高三二轮复习试题生物大题分析与表达练6生物技术与工程

6.生物技术与工程1.(12分)(2025·云南模拟)玉米是一种优良作物,但普通玉米缺乏动物生长发育所必需的赖氨酸,科研工作者利用转基因技术将马铃薯中高赖氨酸蛋白基因(SBgLR)转入玉米细胞获得高赖氨酸玉米新品种。该过程所用基因、Ti质粒的部分结构、限制酶的识别序列及切割位点如图所示。回答下列问题。注:LB、RB分别为TDNA的左边界、右边界。(1)PCR扩增SBgLR基因时,引物的作用是

;

第二轮扩增结束时,PCR反应体系中存在种双链DNA。

(2)为获得能正确表达SBgLR基因的重组质粒,应使用两种限制酶切割图中质粒。切割目的基因和质粒时均选用两种限制酶,这样设计的优点是

。

(3)SBgLR基因中无上述限制酶识别序列,研究人员利用SBgLR基因的mRNA进行逆转录得到了cDNA,已知mRNA的序列为5'UCUGUUGAAUAU…(中间序列)…GCAUCAUCCAGG3'。利用PCR技术对cDNA进行扩增,为便于将扩增后的基因和载体连接构建重组质粒,请写出PCR扩增时A端和B端所需DNA引物的前12个碱基序列、。

(4)研究者采用RTPCR技术对高赖氨酸玉米新品种转录情况进行鉴定,首先分别提取高赖氨酸玉米新品种和野生型玉米的全部RNA作为模板,经逆转录获得cDNA,再以cDNA作为模板进行PCR扩增,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果如下图所示,1号泳道加入的样品是基因表达载体中SBgLR基因的PCR产物,则高赖氨酸玉米新品种和野生型玉米的RTPCR扩增产物分别加入的是泳道。

Marker:已知分子量的DNA片段2.(11分)(2025·黑龙江模拟)诺如病毒(HuNoV)为单链RNA病毒,是导致人急性胃肠炎的最常见的病原体之一,其衣壳蛋白vpl蛋白具免疫原性,且可自组装成空心的病毒样颗粒(VLP)。科研人员利用昆虫杆状病毒表达系统制备VLP,即以杆状病毒为载体,通过特异性感染昆虫细胞生产VLP基因工程疫苗,部分技术路线如图1所示。回答下列问题。图1(1)为了后续实验中方便蛋白的纯化,需将vpl基因与小段His标签基因序列相连,形成融合基因(图2),并与转移载体质粒连接,构建出重组转移载体。现欲通过PCR判定融合基因已准确连接,应选择图2中的引物组合是。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,结果符合预期,通常还需进行序列测定,原因是琼脂糖凝胶电泳技术

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图2(2)昆虫HF细胞能高效表达外源基因,是与载体上的(结构)有关。从结构上看,外源基因能和病毒DNA拼接的原因是。

构建重组杆状病毒要在昆虫细胞系中共转染,其原因是。

(3)当目的基因两侧的小段序列与表达载体上某序列相同或相似时,可通过同源切割后进行片段互换实现同源重组。将含有vpl基因的重组转移载体质粒与携带杆状病毒基因组的BAC线性DNA共转染到昆虫SF9细胞中,通过一步转染即可实现重组杆状病毒的高效生成。已知ORF是病毒在昆虫细胞中复制的必备元件,△ORF是部分片段缺失的ORF(能在大肠杆菌中复制,不能在昆虫细胞中复制)。推测图1所示制备过程中,SF9细胞中只产生重组杆状病毒的必要条件是。(多选)

A.甲为△ORF,乙为ORFB.BAC线性DNA为线状而非环状C.BAC线性DNA含抗生素抗性基因D.BAC线性DNA含杆状病毒基因组(4)为扩大疫苗产量,昆虫HF细胞应选择(填“贴壁”或“悬浮”)生长型细胞。与大肠杆菌为受体细胞相比,用昆虫细胞作为受体细胞生产VLP可更好的保留vpl蛋白的抗原性,其原因是

