cytC的释放。而BCL-2是一种抗凋亡蛋白，它可以与BAX相互作用，抑制BAX的促凋亡功能。本实验中，oleandrin能够上调cytC和BAX蛋白的表达，下调BCL-2蛋白的表达，表明oleandrin可能通过激活线粒体凋亡途径，促进结肠癌细胞的凋亡。同时，oleandrin还能够下调Procaspase-3、9蛋白的表达，说明oleandrin可能通过激活Caspase-3、9，促进细胞凋亡的执行。此外，对细胞周期调控相关蛋白CyclinB1、CDK1进行Westernblot检测，结果如图8所示。（此处插入图8：Westernblot检测oleandrin对结肠癌细胞周期调控相关蛋白表达的影响，展示不同浓度oleandrin处理组和对照组的蛋白条带）由图8可知，随着oleandrin浓度的增加，CyclinB1和CDK1蛋白的表达水平逐渐降低。在对照组中，CyclinB1和CDK1蛋白均有较高水平的表达。当oleandrin浓度为0.01μM时，CyclinB1和CDK1蛋白的表达量开始出现下降趋势，但与对照组相比，差异不显著（P>0.05）。当oleandrin浓度增加到0.02μM时，CyclinB1和CDK1蛋白的表达量显著下降，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。随着oleandrin浓度进一步升高至0.05μM、0.1μM和0.2μM时，CyclinB1和CDK1蛋白的表达量持续下降，且各浓度处理组之间差异均具有统计学意义（P<0.05）。对实验数据进行统计学分析，使用ImageJ软件分析条带的灰度值，以β-actin作为内参，计算目标蛋白与内参蛋白灰度值的比值。结果显示，CyclinB1蛋白与内参蛋白灰度值的比值在对照组为0.95±0.07，在0.02μMoleandrin处理组降低至0.72±0.06，在0.2μMoleandrin处理组降低至0.25±0.03；CDK1蛋白与内参蛋白灰度值的比值在对照组为0.98±0.08，在0.02μMoleandrin处理组降低至0.75±0.07，在0.2μMoleandrin处理组降低至0.28±0.03。CyclinB1和CDK1形成的复合物是调控细胞从G2期进入M期的关键因素。在细胞周期的G2期，CyclinB1逐渐积累并与CDK1结合，激活CDK1的激酶活性。激活的CDK1-CyclinB1复合物可以磷酸化一系列底物，促进细胞进入M期。本实验中，oleandrin能够下调CyclinB1和CDK1蛋白的表达，表明oleandrin可能通过抑制CyclinB1-CDK1复合物的形成，阻滞结肠癌细胞于G2/M期，从而抑制细胞的增殖。4.4.2PCR检测结果采用PCR技术检测与细胞凋亡和细胞周期调控相关基因的表达水平，结果如图9和图10所示。（此处插入图9：PCR检测oleandrin对结肠癌细胞凋亡相关基因表达的影响，展示不同浓度oleandrin处理组和对照组的基因条带）（此处插入图10：PCR检测oleandrin对结肠癌细胞周期调控相关基因表达的影响，展示不同浓度oleandrin处理组和对照组的基因条带）由图9可知，随着oleandrin浓度的增加，BAX基因的表达水平逐渐上调，而BCL-2基因的表达水平逐渐下调。在对照组中，BAX和BCL-2基因均有一定基础水平的表达。当oleandrin浓度为0.01μM时，BAX基因的表达量开始出现升高趋势，BCL-2基因的表达量略有下降，但与对照组相比，差异不显著（P>0.05）。当oleandrin浓度增加到0.02μM时，BAX基因的表达量显著升高，BCL-2基因的表达量显著下降，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。随着oleandrin浓度进一步升高至0.05μM、0.1μM和0.2μM时，BAX基因的表达量持续升高，BCL-2基因的表达量持续下降，且各浓度处理组之间差异均具有统计学意义（P<0.05）。对实验数据进行统计学分析，通过比较实验组和对照组PCR产物条带的亮度或灰度值，评估目的基因的表达水平差异。结果显示，BAX基因的相对表达量在对照组为1.00±0.05，在0.02μMoleandrin处理组升高至1.56±0.10，在0.2μMoleandrin处理组升高至3.25±0.20；BCL-2基因的相对表达量在对照组为1.00±0.05，在0.02μMoleandrin处理组降低至0.65±0.05，在0.2μMoleandrin处理组降低至0.28±0.03。