胶原蛋白酶的研究进展模板

资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。胶原蛋白酶的研究进展三亿文库设为首页\o"将本站加入到您的收藏夹"收藏本站首页\o"考试资料"考试资料\o"幻灯片"幻灯片\o"工程技术"工程技术\o"公务员考试"公务员考试\o"小学教学"小学教学\o"中学教学"中学教学\o"大学教学"大学教学\o"外语资料"外语资料36胶原蛋白酶的研究进展胶原蛋白酶的研究进展;摘要:胶原蛋白特有的三股螺旋结构使其难于被人体吸;关键词:胶原蛋白酶,作用机理,影响因素;Abstract:Thenutritionala;Keywords:collagenproteas;胶原蛋白是人体内含量最多、分布最广泛的蛋白质,是;加［4］［1－3］和生物活性等特性,被愈来愈多的;[5-6]抗疲劳等生理调节功能的小肽,是极具发展胶原蛋白酶的研究进展摘要:胶原蛋白特有的三股螺旋结构使其难于被人体吸收,将胶原蛋白水解为胶原多肽后,可显著提高其营养及生理功能,胶原蛋白酶是一种价值很高的蛋白酶种。本文介绍了胶原蛋白酶的定义、选择、影响因素。作用机理等,并展望其研究方向。关键词:胶原蛋白酶,作用机理,影响因素Abstract:Thenutritionalandphysiologicalfunctionofcollagenproteincanbesignificantlyimprovedviachemicalorenzymatichydrolysis,asthecollagenproteinwasdifficulttobeabsorbedbyhumanbodyduetothetriplehelicalcharacteristicmoleculesstructure.Collagenproteaseisakindofhighvalueofprotease.Inthispaper,introducesthedefinitionofcollagenenzyme,selection,influencefactors,mechanismetc.Thefuturedevelopmentdirectionitwasalsoprospected.Keywords:collagenprotease,mechanism,influencefactors胶原蛋白是人体内含量最多、分布最广泛的蛋白质,是一种与组织和器官功能密切相关的功能性蛋白。胶原蛋白的低免疫原性、生物相容性、生物降解性加［4］［1－3］和生物活性等特性,被愈来愈多的消费者所认识。胶原蛋白制品已被广泛应用于食品、保健食品、化妆品、医药等领域,市场需求急剧增。天然胶原蛋白经蛋白酶水解后,可得到具有抗氧化、降血压、降血脂、免疫调节、激素调节、[5-6]抗疲劳等生理调节功能的小肽,是极具发展前景的功能因子,也是当前医药、食品界最热门的研究课题之一。胶原蛋白具有独特的三股超螺旋结构,三条链相互平行而且由链间氢键相连,具有十分稳定的性质,一般的加工温度及短时间加热都难使其分解,因此难被人体吸收,食用利用率较低[7]。将胶原蛋白水解为胶原多肽后,其营养及生理功能可显著提高:蛋白质消化吸收率几乎达100％,能保护胃黏膜以及抗溃疡,促进皮肤胶原代谢,抑制血压上升,对关节炎等胶原病具有很好的预防及治疗作用,能促进钙吸收和降低血清中胆固醇含量等[8]。寻找一种高效的降解胶原蛋白的酶也成为了当今的一个热门课题。1胶原蛋白酶的定义和选择1.1定义胶原蛋白酶(Collgaenolytciprotease)定义为在适当的pH和温度下,只切割活性胶原螺旋区或明胶而不作用于其它蛋白底物的酶类1.2酶的选择能使胶原蛋白酶解的酶类较多。