5.1、你真的了解微生物吗

厂QC

闫占宽你真的了解微生物吗年终总结你真的了解微生物吗分布不均匀，无处不在，微小不可见，耐受力强微生物很脆弱古细菌：常生活于热泉水、缺氧湖底、盐水湖等极端环境中的原核生物。现今最古老的生物群，为地球原始大气缺氧时代生存下来的活化石。MDD的困扰微生物标准制定一些考虑PMM的一些建议 微生物特点、影响生长繁殖因素 产品召回中的微生物分析

医药方面相关微生物微生物特性、影响生长繁殖因素

种类多、分布广

个体小，胃口大

繁殖快、转化快

适应强、易变异

人体微生物分布种类更衣顺序手掌的微生物培养结果：手掌的微生物培养结果洗手后一根头发的微生物培养结果消毒后人体微生物分布种类1014活的微生物，是人的一部分。其中皮肤有1012,口腔有1010,肠道1014.皮肤：表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌、科室葡萄球菌、棒状杆菌属、丙酸杆菌、痤疮杆菌、微球菌属。口腔：唾液链球菌，血液链球菌。毛发：毛癣菌属、表皮癣菌属、小孢子菌属。肠道：肠杆菌包括肠杆菌属,埃希菌菌属，乳酸杆菌，双歧杆菌，粪杆菌属，梭菌毛癣菌属表皮癣菌属小孢子菌属肠杆菌属埃希菌菌属乳酸杆菌双歧杆菌粪杆菌属梭菌唾液链球菌血液链球菌表皮葡萄球菌头状葡萄球菌科氏葡萄球菌棒状杆菌属丙酸杆菌痤疮杆菌微球菌属口腔皮肤肠道毛发微生物在空气中的分布空气本身缺乏微生物生活所必需的营养物，日光对微生物也具有很强的杀菌作用，空气般是干燥的，因此空气不是微生物生活的良（芽孢）空气中的微生物主要来源于带有微生物菌体及孢子的灰尘，这类微生物大人和动物通过呼吸道排出的，其中也包含有病原微生物，悬浮在大气中。

空气中存在较多的、存活时间较长的是各种真菌、放线菌的孢子及细菌芽胞。如果洁净区环境空气中检测出来的绝大部分是G+球菌，和普通空气中的分布是不同的，显然是人员散发出来的。微生物特性、影响生长繁殖因素

种类多、分布广

个体小，胃口大

繁殖快、转化快

适应强、易变异

细菌的大小图微生物特性、影响生长繁殖因素

种类多、分布广

个体小，胃口大

繁殖快、转化快

适应强、易变异

1、原辅料检测时间长，导致的采购、生产压力；2、成品延长放行周期，增加了库存成本和市场销售压力。3、许多非无菌药品的微生物污染可能性很低，因此测试的价值不大。为什么想要减少微生物限度测试?水分活性:水分活性是对游离水的测定，不包括对结合水。降低水分活性对微生物生长的作用：较长的停滞期、较慢的生长速度、较少的稳定期的微生物数量，减少微生物毒素的产生在某个微生物专有的水分活性以下，该微生物不会生长水分活性下降后，微生物的耐热性会提高不在低水分活性的产品中增殖，但会存活在产品中水分活性

(Aw)微生物0.97铜绿假单胞菌0.95大肠埃希菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌0.90枯草芽孢杆菌0.86金黄色葡萄球菌0.75嗜盐菌杆

固体原0.90啤酒酵母

辅料0.77黑曲霉菌（巴西曲霉）（较嗜高温）0.62鲁氏接合酵母

(嗜高渗压酵母)

0.61嗜干酵母

。USP

<1112>产品水分活度最可能的污建议的测试鼻腔吸入剂0.99革兰氏阴性菌TAMC，TCYMC，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞洗发香波0.99革兰氏阴性菌TAMC，TCYMC，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌抗酸剂0.99革兰氏阴性菌TAMC，TCYMC，大肠埃希菌，沙门氏菌局部乳剂0.97革兰氏阴性菌TAMC，TCYMC，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌口服液0.90革兰氏阳性菌及真菌TAMC，TCYMC口服混悬剂0.87真菌TAMC，TCYMC局部膏剂0.55无减少测试唇用软膏0.36无减少测试阴道/直肠栓剂0.30无减少测试片剂0.36无减少测试充液胶囊0.30无减少测试USP