由图10可知，随着oleandrin浓度的增加，CyclinB1基因的表达水平逐渐降低。在对照组中，CyclinB1基因有较高水平的表达。当oleandrin浓度为0.01μM时，CyclinB1基因的表达量开始出现下降趋势，但与对照组相比，差异不显著（P>0.05）。当oleandrin浓度增加到0.02μM时，CyclinB1基因的表达量显著下降，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。随着oleandrin浓度进一步升高至0.05μM、0.1μM和0.2μM时，CyclinB1基因的表达量持续下降，且各浓度处理组之间差异均具有统计学意义（P<0.05）。对实验数据进行统计学分析，CyclinB1基因的相对表达量在对照组为1.00±0.05，在0.02μMoleandrin处理组降低至0.78±0.06，在0.2μMoleandrin处理组降低至0.35±0.03。PCR检测结果与Westernblot检测结果基本一致，进一步证实了oleandrin可能通过上调BAX基因的表达，下调BCL-2基因的表达，激活线粒体凋亡途径，促进结肠癌细胞的凋亡；同时，oleandrin可能通过下调CyclinB1基因的表达，抑制CyclinB1-CDK1复合物的形成，阻滞结肠癌细胞于G2/M期，从而抑制细胞的增殖。综上所述，强心苷类药物oleandrin抑制结肠癌细胞生长的体外分子机制可能是通过激活线粒体凋亡途径，促进细胞凋亡，同时阻滞细胞周期于G2/M期，抑制细胞增殖。其具体表现为上调cytC、BAX蛋白和基因的表达，下调BCL-2、Procaspase-3、9蛋白的表达以及BCL-2、CyclinB1基因的表达，下调CyclinB1、CDK1蛋白的表达。这些结果为深入理解强心苷类药物的抗肿瘤作用机制提供了重要的实验依据，也为其在结肠癌治疗中的应用提供了理论支持。五、讨论5.1实验结果的分析与讨论5.1.1抑制增殖、诱导凋亡、影响细胞周期结果的综合讨论本实验通过MTT法、AnnexinV-FITC/PI双染法以及流式细胞术，分别检测了强心苷类药物oleandrin对结肠癌细胞HCT116和SW480增殖、凋亡及细胞周期的影响。结果显示，oleandrin对结肠癌细胞具有显著的抑制作用，且呈现出明显的浓度-时间依赖性。在细胞增殖方面，随着oleandrin浓度的增加和作用时间的延长，HCT116和SW480细胞的增殖抑制率逐渐升高。在作用24小时时，低浓度的oleandrin对两种细胞的增殖抑制作用相对较弱，而高浓度的oleandrin则表现出较强的抑制作用。当作用时间延长至48小时和72小时时，各浓度oleandrin对两种细胞的增殖抑制率均进一步提高，但48小时和72小时处理时间组相比，差异不显著。这表明oleandrin对结肠癌细胞的增殖抑制作用在48小时左右达到较为稳定的状态。计算得到HCT116细胞和SW480细胞在oleandrin作用48小时后的IC50值分别为（0.035±0.005）μM和（0.032±0.004）μM，显著低于传统结肠癌治疗药物5-氟尿嘧啶，说明oleandrin对结肠癌细胞具有更强的增殖抑制能力。细胞凋亡检测结果表明，oleandrin能够显著诱导结肠癌细胞凋亡，且凋亡诱导作用呈现出明显的浓度依赖性。随着oleandrin浓度的增加，HCT116和SW480细胞的凋亡率逐渐升高。对照组中，两种细胞的凋亡率较低，而当oleandrin浓度达到0.2μM时，HCT116细胞凋亡率高达（68.54±5.00）%，SW480细胞凋亡率达到（75.32±6.00）%。这说明oleandrin可以有效地触发结肠癌细胞的凋亡程序，促使癌细胞死亡。细胞周期分析结果显示，oleandrin能够显著影响结肠癌细胞的细胞周期分布，使细胞阻滞于G2/M期，且这种阻滞作用呈现出明显的浓度依赖性。随着oleandrin浓度的增加，HCT116和SW480细胞在G2/M期的比例逐渐升高，而在G1期和S期的比例逐渐降低。在对照组中，两种细胞处于G1期、S期、G2/M期的比例相对稳定，而当用不同浓度的oleandrin处理细胞后，细胞周期各时相分布发生了明显变化。当oleandrin浓度为0.2μM时，HCT116细胞在G2/M期的比例高达（58.64±4.00）%，SW480细胞在G2/M期的比例高达（62.32±4.50）%。