按照作用位点能够分为内切酶和外切酶;从来源上可分为植物蛋白酶(如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等)、动物蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶等)、微生物蛋白酶(如枯草杆菌1.398、放线菌166等);另外,较常见于水解的蛋白酶还有风味复合酶等。在实际应用中,酶的选取一般要考虑三个方面:一是酶对胶原蛋白作用的强度;二是酶的价格;三是水解产物的要求。如果酶对胶原的作用太弱,则无法得到高的胶原水解率,而酶的纯度直接影响酶的价格,纯度较高的酶与工业用酶的价格往往相差甚远。因此开发的产品如没有特殊要求,一般能够考虑选择用已完全工业化的酶。除此之外,还必须考虑酶对胶原的作用位点,因为这直接影响最后水解产物分子量的分布,是决定能否得到目标产物的一个关键因素[12-13][9-10]。。细菌胶原酶可分泌到胞外,经过发酵可大量获得,微[11]生物来源的胶原酶在应用方面具有更广的应用范围。2胶原蛋白酶的水解特性和作用机理的研究2.1胶原蛋白酶的水解特性对于水解胶原蛋白方面的研究,国外的报道很多。例如RuudA.Bank等采用SDS决策法分别测定α-胰凝乳蛋白酶水解完整的胶原蛋白、热处理(70℃,30min)过的变性的胶原蛋白、以及用人体胶原酶解旋的胶原蛋白得到的碎片的尺寸,经过比较得出胰凝乳蛋白酶不能使完整的三股螺旋的胶原蛋白分子解链,但能使变性的胶原蛋白完全降解成小分子产物在37℃经过12h能够水解不能溶解的牛胶原蛋白[15][14]。。S.R.L.Teruel研究发现美洲比目鱼胶原蛋白酶不能水解牛胶原蛋白,鱼胶原蛋白酶在pH为7时活性最高。天然的鱼胶原蛋白酶。MasatoHiyama等人实验发现某种曲霉菌丝氨酸蛋白酶OK-22,在37℃,pH为7.5,经过48h,Ⅰ-型胶原蛋白的水解程度达到12％。曲霉菌丝氨酸蛋白酶水解Ⅰ-型胶原蛋白的上限大约是12％,与水解乳酪的程度一样,而真菌蛋白酶水解胶原蛋白的程度要比水解乳酪的程度弱的多[16]。SiripornDamrongsakkul等在用木瓜蛋白酶和应用Neutrase蛋白酶水解生牛皮时,发现应用Neutrase蛋白酶水解的产物中,胶原蛋白的水解产物的粘度跟水一样低。Ⅰ-型的人类胶原蛋白是存在于哺乳动物体内最丰富的一种分子,天然的胶原对大多数的胶原蛋白酶都具有抵抗力[17]。J.Friedrich等在研究角蛋白酶对天然胶原的水解能力时发现羽毛角蛋白和胶原不能被[18]这种从菌类提取的角蛋白酶水酶。曾名勇等采用正交试验确定了菠萝蛋白酶和alcalase2.4L碱性蛋白酶这两种酶单独水解鱼皮胶原蛋白的最佳酶解条件。在此基础上,进行复合酶水解实验,表明先采用菠萝蛋白酶水解,再用alcalase2.4L蛋白酶水解,效果更佳[19]。薛勇等在研究岩藻聚糖硫酸酯寡糖-Ce(Ⅳ)配合物的制备及其对胶原蛋[20]白的水解活性时发现小分子岩藻聚糖硫酸酯寡糖-Ce(Ⅳ)的配合效果最好,且水解胶原蛋白的活性高,并经过实验确定了配合条件以及配合物对胶原蛋白的最佳水解条件。孙爱梅等研究认为胰蛋白酶对天然胶原蛋白几乎没有作用,但能够降解变性的胶原蛋白。胰蛋白酶水解胶原的最适条件是pH为8.1～8.2、温度37℃。在此条件下,采用凝胶过滤色谱分析考察了酶用量时间对胶原蛋白降解过程的影响。一般情况下,在酶促反应中底物浓度比酶浓度高得多,增加酶用量对酶促反应初始速率影响较大,而且速率增加与酶用量成正比,随着底物浓度的降低,酶用量对反应速率的影响逐渐减小件为,并对胶原水解产物的理化性质进行了测定2.2胶原蛋白酶的作用机理对于酶作用机理的研究也很多。