外泌体分离技术实验操作指南

外泌体分离技术实验操作指南外泌体作为细胞分泌的纳米级囊泡，承载蛋白质、核酸、脂质等生物分子，在细胞通讯、疾病诊断与治疗中展现出巨大潜力。高效、纯净的外泌体分离是后续功能研究、标志物筛选的核心前提。不同分离技术基于外泌体的理化特性（如粒径、密度、表面标志物）设计，需结合实验目的、样本类型与通量需求灵活选择。本文系统梳理主流分离技术的操作细节、质控要点与实践经验，助力研究者优化实验流程。一、实验原理概述外泌体直径约____nm，密度介于1.13-1.19g/mL（蔗糖密度梯度中对应10%-40%蔗糖层），表面富集CD9、CD63、TSG101等标志物。主流分离技术的原理如下：超速离心法：利用外泌体与其他颗粒的沉降系数差异，通过逐级提高离心力去除细胞碎片、凋亡小体等杂质，最终富集外泌体。密度梯度离心法：基于外泌体与污染物的密度差异，在连续/不连续密度梯度中，外泌体会在特定密度层富集，有效去除蛋白聚集体、杂囊泡。试剂盒法（聚合物沉淀/免疫亲和）：聚合物（如PEG）通过空间位阻效应促进外泌体聚集沉淀；免疫亲和法则利用抗体-抗原特异性结合，从复杂样本中捕获靶向外泌体。微流控法：通过微通道内的流体动力、电场或亲和作用，基于粒径、电荷或表面标志物实现外泌体的高通量、快速分离。二、材料准备（一）超速离心法仪器：冷冻超速离心机（如BeckmanOptima系列，配备SW41Ti或Type70Ti转子）、台式高速离心机、电子天平、超净工作台、涡旋振荡器、移液器。试剂：无外泌体胎牛血清（用于细胞培养上清制备）、PBS（pH7.4，无钙镁）、0.22μm滤膜、超速离心管（如Beckman____，需提前硅化以减少外泌体吸附）。（二）密度梯度离心法试剂：蔗糖（分析纯，需用无外泌体水配置）、Tris-HCl（pH7.4）、EDTA、蛋白酶抑制剂（如PMSF）、0.22μm滤膜。（三）试剂盒法（以聚合物沉淀为例）仪器：台式高速离心机、涡旋振荡器、移液器。试剂：外泌体沉淀试剂盒（如InvitrogenTotalExosomeIsolationReagent）、PBS、蛋白酶抑制剂。（四）微流控法仪器：微流控泵系统（如ElveflowOB1MK3+）、荧光显微镜（可选，用于可视化）、微量紫外分光光度计（如NanoDrop）。试剂：微流控芯片（如ExoQuick微流控芯片，或定制化芯片）、PBS、荧光染料（如PKH67，可选）、洗脱缓冲液（按芯片说明书）。三、操作步骤详解（一）超速离心法操作流程1.样本预处理细胞培养上清：收集对数生长期细胞的无血清培养基（或含无外泌体血清的培养基），4℃下300g离心10min（去除细胞），取上清；2000g离心10min（去除细胞碎片），取上清；____g离心30min（去除大囊泡、蛋白聚集体），取上清过0.22μm滤膜，收集滤液。血清/血浆：室温静置30min后，4℃下3000g离心15min（去除血细胞），取上清过0.22μm滤膜（若样本粘稠，可先____g离心10min）。*注：预处理的离心条件需根据样本类型优化，过度离心可能导致外泌体损失。*2.超速离心分离将预处理后的样本转移至硅化的超速离心管，4℃下____g离心70min（转子需预冷至4℃）。离心结束后，弃上清，管底可见少量白色沉淀（外泌体）。若需去除蛋白污染，可加入1mL预冷PBS重悬沉淀，再次4℃下____g离心70min，弃上清。3.外泌体重悬与保存加入适量PBS（或实验所需缓冲液），用宽口枪头轻柔吹打沉淀（避免产生气泡），涡旋振荡1-2min使外泌体充分分散。分离的外泌体可立即用于实验，或分装后-80℃保存（避免反复冻融）。（二）密度梯度离心法操作流程1.密度梯度制备配置不同浓度的蔗糖溶液（如10%、20%、30%、40%，w/v，溶于Tris-EDTA缓冲液），使用梯度生成器制备连续密度梯度（从10%到40%），缓慢注入超速离心管（避免分层）。室温静置30min使梯度稳定，或4℃过夜。2.