尼帕病毒实验室检测技术方案（2021版）

尼帕病毒实验室检测技术方案

（2021版）演讲人：医学生文献学习概述01一、病毒基础信息分类：副粘病毒科

亨尼帕病毒属，单血清型，分M亚型（马来西亚亚型）、B亚型（孟加拉亚型）。形态结构：病毒颗粒多形性，直径150-300nm外层为脂蛋白包膜，核衣壳螺旋对称。基因组：单股负链RNA，全长约18.2kb。二、实验室检测方法及生物安全要求实验室检测方法包括病毒核酸检测、抗体检测（IgM、IgG、中和抗体等）、病毒分离。生物安全要求病毒分离培养：需在生物安全四级（BSL-4）实验室进行。样本检测：采集的病毒相关样本，需在生物安全三级（BSL-3）实验室灭活后，方可开展检测。检测对象02检测对象疑似病例、确诊病例及其密切接触者。涉疫地区的媒介生物（果蝠、猪等）和食品（猪肉制品、水果蔬菜等）；原产地近期涉疫的进口食品（猪肉制品、水果蔬菜等）。技术人员基本要求03一、采样人员需经生物安全培训并合格。熟悉标本种类、采集方法，熟练掌握采集操作流程及注意事项。规范记录标本信息，确保标本质量达标、标本及相关信息可追溯。二、检测人员需经生物安全培训并合格。熟悉标本种类、标本处理流程及对应检测技术。能及时、熟练完成实验及结果报告，保障结果准确性。标本采集、保存和运输04一、病例标本采集脑脊液标本采集：临床医师无菌腰椎穿刺抽取，留取于3支无菌试管，每管1～2ml。保存与用途：装入带螺旋盖、内有垫圈的冻存管，标记清晰后低温保存1管用于本地/本省BSL-3实验室检测，2管供上级疾控机构复核。一、病例标本采集血液标本采集：临床医师用无菌真空干燥管，采集3管非抗凝血（每管5ml）尽可能采集双份，间隔14天为宜，住院病例可于入院当天和出院前1天各采1份。保存与用途：标记后立即4～8℃暂存，血清析出后转入-20～-80℃冻存1管用于本地/本省BSL-3实验室检测，2管供上级疾控机构复核。一、病例标本采集鼻拭子、咽拭子采集：采样人员按标准操作，为被采集者采集3份样本。保存与用途：分别放入带螺旋盖、内有垫圈且含2～3ml病毒保存液的采集管1管用于本地/本省BSL-3实验室检测，2管供上级疾控机构复核。一、病例标本采集尿液标本采集：采集15ml尿液，分装3管（每管5ml）。保存与用途：装入带螺旋盖、内有垫圈的无菌15ml离心管1管用于本地/本省BSL-3实验室检测，2管供上级疾控机构复核。二、果蝠、猪、进口食品标本采集采集对象及样本：疫区果蝠的唾液、尿液疫区养殖场生猪的鼻-咽拭子、血清疫区进口冷冻猪肉制品、水果蔬菜的表面。记录与分装：填写媒介标本采集信息表，按采集地点、种类分装。三、标本保存、运送保存：24小时内可检测的标本置于2～8℃冰箱无法及时检测的尽快放入-20～-80℃冰箱。运送：低温冷藏运输，避免冻融，严格遵守国家一类病原体生物安全运输规定。实验室资质要求05一、实验室资质要求酸检测实验室需符合《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院令第424号）、《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医政发〔2010〕194号）规定。具备卫生健康行政部门审核备案的BSL-3及以上实验室条件，同时满足临床基因扩增检验实验室条件。独立设置的医学检验实验室，还需符合《医学检验实验室基本标准（试行）》《医学检验实验室管理规范（试行）》等要求。