MisookKim等利用从生姜的根茎中提取的半胱氨酸蛋白酶GP2水解从小牛皮中提取的Ⅰ-型胶原蛋白时,发现这种酶能作用于胶原分子三条螺旋链上的相同位点,是当前唯一被证明能够水解天然胶原的植物半胱氨酸蛋白酶[23][22][21]。陈秀金等研究了用碱性蛋白酶水解脱铬革屑制备胶原水解产物时,影响胶原蛋白水解产物收获率的各种因素,确定了最佳水解条。。YoshioYamakawa等测定了纯出血蛇毒素水解几种白明胶和胶原蛋白的能力。但在天然胶原中只有Ⅳ-型胶原能够被水解。出血蛇毒素对Ⅳ-型胶原的水解具有时间依赖性,在开始的2h水解非常迅速;出血蛇毒素作用于Ⅳ-型胶原不同的位点来水解三股螺旋结构[24]。MagdaGioia等检测了嗜中性粒细胞胶原蛋白酶,白明胶酶A降解胶原纤维的作用机制,经过研究Ⅰ-型胶原蛋白在37℃时水解,确定了在处理过程中两种α-链胶原蛋白的功能差异。运用热力学和动力学参数定量的比较,发现金属胶原蛋白酶对对胶原蛋白分子链的解旋和伸展至少有两种截然不同的机理[25]。A.CristinaSarmento等认为存在三种溶胶机理,一种是用裂缝胶原蛋白酶,[26]能够分裂稳定三股螺旋胶原蛋白,第二种是拓宽的精细蛋白酶,如半胱氨酸蛋白酶,能够作用于天然胶原蛋白分子的分裂的肽端,第三种是细菌蛋白酶及组织蛋白酶。EricDufour等研究了胶原酶和组织蛋白酶B水解Ⅲ-型的胶原时流体静压力的作用。实验证明高压条件下胶原分子表面一些氨基酸侧链不宜暴露,也不宜被组织蛋白酶B识别。胶原水解的速率随着压力的增大而减小。高压会导致酶和底物的构象发生变化,压力还会改变酶的弹性[27]。3影响酶活力的因素酶也是一种蛋白质,凡是能使蛋白质变性的因素,都可能使酶失去活性,如物理因素(温度、压力、光、磁场),化学因素(氧化、还原、溶剂、金属离子、离子强度、pH)和生物学因素(酶修饰和酶降解)蛋白酶在加工和贮存期间活力都会降低,在常温(25℃,湿度25%)下,贮存一个月酶活力降低达20％～30%,蛋白酶的易失活特性极大地限制了其生产和应用。蛋白酶的活性降低主要是由于蛋白酶的巯基易被氧化,与SO2的相互转化,形成了醌-硫醇复合物,并可自行降解。3.1化学因素3.1.1有机溶剂一般情况下,随着有机溶剂浓度的增大,蛋白酶活力呈直线下降。试验证明,当甲醇、乙醇、乙二醇浓度分别达到25.5%、20.5%、24.0%时,酶活力丧失一半,浓度达到50%时,酶活力完全丧失。在十二烷基硫酸钠(SDS)变性中,菠萝蛋白酶活力随SDS浓度的增大而呈指数下降,而α-螺旋度开始有所下降,然后出现回升趋势,SDS达4mg/ml时,酶完全失活,而α-螺旋度增加24%[28-30]。潘江球等研究报道,聚丙烯酰胺(PAAM)可使蛋白酶在30、45、50、60℃下贮存后,酶活力保留率分别提高l3.8%、22.9%、25.2%、28.4%。贮存温度越高,PAAM提高酶活力保留率的效果越明显,PAAM在液体酶中同样能够显著地提高酶的稳定性。这是因为PAAM是一种高分子亲核试剂,经过氢键固定在酶的表面来稳定酶分子构象;它对蛋白酶分子还起到一种包埋作用,有效地防止巯基的氧化失活;也由于它从酶相互作用区域排除水,降低自由能,使酶的贮存稳定性得到了显著的提高3.1.2金属离子在pH7.0时,草酸钠对蛋白酶有明显稳定作用,100mmol/L草酸钠能使酶活半衰期延长6倍,丁二酸钠、酒石酸甲钠对酶活也有一定的保护作用。醋酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠对蛋白酶都有一定程度的保护作用,而且浓度变化对保护作用的影响不大。研究证明,添加苯甲酸钠,贮存1个月后酶活力比对照组提高14％。