<1112>《药品GMP指南：质量控制实验室与物料管理》制剂成品A：检验数据不足以证明其风险水平的产品。新的产品及配方或生产过程发生重大变化的产品。生产过五批之后，再按照下面B类（高风险）或C类（低风险）来进行分类。B：高风险产品。所有微生物结果超标的产品。C：低风险产品。至少最近五批没有发生微生物结果超标。产品类型检验频次放行的可行性A头五批微生物检查结果必需为批发放依据B每一批或每一阶段微生物检查结果必需为批发放依据C每季度或每五批，取二者频次最高微生物检查结果不需为批发放依据产品类型标准检验频次1原料非常关键，要求强检每批均检2原料不关键每五批检一次或每年检一批3物料的种类及工艺过程决定其受污染的可能性很低无需检验4新物料初始每批均检，直至可以评估其风险水平并设定相应检验频次原料第一类是药典中要求强制检验微生物的原料以及起始原料是植物、动物的原料。第二类（随机取样）在生产过程中经过提取且可靠消毒的天然物质及合成的物质。可以认为是低风险类的（如硝酸）。《药品GMP指南：质量控制实验室与物料管理》否按照协调后药典的附录制订微生物限度认可标准是否有科学证明减少步骤会造成在原辅料中微生物量＜认可标准限度（未检出常见指示菌）

？所监控的微生物量/指示菌是否低于规定限度是抽批检验微物和指示菌否微生物是否能在原料药或赋形剂中生长或存活是原辅料/赋形剂的合成工艺相关步骤本身是否会减少微生物是是提供支持性数据，

不需要做微生物限度检查及不必制订认可标准判断图1

原料药和赋形剂的微生物检查否否提供支持性资料，

不需要做微生物限度检查和不必制定认可标准按照协调后药典的各论制定微生物限度认可标准不需要进一步做微生物限度检查及不必制订认可标准ICHQ6A逐批检验微物和指示菌原辅料或赋形剂是否无菌？是否<>进行逐批微生物试验是否有科学依据证明制剂有抑制微生物生长的特性是不必制订微生物限度认可标准，

也不必做该项检查是否每批都符合微生物限度标准水分活度否是提供科学依据可以不进行常规微生物实验或抽批检验微生物限度是药物制剂中是否含有抗微生物防腐剂或本身是否含有抗微生物能力否否制剂是否为干剂型?(如：

固体口服制剂或干混悬剂)制定防腐剂（化学）

认可标准和论证低于或等于制定的最小防腐剂浓度时是否有效，

并证明制剂本身抗微生物能力根据协调后药典各论制订微生物限度认可标准判断图2非无菌制剂的微生物检查是否否影响微生物生长繁殖的因素医学微生物研究方面

接近人体温度范围的微生物温度下能够生长的微生物能感染人体。所以培养温度的范围内。（这样的温度能培养出环境中的所有微生物？）G-细菌（可以生长℃的水中）存在于水中，并且是内毒素的来源，所以也是研究对象。人体—心环境EM培养策略细菌形态球状

杆状弧形或螺旋形在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表达活菌的数量什么是一个CFUCFU，计数可以变多也可以变少金黄色葡萄球菌链球菌随着微生物增加，拥挤现象会降低估计值（争夺营养、空间）随着微生物减少，随机误差影响越来越大，导致不准确的估计一团菌、培养基种类、培养温度、微生物受损平皿计数上限