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3.(11分)(2025·山西吕梁二模)大豆是我国重要的油料作物和植物蛋白的主要来源,但盐胁迫会严重影响大豆植株的生长。研究人员欲将酵母菌细胞中的耐盐基因ENA1导入大豆体内以提高其耐盐性,如图为构建的基因表达载体的部分结构。回答下列问题。注:LB为TDNA的左侧,RB为TDNA的右侧,P35S为启动子,T35S和Nos均为终止子,Bar基因为抗草甘膦(除草剂)基因。(1)利用PCR方法从酵母菌基因组中扩增ENA1基因时需根据设计引物,PCR反应体系中除加入ENA1基因、4种脱氧核苷酸等物质外,还需加入酶。

(2)为了检测目的基因是否正向插入,可选用图中的引物对其进行扩增,并对扩增产物进行电泳,若结果为(填“获得扩增产物”或“未获得扩增产物”),则说明ENA1基因正向插入。

(3)将目的基因导入植物细胞常采用的方法为,得到转基因大豆植株后,研究人员对转基因大豆T2~T4代进行了PCR及电泳,实验结果如下图所示(1kb=1000bp):

图中1组为标准对照组,2组为加水对照组,3组为加入野生型大豆DNA的PCR产物组,则4~7组为加入组,已知ENA1基因扩增条带大小为550bp,Bar基因扩增条带大小为441bp,则图表示扩增的基因为ENA1,连续三代PCR检测结果说明

。

(4)Bar基因为抗草甘膦基因,大豆在生长过程常喷洒草甘膦进行除草,推测该实验在转入ENA1基因的同时还转入Bar基因,目的是排除。从分子水平检测转基因大豆体内目的基因是否完成了表达,可采用方法。

4.(12分)(2025·海南海口模拟)乳腺炎是畜牧业中的常见疾病,给全球乳制品行业带来了巨大的经济负担。研究人员利用基因编辑工具结合Cre/loxP系统,将炎症调节序列(IRS)靶向整合到山羊溶菌酶(LYZ)基因的启动子区域,成功培育出具有增强乳腺炎抗性的奶山羊,其操作过程如下图,回答下列问题。图1山羊胎儿成纤维细胞图2基因编辑奶山羊培育过程图注:①loxP是具有特异性序列的小DNA片段,自身不表达,也不影响其他基因表达。②P1为启动子;EGFP为绿色荧光蛋白基因;PuroR为嘌呤霉素筛选基因;T1为终止子;TSS是转录起始位点。(1)启动子位于基因的上游,紧挨着转录起始位点,其作用是

。

(2)Cre/loxP系统主要由Cre酶和loxP位点两部分组成。Cre酶可以识别并结合到loxP序列的特定区域,并断开特定部位两个核苷酸之间的键,然后将切口重新连接以敲除两个同向loxP间的DNA序列。从作用效果来看,Cre酶相当于基因工程中的基本工具中的。

(3)从生物安全的角度分析,最终利用Cre酶敲除外源EGFP和PuroR基因的意义是

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(4)PCR技术可从分子水平检测EGFP和PuroR基因是否被成功敲除。请简要的写出实验思路:

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(5)图2中涉及的生物技术有(答2点)。在胚胎移植前,需要对代孕母羊进行同期发情处理,其目的是

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5.(12分)(2025·广东二模)抗原检测技术在病毒感染筛查、病毒类型判断等多个方面均有应用,但传统检测技术成本较高。为降低成本,需开发新型抗原检测技术。我国科研人员以人畜共患的口蹄疫病毒FMDV为材料,将抗FMDV纳米抗体Nb205和抗鸡醛化红细胞(cRBC)纳米抗体NbRBC48的基因片段连接,构建双特异纳米抗体Nb20548,利用Nb20548建立可用于FMDV抗原检测的血凝方法。(1)科研人员采用重叠延伸PCR技术构建Nb205和NbRBC48融合基因,具体路线如图。本实验中linker为含6个氨基酸序列的连接肽,部分PCR引物见下表。引物名称引物序列(5'→3')P1CATATGGATGATGATGATGATGAG(有下划线的为NdeⅠ限制酶切割位点)P2GACCCCAGCTCCAAAGCTCCCAAAGCTCCCAACGGTCACTTGGGTP3AGCTTTGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCP4GCGGCCGCTGAGGAGACGGT(有下划线的为NotⅠ限制酶切割位点)①两个不同的基因得以融合的结构基础是。