添加焦亚硫酸钠,在15℃下避光保存2个月酶活力保持不变。Ca2+和Zn2+对蛋白酶有一定程度的保护作用。KCl和NaCl对蛋白酶热稳定性基本没有影响[32][31]。;CaCl2和MgCl2在一定浓度下显现出一定的保护作用,分别比对照品提高了21%和12.4%。Zn(Ac)2和ZnCl2在低浓度下就可增进酶的热稳定性,在合适的浓度下,酶活力分别比对照品提高了32.4%和29.1%。在这些金属离子中,发现对蛋白酶有一定作用的都是二价离子,以锌离子的作用较为明显,钙、镁离子次之。而对于锌离子,醋酸锌的功效显得更大些,它能以极低的浓度(5×10-4mol/L)获得显著的稳定效果。3.1.3共溶剂糖类、多元醇、氨基酸及其衍生物、无机盐、甘油、多聚物如聚乙二醇(PEG)等一般被称为蛋白质的共溶剂。对某一活性酶来说,其酶失活半衰期是常数,因此能够菠萝蛋白酶失活半衰期用作衡量酶热稳定性的指标。研究证明,40％半乳糖对菠萝蛋白酶有一定的保护作用,能使其酶活半衰期提高3倍;50％葡萄糖可将菠萝蛋白酶的半衰期延长10倍,但有研究指出,葡聚糖和肌醇对该蛋白酶没有保护作用。蔗糖、麦芽糖、棉子糖和松三糖等寡糖对菠萝蛋白酶均有明显的保护作用。也有人证明,低浓度的蔗糖、葡萄糖、β-环糊精、黄原胶对提高酶的热稳定性没有作用。50％甘油可将菠萝蛋白酶的半衰期延长8倍,乙二醇和甘露醇对菠萝蛋白酶有一定的保护作用甘露醇即使在低浓度下也能促进酶溶液的热稳定性。近几年的研究表明,共溶剂对酶的保护作用机制是共溶剂的加入改变了溶液的热力学性质,使酶的稳定性得到增强,理论上称优先排阻作用。共溶剂从酶表面的优先排阻并不是说共溶剂分子绝对不能渗透到酶表面并与之结合,而是在酶表面完全水化和共溶剂完全结合之间建立起一种平衡。糖类是酶蛋白在溶液中和在干燥状态下较好的稳定剂。甘油和多元醇对酶的非极性表面有很好的稳定作用。另外,一些研究者发现,混合使用共溶剂可大大提高酶的稳定效果。[33]。试验还证明,多元醇甘油、3.2物理因素3.2.1温度和湿度一般动物蛋白酶的最适反应温度介于37～40℃,植物蛋白酶的最适为50～60℃,温度升高,酶的热失活增强,反应速度下降。在干燥环境下,蛋白酶活力相对稳定,但随着环境湿度的增大,酶失活速率加快3.2.2光照光对蛋白酶活性的影响是明显的。试验证明,将菠萝蛋白酶进行避光和无避光贮存10d后,无避光下酶活力的保留率比避光下降低了9.8%。这是因为蛋白酶中的巯基、氨基、色氨酸残基和唯一的组氨酸残基是酶活性的必须基团,日光对这些基团的破坏性很强,日光中的紫外线等能够引起酶构象的改变或使酶的氨基酸残基氧化、引起共价键断裂等反应3.3生物因素Lee等报道,用脂质膜微胶囊包埋保护蛋白酶,能有效地提高蛋白酶的稳定性[36]。据黄惠华等报道,以聚乙二醇为分散剂和稳定剂,用氧化低价铁盐的方法制成具有磁性响应性的微球,用1.33%浓度的该磁性微球吸附分离的蛋白酶,回收率达61.96%,酶活性为3.8万单位/g,固定化磁性蛋白酶的热稳定性有显著提高,常温下的保存半衰期为28d左右[37][35][34]。。。用琥珀酸酐法活化后的聚乙二醇(PEG)修饰蛋白酶,所得到的修饰酶在对温度和pH值的稳定性上均比天然酶有一定程度的提高。这说明PEG分子对酶有一定的保护作用,推测这种作用应来自分子间的作用力。Mg2+和Ca2+对修饰酶有不同程度的激活作用,而Na+对修饰酶无明显影响[38]。以脱乙酰甲壳质为载体,戊二醛为交联剂,对蛋白酶进行固定化,研究其对啤酒澄清的作用。采用右旋糖醛对蛋白酶进行化学修饰,经修饰的酶能较好地保持蛋白酶活性,而且具有更好的稳定性。4胶原蛋白酶的提取方法蛋白酶的提取方法有很多种:沉淀法、层析法、膜超滤法,提取胶原蛋白主要用的的是层析法。