平皿计数下限计数范围USP

<1227>1、标准琼脂平皿上的可计数菌落的接受标准对大多数细菌和白色念珠菌是25至250。该范围由食品工业在计数牛奶中的大肠细菌时建立2、对黑曲霉菌的建议计数范围是8-80CFU/皿。3、环境中分离的微生物的计数范围应该经过验证USP<55>

recommends

a

rangeof30to

300colonies,

but

not

lessthan

6

(50%

to

300%

recovery)ASTM

providescountablerangesof20-80CPU/membrane（膜）,20-200for

spread

plates（涂布）,and

30-300forpour

plates

（注皿）FDA

(BAM)

recommends25-250CPU/plateasacountable

rangeCited：Scott

Sutton,

Accuracy

of

Plate

Counts计数上限ASTM大于上限报告上限结果，如1:10稀释，涂布计数210CFU，报告>2,000CFU/mL（无法计数）计数下限ASTM无菌落生长报告稀释级别，有菌落生产但低于可计数范围，报告估计值FDA

BAM所有的原始数据会被记录，但是报告的时候只需要报告低于定量限，例如1:100，菌落是18、

12，则报告低于2500CFU。）平均值计算USP

andASTM

四舍五入BAM四舍六入五成双计数上限/下限Cited：Scott

Sutton,

Accuracy

of

Plate

CountsG-细菌细胞壁薄，主

要成分是LPS，有致热作用，是细菌内毒素

有效成分。革兰氏染色呈红色G+细菌细胞壁厚，主

要成分是肽聚

糖，占细胞干重的50%~80%.革兰氏染色呈

紫色细菌结构（染色）天然内毒素vs

LPS细菌生长周期无菌检查14天，痤疮杆菌生物指示剂培养时间酵母菌、霉菌典型的酵母是椭圆形，细胞壁主要是结构性多糖，葡聚糖占细胞壁干重50%~60%，甘露糖占15%~23%。葡聚糖主要以β-1,6-葡聚糖、

β-1,3-葡聚糖（内毒素检验假阳性）、

β-1,3-β-1,6-葡聚糖和壳

多糖的混合物。（葡聚糖反应激活步骤少，延滞期短，速率低）菌落形态：大，疏松，绒毛状，絮状，蜘蛛网状，初期无色，后期产生孢子有颜色什么会向洁净区引入霉菌霉菌菌落EM结果没有霉菌，并不代表环境中真的没有。可能是由于EM程序中缺少真菌特异性的监测。对真菌的警戒限缺乏真正的了解，最终导致污染。1、丝状真菌更容易漂浮在空气中而不是附着在表面上，这是它们主要的传播途径。2、室内或厂房设备里面被丝状真菌污染，通常认为是曲霉属。洁净区，高枝孢菌和青霉菌常见，曲霉菌较少。3、

回收种类方面、回收数量方面，SDA最好。实际环境监测，某些霉菌不能在SDA上生长，并不是说SDA不支持他们生长，可能是在洁净区处于亚致死状态，实验室复增后，就能够生长。一些在医药方面有价值的微生物微生物名称特征药用价值放线菌G+，丝状杆菌抗生素生产

嗜热脂肪芽孢杆菌G+,杆菌、需氧，产芽孢湿热灭菌验证

枯草芽孢杆菌G+，杆菌，需氧，产芽孢湿热灭菌验证、环氧乙烷灭菌验证短小芽孢杆菌G+，杆菌，需氧，产芽孢射线灭菌验证0.1um缺陷短波单胞菌G-，微需氧、杆菌0.22um滤芯截留实验

生孢梭菌G+，杆菌，厌氧，产芽孢确认厌氧的生长条件大肠杆菌G-，肠杆菌，兼性厌氧生产内毒素标准品，防腐效力极限测试Julie

Schwedock，Brevundimonas

diminuta

isnot

always

sodiminutive

Growthconditionsaffectsize.（PMF）生物指示剂选择广泛存在于环境中，如水中，人畜的肠道、粪便中 ,所以把大肠埃希菌作为药品有没有受到污染的一种指标菌几乎所有的原辅料都需要检测大肠埃希菌，若检测出大肠埃希菌，说明药品很有可能已经被污染。大肠埃希菌大肠埃希菌金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。可引起局部化脓感染局部用剂会控制金黄色葡萄球菌，成品、原辅料的控制策略均要检测金黄色葡萄球菌，纯化水也需要检查金黄色葡萄球菌。G+阳性，耐高渗透压，甘露醇氯化钠培养基金黄色葡萄球菌金黄色