②重叠延伸PCR技术是先分别PCR获得目的链1和目的链2,然后使用引物进行PCR获得融合基因。引物P2中决定linker的碱基序列是5'3'。

③在构建基因表达载体时,需用限制酶对质粒和Nb205linkerNbRBC48融合基因进行酶切。

(2)科研人员将重组质粒导入大肠杆菌表达并纯化获得双特异纳米抗体Nb20548,并对融合双抗的敏感性进行了检测,结果见图。结果表明

,说明融合双抗构建成功。

(3)在对融合双抗Nb20548进行推广前,还需进行的研究有

。

6.(10分)(2025·云南玉溪模拟)百合极易受到尖孢镰刀菌引起的枯萎病的影响。研究人员发现野生百合品种——岷江百合含有一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L使其对尖孢镰刀菌展现出强大的抗性,该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图甲所示。图乙是一种Ti质粒的结构示意图,其中基因gus编码的GUS酶活性可反映启动子活性。图甲图乙(1)图乙中启动子与复制原点的化学本质(填“相同”或“不同”)。

(2)为研究不同病原微生物对基因L的启动子pL活性的影响,科研人员利用转基因植物对其进行功能鉴定。①从图甲所示结构中选用酶切获取,再将其与图乙含有gus基因的Ti质粒重组构建转入农杆菌细胞中。

②将预培养的新鲜植物叶片与适宜浓度的已成功转化的农杆菌共培养可达到转化目的,原因是

。

③利用不同病原微生物侵染转基因成功的植物细胞,检测,比较出pL的活性。

(3)研究人员还发现某种抗病性弱的栽培百合中也有基因L,但其上游的启动子与岷江百合不同。若要提高该百合中基因L的表达量,培育具有高抗病能力的百合新品种,请结合题干信息简要写出实验思路:

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参考答案1.答案(1)使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸4(2)MunⅠ和XmaⅠ避免目的基因和质粒的反向连接;防止目的基因和质粒的自身环化(3)5'CAATTGTCTGTT3'5'CCCGGGCCTGGA3'(4)3、2解析(1)PCR扩增目的基因时,引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。PCR扩增利用的是DNA半保留复制的特点,因此第二轮扩增结束时,PCR反应体系中存在4种双链DNA。(2)不能选择EcoRⅠ酶切割质粒,因为该酶的识别序列在启动子中;也不能选择NheⅠ酶切割质粒,因为该酶的识别序列在质粒上有两个部位,因此需选择MunⅠ、XmaⅠ切割质粒。切割目的基因和质粒时均选用了两种限制酶,这样操作的优点是一方面可以避免目的基因和质粒的反向连接,另一方面还可防止目的基因和质粒的自身环化。(3)已知mRNA的序列为5'UCUGUUGAAUAU…(中间序列)…GCAUCAUCCAGG3',逆转录得到cDNA序列为5'CCTGGATGATGC…(中间序列)…ATATTCAACAGA3',利用PCR技术对cDNA进行扩增,PCR过程需要两种引物,能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合,并在A端、B端分别加入MunⅠ、XmaⅠ识别序列,故PCR扩增时所需引物的前12个碱基序列为5'CAATTGTCTGTT3'、5'CCCGGGCCTGGA3'。(4)结合题意并分析电泳结果可知,1号泳道加入的样品是基因表达载体中SBgLR基因的PCR产物,比较可得3号泳道为高赖氨酸玉米新品种的RTPCR扩增产物,野生型玉米中不含SBgLR基因,因此在电泳过程中未显示条带,对应2号泳道。2.答案(1)(引物)1和3仅能检测DNA分子的大小,无法确定其碱基序列(2)启动子都有规则的双螺旋结构病毒只能寄生在活细胞中(3)AD(4)悬浮昆虫细胞属于真核细胞表达系统,能对肽链进行正确的加工(盘曲折叠、组装、修饰),保证了表达蛋白的活性(答案合理即可)解析(1)PCR技术要求引物与模板链的3'端互补配对,且DNA聚合酶从引物的3'端开始延伸子链。启动子是一段位于基因编码链的5'端上游的DNA序列,转录时RNA聚合酶识别并结合启动子后,沿基因的模板链从3'→5'方向转录出mRNA,也即RNA聚合酶从编码链的5'端开始延伸子链。由图2可知,vpl基因模板链的3'端在右侧,因此vpl基因反转180°后才能与启动子准确连接,同时vpl基因和His基因的模板链位于一条链上,如下图。要判定vpl基因与His基因连接成的融合基因已准确连接,需要选择能扩增出融合基因的引物组合。因此,引物1和引物3可以分别与融合基因中vpl基因的3'端和His基因的3'端互补配对,从而扩增出准确连接的融合基因。若His基因反转180°后进行连接,如下图,则引物2和4能判定vpl基因与His基因连接成的融合基因存在,但该融合基因不能被启动子正确启动和表达。(2)基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因和标记基因。启动子位于目的基因的首端,终止子位于目的基因的尾端,昆虫高效表达外源基因与载体上的强启动子有关;外源基因和病毒DNA都具有规则的双螺旋结构,可以拼接;病毒只能寄生在活细胞中,因此构建重组病毒要在昆虫细胞系中共转染。(3)结合图示分析,外源基因与病毒DNA通过同源重组实现拼接,需要将Lef2和甲、乙基因互换,然后再将乙、vpl、Lef2及杆状病毒基因组连接到一起。SF9细胞中能合成重组杆状病毒而不能合成野生型杆状病毒,说明野生型杆状病毒具备的是△ORF,在进行共转染同源重组时,BAC线性DNA上的甲替换了重组转移载体质粒上的乙,使重组杆状病毒能在昆虫细胞中复制,说明乙为ORF,因此SF9细胞中只能合成重组杆状病毒而不能合成野生型杆状病毒,A项符合题意。线性DNA通过同源重组形成环状重组病毒,不是SF9细胞中能合成重组杆状病毒而不能合成野生型杆状病毒的原因,B项不符合题意。抗生素抗性基因作为标记基因,用于筛选重组质粒,与病毒生成无关,C项不符合题意。BAC线性DNA含杆状病毒基因组,才能提供病毒复制和包装所需的遗传物质,从而使得SF9细胞中能合成重组杆状病毒,D项符合题意。(4)为扩大疫苗产量,昆虫HF细胞应选择悬浮生长型细胞,原因是悬浮型生长的细胞可以更好地与营养物质、氧气等接触,有利于细胞的增殖以及快速高效表达。大肠杆菌缺乏真核细胞修饰加工系统,可能导致蛋白质错误折叠或抗原性丧失。与大肠杆菌为受体细胞相比,昆虫细胞属于真核细胞表达系统,能对肽链进行正确的加工(盘曲折叠、组装、修饰),保证了表达蛋白的活性,因此用昆虫细胞作为受体细胞生产VLP可更好的保留vpl蛋白的抗原性。