二、实验室分区要求核心分区（物理空间完全独立、无空气直接相通）及功能试剂储存和准备区：试剂制备、分装，扩增反应混合液制备，离心管、吸头等消耗品贮存与准备。标本制备区：转运桶开启、标本灭活、核酸提取及加入扩增反应管。扩增和产物分析区：核酸扩增、产物分析。区域合并原则：使用标本处理、核酸提取及扩增检测一体化自动化分析仪时，可合并标本制备区与扩增和产物分析区。三、主要仪器设备需配备与检验项目适配的设备，包括核酸提取仪、医用PCR扩增仪、生物安全柜、病毒灭活设备（如水浴锅）、试剂及标本保存用冰箱/冰柜、离心机等。实验室检测方法06一、核酸检测试剂准备试剂盒选择：优先选用国家药品监督管理部门批准试剂盒（国内暂无），或参考国际通用尼帕病毒实验室检测方法配套要求：标本保存液、核酸提取试剂，需使用试剂盒说明书建议的配套试剂关键注意事项：核酸提取方法与标本保存液、灭活方式相关磁珠法、一步法提取试剂易受胍盐或保存液特殊成分影响，其中一步法需搭配试剂厂家配套标本保存液一、核酸检测标本前处理含胍盐灭活型标本保存液：无需额外灭活，直接开展核酸提取非灭活型标本保存液：需进行灭活处理，可选56℃孵育30分钟热灭活，或采用化学灭活方式核酸提取操作环境：全程在生物安全柜内进行操作步骤：取出灭活后标本，打开标本采集管加样核酸提取完成后，立即对提取物封盖随后将提取核酸加入核酸检测反应体系一、核酸检测适用范围：各类临床标本、环境标本推荐机构：世界动物卫生组织（WorldOrganisationforAnimalHealth，OIE）；检测原理：TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法靶基因：尼帕病毒N基因核酸检测方法一（实时荧光定量RT-PCR方法）一、核酸检测引物、探针序列核酸检测方法一（实时荧光定量RT-PCR方法）表1尼帕病毒实时荧光定量RT-PCR引物及探针信息检测名称引物/探针类型序列（5'—3'）NiV_TQM_N上游引物TCA-GCA-GGA-AGG-CAA-GAG-AGT-AA下游引物CCC-CTT-CAT-CGA-TAT-CTT-GAT-CA荧光探针FAM-CCT-CCA-ATG-AGC-ACA-CCT-CCT-GCA-G-TAMRA一、核酸检测反应条件以QIAGEN公司OneStepRT-PCR试剂盒为例，反应体系与反应程序如下，每次检测需同步配制阳性对照、阴性对照作为质控核酸检测方法一（实时荧光定量RT-PCR方法）尼帕病毒实时荧光定量RT-PCR反应体系（1）试剂类型工作浓度体积5×OneStepRT-PCRBuffer5×5µLdNTPMix每种dNTP各10mM1µLOneStepRT-PCREnzymeMix------1µL上游引物10µM1µL下游引物10µM1µL探针5µM1µL待测样本核酸/阳性对照/阴性对照------1～5µL无核酶水------补至25µL总体积25µL一、核酸检测反应条件以QIAGEN公司OneStepRT-PCR试剂盒为例，反应体系与反应程序如下，每次检测需同步配制阳性对照、阴性对照作为质控核酸检测方法一（实时荧光定量RT-PCR方法）尼帕病毒实时荧光定量RT-PCR反应程序（1）步骤反应条件循环数1.反转录阶段（ReverseTranscription）50℃,30分钟；95℃,15分钟无循环2.扩增阶段（PolymeraseChainReaction）95℃,30秒；55℃,30秒；72℃,60秒（读取荧光信号）40循环一、核酸检测检测结果判读检测有效性判读（需同时满足）：①