葡萄球菌在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。

各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。经常引起术后伤口感染

，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中

耳炎等对季铵盐类消毒剂抗性很强，如新洁尔灭（荧光假单胞菌）溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患

病之一部分辅料要求检查沙门氏菌。例如USP中，硬脂酸镁就要求每10g样品中不得检出沙门氏菌(Ch.p未要求)。动物源类原辅料要检测，例如胶囊沙门氏菌沙门氏菌非无菌产品（134批）产品召回1998~2006无菌产品(193批)G-细菌60%G+细菌4%霉菌酵母菌

23%缺乏无菌保障78%霉菌酵母菌

7%G-细菌6%G+细菌1%1998~2006FDA产品召回情况Cited

：LUIS

JIMENEZ

：Microbial

Diversity

in

Pharmaceutical

Product

Recalls

and

Environments

PDA2007洋葱伯克霍尔德菌，假单胞菌属、皮氏

罗尔斯顿氏菌占48%R2A培养基比营养琼脂检出多（菌落特点，小、透明、反光）有很多菌，在R2A也不能形成肉眼可见的菌落，荧光方法可以。还有很多菌，荧光法也不可以，但16sRNA可以（VBNC微生物）R2A培养基平皿计数如何操作？Milliflex®

Quantum–

Detection

of

Microbial

Contaminants

inWaterSamples无菌产品78%缺乏保证，6%G-细菌，1%G+细菌。洋葱伯克霍尔德菌占比

2.2%。霉菌酵母菌占比7%，主要是青霉菌属和曲霉菌属。主要是人员操作，环境缺乏控制，或者设计缺陷有关。

（环境很少出现霉菌，霉菌召回比却很高？）从1998到2006.09没有召回是由于单独G+细菌（人员皮肤如葡萄球菌、棒状杆菌、丙酸杆菌）污染造成的。只有1%召回是含有G+菌。无菌制剂1、药用辅料标准的制定起始原料来源：可分为合成；半合成；来自植物，动物，矿物材料。制造过程：加工过程分轻微加工和高度加工硬脂酸镁：通过氯化镁和硬脂酸钠水溶液作用。原料硬脂酸来自动物脂肪或棉籽油。通过水解脂肪制造，在高温水逆流，所得的混合物是由真空蒸汽蒸馏纯化的馏分，然后用选择性溶剂分离。硬脂酸也可由棉籽和其他植物油加氢生产；通过加氢和随后的皂化油脂从乙醇重结晶；从食用油脂与氢

氧化钠煮沸，分离甘油，用硫酸或盐酸分解得到肥皂。冷却后，硬脂酸与油酸随后分离。基于制造过程，是极不可能的包含微生物负载，更不用说沙门和大肠。此外它是疏水的，水分活度0.490，不支持微生物的生长。润滑成分一般是0.5~2.5%，是一个次要成分，硬脂酸镁的微生物要求应该取消。）2、新的辅料控制菌标准制定依据厂家标准制定？微生物标准制定一些考虑cited:ANTHONY

M.

CUNDELL,Ph.D.Managing

the

MicrobiologicalQuality

of

Pharmaceutical

Excipients3、清洗验证中微生物标准的制定清洗后的标准：表面监测：计算出来≥50CFU/cm2或≥1250CFU/g，按照厂房标准：1-2CFU/cm2（非无菌药品，无菌药品更容易实现，否则不符合GMP）冲洗水：水的标准做为合格标准。有害菌：

从以下结果方面考虑：种类、数量、剂型（局部用剂、吸入剂）

，用途，患者人群（艾滋病患者）

，给药途径，对病人安全的影响，对产品稳定性的

影响，容器/密闭的完整性，和活性成分的生物利用度。存放后的标准最主要的预防措施是保持干燥，NMT

1CFU/cm2

（原标准）和不超过1lg的增加，这两个标准可以联合制定标准，以严格的为准。