3.答案(1)ENA1基因两侧的碱基序列耐高温的DNA聚合(或TaqDNA聚合)(2)1、4获得扩增产物(3)农杆菌转化法转基因大豆DNA的PCR产物ABar和ENA1基因已经分别转入受体大豆中,且在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传(4)草甘膦对植物生长的影响抗原—抗体杂交解析(1)利用PCR方法从酵母菌基因组中扩增ENA1基因时需根据ENA1基因两侧的碱基序列设计引物,PCR反应体系中除加入ENA1基因、4种脱氧核苷酸等物质外,还需加入耐高温的DNA聚合酶或TaqDNA聚合酶。(2)为了检测目的基因是否正向插入,可选用图中的引物1和引物4对其进行扩增,并对扩增产物进行电泳,若结果为获得扩增产物,则说明ENA1基因正向插入。(3)将目的基因导入植物细胞常采用的方法为农杆菌转化法。图中1组为标准对照组,2组为加水对照组,3组为加入野生型大豆DNA的PCR产物组,则4~7组为加入转基因大豆DNA的PCR产物组,已知ENA1基因扩增条带大小为550bp,Bar基因扩增条带大小为441bp,则图A表示扩增的基因为ENA1。连续三代PCR检测结果说明Bar和ENA1基因已经分别转入受体大豆中,且在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。(4)Bar基因为抗草甘膦基因,大豆在生长过程常喷洒草甘膦进行除草,推测该实验在转入ENA1基因的同时还转入Bar基因,目的是使转基因植物能够抗草甘膦,从而排除草甘膦对植物生长的影响。从分子水平检测转基因大豆体内目的基因是否完成了表达,可采用抗原—抗体杂交方法。4.答案(1)RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA(2)磷酸二酯限制酶和DNA连接酶(3)从生物安全性角度,切除FGFP和PuroR基因可避免其表达产物引发动物机体的免疫排斥反应;能防止基因漂移,避免这些外源基因传播到其他生物体内,防范对生态系统及生物多样性的潜在威胁(4)提取基因编辑后奶山羊细胞的基因组DNA;根据GFP和PuroR基因序列设计特异性引物以提取的DNA为模板进行PCR扩增;然后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(5)体细胞核移植技术、胚胎移植技术使胚胎在移植前后所处的生理环境保持一致,供体的胚胎移入受体后有相同或相似的生存条件解析(1)启动子位于基因的上游,紧挨着转录起始位点,是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA。(2)Cre酶可以识别并结合到loxP序列的特定区域,并断开特定部位两个核苷酸之间的磷酸二酯键,与基因工程中限制酶的作用相似;将切口重新连接以敲除两个同向loxP间的DNA序列,连接DNA片段,与DNA连接酶功能相似,因此从作用效果来看,Cre酶相当于基因工程中的基本工具中的限制酶和DNA连接酶。(3)EGFP为绿色荧光蛋白基因,PuroR为嘌呤霉素筛选基因,从生物安全性角度,切除FGFP和PuroR基因可避免其表达产物引发动物机体的免疫排斥反应;能防止基因漂移,避免这些外源基因传播到其他生物体内,防范对生态系统及生物多样性的潜在威胁。(4)若想用PCR技术从分子水平检测EGFP和PuroR基因是否被成功敲除,可提取基因编辑后奶山羊细胞的基因组DNA;根据EGFP和PuroR基因序列设计特异性引物以提取的DNA为模板进行PCR扩增;然后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。(5)图2中涉及的生物技术有动物细胞核移植技术、动物细胞培养、早期胚胎发育、胚胎移植等技术。在胚胎移植前,需要对代孕母羊进行同期发情处理,使胚胎在移植前后所处的生理环境保持一致,供体的胚胎移入受体后有相同或相似的生存条件。5.答案(1)①DNA分子具有双螺旋结构②P1和P4GACCCCAGCTCCAAAGCT③NdeⅠ、NotⅠ(2)Nb20548可同时与FMDV及cRBC反应,且反应性能与Nb205和NbRBC48无明显差异(3)与传统检测方法进行灵敏度或准确性或效率比较(检测方法的稳定性;与其他病毒有无交叉反应等)解析(1)①基因是有遗传效应的DNA片段,两个不同的基因得以融合的结构基础是具有相似的DNA结构,即DNA分子具有双螺旋结构。②结合图示可知,先分别用(P1、P2)与(P3、P4)扩增得到目的链1和目的链2,再仅使用P1、P4进行第二轮PCR即能获得融合基因;引物需要与模板的3'端结合,据图可知,引物P2中决定linker的碱基序列是5'GACCCCAGCTCCAAAGCT3',这段序列编码了连接肽的氨基酸序列,确保两