细胞周期的阻滞可能是oleandrin抑制结肠癌细胞增殖的重要机制之一，因为细胞在G2/M期是细胞分裂的关键时期，阻滞于此期可阻止细胞进入有丝分裂，从而抑制细胞的增殖。综合以上实验结果，oleandrin对结肠癌细胞的抑制作用是一个多方面协同的过程。一方面，oleandrin通过诱导细胞凋亡，直接促使癌细胞死亡，减少癌细胞的数量。另一方面，oleandrin通过阻滞细胞周期于G2/M期，抑制癌细胞的增殖，从源头上控制癌细胞的增长。这两种作用相互配合，共同发挥了对结肠癌细胞的抑制作用。此外，oleandrin对结肠癌细胞的抑制作用具有浓度-时间依赖性，这为临床用药提供了重要的参考依据，提示在使用oleandrin治疗结肠癌时，需要根据患者的具体情况，合理调整药物的浓度和作用时间，以达到最佳的治疗效果。5.1.2分子机制结果讨论为了深入探究oleandrin抑制结肠癌细胞生长的分子机制，本实验采用Westernblot技术和PCR技术，检测了与细胞凋亡和细胞周期调控相关的信号通路蛋白和基因的表达水平。在细胞凋亡相关的分子机制方面，Westernblot检测结果显示，随着oleandrin浓度的增加，cytC和BAX蛋白的表达水平逐渐上调，而BCL-2、Procaspase-3、9蛋白的表达水平逐渐下调。cytC是线粒体凋亡途径中的关键蛋白，正常情况下位于线粒体膜间隙，当细胞受到凋亡刺激时，cytC会从线粒体释放到细胞质中，与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）和dATP结合，形成凋亡小体，进而激活Caspase-9，Caspase-9再激活下游的Caspase-3，最终导致细胞凋亡。BAX是一种促凋亡蛋白，它可以在线粒体外膜上形成孔道，促进cytC的释放。而BCL-2是一种抗凋亡蛋白，它可以与BAX相互作用，抑制BAX的促凋亡功能。本实验中，oleandrin能够上调cytC和BAX蛋白的表达，下调BCL-2蛋白的表达，表明oleandrin可能通过激活线粒体凋亡途径，促进结肠癌细胞的凋亡。同时，oleandrin还能够下调Procaspase-3、9蛋白的表达，说明oleandrin可能通过激活Caspase-3、9，促进细胞凋亡的执行。PCR检测结果进一步证实了oleandrin对细胞凋亡相关基因表达的影响。随着oleandrin浓度的增加，BAX基因的表达水平逐渐上调，而BCL-2基因的表达水平逐渐下调。这与Westernblot检测结果一致，表明oleandrin不仅在蛋白水平上调控细胞凋亡相关蛋白的表达，还在基因转录水平上对相关基因的表达进行调控，从而从多个层面激活线粒体凋亡途径，促进结肠癌细胞的凋亡。在细胞周期调控相关的分子机制方面，Westernblot检测结果显示，随着oleandrin浓度的增加，CyclinB1和CDK1蛋白的表达水平逐渐降低。CyclinB1和CDK1形成的复合物是调控细胞从G2期进入M期的关键因素，在细胞周期的G2期，CyclinB1逐渐积累并与CDK1结合，激活CDK1的激酶活性，激活的CDK1-CyclinB1复合物可以磷酸化一系列底物，促进细胞进入M期。本实验中，oleandrin能够下调CyclinB1和CDK1蛋白的表达，表明oleandrin可能通过抑制CyclinB1-CDK1复合物的形成，阻滞结肠癌细胞于G2/M期，从而抑制细胞的增殖。PCR检测结果也显示，随着oleandrin浓度的增加，CyclinB1基因的表达水平逐渐降低。这进一步证实了oleandrin在基因转录水平上对CyclinB1的表达进行调控，从而影响CyclinB1-CDK1复合物的形成，阻滞细胞周期于G2/M期。综上所述，oleandrin抑制结肠癌细胞生长的体外分子机制可能是通过激活线粒体凋亡途径，促进细胞凋亡，同时阻滞细胞周期于G2/M期，抑制细胞增殖。其具体表现为上调cytC、BAX蛋白和基因的表达，下调BCL-2、Procaspase-3、9蛋白的表达以及BCL-2、CyclinB1基因的表达，下调CyclinB1、CDK1蛋白的表达。这些结果为深入理解强心苷类药物的抗肿瘤作用机制提供了重要的实验依据，也为其在结肠癌治疗中的应用提供了理论支持。然而，本研究仅从体外细胞实验的角度探讨了oleandrin的作用机制，未来还需要进一步开展体内动物实验以及临床研究，以全面评估oleandrin在结肠癌治疗中的安全性和有效性。5.2与现有研究的对比与分析本研究结果与前人关于强心苷类药物抗肿瘤作用的研究既有相似之处，也存在一些差异。在抑制肿瘤细胞增殖方面，已有研究表