样本加载与离心将预处理后的样本（约1mL）缓慢铺在梯度液上方（避免扰动梯度），4℃下____g离心16h（或根据样本调整时间，如12h）。3.外泌体收集与纯化离心结束后，用1mL注射器从管底向上穿刺，每0.5mL收集一个组分（共8-10管）。通过NTA或Westernblot检测各组分的外泌体标志物，确定目标层（通常在30%-40%蔗糖层附近）。收集目标组分，用PBS稀释后，4℃下____g离心70min，弃上清，重悬沉淀（同超速离心法）。（三）试剂盒法操作流程1.样本预处理同超速离心法的样本预处理步骤，确保样本无细胞碎片和大颗粒。2.沉淀反应与离心按试剂盒说明书比例混合样本与沉淀试剂（如1:5体积比），4℃孵育过夜（或室温30min，根据试剂调整）。4℃下____g离心1h，弃上清，管底可见白色沉淀（外泌体及少量蛋白）。3.外泌体重悬与洗涤加入____μLPBS重悬沉淀，若需去除蛋白污染，可加入1mLPBS，4℃下____g离心30min，弃上清，再次重悬。（四）微流控法操作流程1.芯片准备与样本预处理用PBS冲洗微流控芯片通道（流速10μL/min，持续5min），确保通道无气泡。样本经0.22μm滤膜过滤后，加入荧光染料（如PKH67）孵育30min（可选，用于追踪），或直接上样。2.上样与分离将样本注入芯片进样口，设置流速（如5-10μL/min），利用芯片内的尺寸排阻或亲和捕获结构分离外泌体。若为免疫捕获芯片，需提前用抗体包被通道（按说明书操作）；若为尺寸排阻芯片，外泌体会在特定通道出口富集。3.外泌体收集与洗脱从目标出口收集外泌体组分，若为亲和捕获，需用洗脱缓冲液（如含甘氨酸的低pH缓冲液）洗脱，立即用中性缓冲液中和。四、质量控制策略（一）形态学验证（透射电镜，TEM）取10μL外泌体悬液，滴加至铜网上，静置5min后吸去多余液体；滴加2%磷钨酸染色5min，自然干燥后电镜观察。合格外泌体应呈现典型杯状或圆形结构，粒径____nm。（二）粒径与浓度分析（纳米颗粒跟踪分析，NTA）稀释外泌体悬液至合适浓度（如1×10^8particles/mL），注入NTA仪器，检测粒径分布（主峰应在____nm）和浓度（与理论值无数量级差异）。（三）标志物检测（Westernblot）提取外泌体蛋白，进行SDS电泳，转膜后用CD63、CD9、TSG101抗体孵育，阳性条带表明外泌体富集；同时检测Calnexin（细胞内膜标志物），若条带微弱则说明纯度较高。（四）蛋白定量（BCA法）取20μL外泌体悬液，按BCA试剂盒说明书操作，蛋白浓度应与NTA浓度趋势一致（通常1×10^9particles对应10-50μg蛋白）。五、关键注意事项1.样本处理：避免反复冻融样本，采集后尽快处理；细胞培养上清需用无外泌体血清，防止外源囊泡干扰。2.离心操作：超速离心管需严格平衡（误差<0.1g），离心结束后尽快取出样本，防止外泌体重新溶解。3.耗材选择：硅化离心管、低蛋白吸附枪头可减少外泌体损失；微流控芯片需定期清洗，防止通道堵塞。4.试剂新鲜度：蔗糖溶液需现配现用，避免细菌污染；试剂盒试剂需按说明书保存，过期后弃用。六、常见问题及解决策略（一）外泌体浓度低原因：样本量不足、离心时间过短、重悬不充分。解决：增加样本量（如细胞上清收集24h以上）；延长超速离心时间（如从70min增至90min）；用宽口枪头反复轻柔吹打沉淀。（二）纯度差（蛋白污染严重）原因：预处理离心不充分、密度梯度浓度不当。解决：增加预处理离心步骤（如____g离心时间从30min增至60min）；调整蔗糖梯度浓度（如增加40%蔗糖层比例）。（三）外泌体破裂原因：离心力过大、重悬时机械力过强。解决：降低超速离心速度（如从____g降至____g，需验证分离效果）；用剪切力小的枪头（如宽口或剪去尖端的枪头）重悬。七、应用场景与技术选择建议基础研究/大量样本：优先选择超速离心法或密度梯度离心法，成本低、分离效果稳定，但耗时较长。临床样本/快速分离：推荐试剂盒法（如聚合物沉淀），操作简便、通量高，但纯度略低，需结合质控优化。单细胞分析/高通量筛选：选择微