阳性对照Ct值<35②

阴性对照无Ct值（无扩增曲线）任一条件不满足，结果无效待测标本结果判读：①Ct值<35→尼帕病毒阳性②Ct值>38→尼帕病毒阴性③35≤Ct值≤38→重新提取核酸复核核酸检测方法一（实时荧光定量RT-PCR方法）一、核酸检测适用范围：各类临床标本、环境标本推荐机构：中国疾病预防控制中心检测原理：TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法靶基因：尼帕病毒N基因核酸检测方法二（实时荧光定量RT-PCR方法）一、核酸检测引物、探针序列核酸检测方法二（实时荧光定量RT-PCR方法）表1尼帕病毒实时荧光定量RT-PCR引物及探针信息检测名称引物/探针类型序列（5'—3'）NiV_TQM_N上游引物GAACTAACATTRTTTGCACTTGATGTG下游引物GTGTAAAAGCAGCTCCAACTTTC荧光探针HEX-ATCTCCGAGTGCWGCCGAGTCAA-BHQ1一、核酸检测反应条件以Thermo公司TaqPath™1-StepMultiplexMasterMix试剂盒为例，反应体系与反应程序如下，每次检测需同步配制阳性对照、阴性对照作为质控核酸检测方法二（实时荧光定量RT-PCR方法）尼帕病毒实时荧光定量RT-PCR反应体系（2）试剂类型工作浓度体积4×TaqPath™1-StepMultiplexMasterMix4×5µL上游引物10µM1µL下游引物10µM1µL探针5µM1µL待测样本核酸/阳性对照/阴性对照------1～5µL无核酶水------补至20µL总体积20µL一、核酸检测反应条件以Thermo公司TaqPath™1-StepMultiplexMasterMix试剂盒为例，反应体系与反应程序如下，每次检测需同步配制阳性对照、阴性对照作为质控核酸检测方法二（实时荧光定量RT-PCR方法）尼帕病毒实时荧光定量RT-PCR反应程序（2）步骤反应条件循环数1.反转录阶段（ReverseTranscription）25℃,2分钟50℃,10分钟95℃,2分钟无循环2.扩增阶段（PolymeraseChainReaction）95℃,15秒60℃,60秒（读取荧光信号）40循环一、核酸检测检测结果判读检测有效性判读（需同时满足）：①

阳性对照Ct值<35②

阴性对照无Ct值（无扩增曲线）任一条件不满足，结果无效待测标本结果判读：①Ct值<35→

尼帕病毒阳性②Ct值>38→

尼帕病毒阴性③35≤Ct值≤38→

重新提取核酸复核核酸检测方法二（实时荧光定量RT-PCR方法）二、血清学检测方法核心问题：尼帕病毒与亨尼帕毒属其他病毒（如亨德拉病毒）存在血清学交叉反应，易导致假阳性结果试剂盒现状：目前无商业化血清学检测试剂盒三、病毒分离核心地位：病毒核酸阳性标本需做病毒分离分离出尼帕病毒是本病感染的确证性指标适用标本（包括但不限于）人体标本：血清、脑脊液、鼻拭子、咽拭子、尿液、脑组织病猪标本：肺、肾等组织三、病毒分离标本前处理（按标本类型区分）组织标本：称重后，按重量/体积比（W/V）=10，加10倍体积磷酸盐缓冲液（PBS）混匀，组织研磨器匀浆破碎血清标本：加10倍体积磷酸盐缓冲液（PBS）稀释其他体液标本：无需特殊处理三、病毒分离分离培养流程标本过滤：处理后标本经0.22μm无菌滤器过滤接种培养：常规接种至Vero细胞培养病毒获取：细胞发生病变形成合胞体时，即可获得病毒三、病毒分离病毒分离相关补充已成功分离部位：脑脊液、尿液、鼻咽腔分泌物；不同部位分离病毒基因组特征一致生物安全要求：尼帕病毒毒力高、传染性强，所有病毒培养及扩增相关实验，均需在生物安全4级实验室（BSL-4）

内开展生物安全07生物安全病毒危害程度分类：依据我国《人间传染的病原微生物名录》，尼帕病毒危害程度属第一类实验室操作生物安全级别要求（按操作材料分类）病毒分离、培养等涉及活病毒的操作：生物安全四级实验室（BSL-4）未经培养的感染材料操作：生物安全三级实验室（BSL-3）灭活材料操作：生物安全二级实验室（BSL-2）无感染性材料操作：生物安全一级实验室（BSL-1）活病毒动物实验：动物生物安全四级