4.1层析法层析法又称为色谱法。在层析分离中基于固定相和流动相中各组份阻滞能力的作用不同,又可分为分子筛层析、离子层析、亲和层析等。4.1.1分子筛层析分子筛层析(gelchromatography)又称为凝胶层析或凝胶过滤。分子筛层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相,对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术,适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品,只要经过单一凝胶床就能够完全将它们分开。具有分子筛作用的物质很多,如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等,以葡聚糖凝胶应用最广。分子筛层析具有设备简单、操作方便、分离迅速及不影响分子生物学活性等优点,当前已被广泛应用于各种生化产品的分离和纯化。但同时也存在分辨率不高,分离操作较慢等不足之处。另外,凝胶层析要求样品黏度不宜太高,凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象。4.1.2离子交换层析离子交换层析(IonExchangeChromatography简称为IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中,基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。由于蛋白质也带有电荷,当蛋白质处于不同的pH条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质。经过提高洗脱液中的盐浓度等措施,将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。与分子筛层析相比,离子交换层析特异性更好,有更多的参数能够调整以获得最优的纯化效果,树脂也比较便宜。值得一提的是,即便是用最精确控制的条件,仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白质,还需要其它的纯化步骤并需要经常进行离子再生,耗费大量酸碱,而且对环境有一定的破坏。5发展前景中国是工业生产大国之一,每年产生30万吨以上的鞣革废渣,利用这些工业废弃物的酶解来制备胶原多肽,使其变废为宝,不但减少环境污染,还能带来良好的社会效益和经济效益。可是由于酶自身的缺点,如高度的底物专一性,易变敏感性,水解率偏低等,导致工业化生产的成本较高,产品价格昂贵。因此寻找稳定性,产量高好的胶原蛋白酶,改进各种水解工艺条件,提高胶原蛋白酶解为胶原多肽的酶解效率,将成为水解胶原蛋白领域的研究重点。三亿文库3包含各类专业文献、外语学习资料、行业资料、专业论文、中学教育、幼儿教育、小学教育、文学作品欣赏、36胶原蛋白酶的研究进展等内容。12参考文献:[1]石岗.生物活性肽进展［J］.北京农业科学,;[2]陈国梁,贺翠莲.胶原蛋白的研究进展［J］.;[3]焦驼文,孔繁东,等.酶解蛋白制备抗氧化多肽;[4]冯成利,党蕊叶,李校坤,等.猪皮胶原蛋白肽;[5]曹荣安,李浩,李良玉,等.胶原蛋白的生理功;[6]傅燕凤,沈月新.浅谈鱼皮胶原蛋白的利用［J;[7]S.R.Fahnestock,A.Stei参考文献:[1]石岗.生物活性肽进展［J］.北京农业科学,(3):9－13.[2]陈国梁,贺翠莲.胶原蛋白的研究进展［J］.延安大学学报:自然科学版,,19(2):78－81.[3]焦驼文,孔繁东,等.酶解蛋白制备抗氧化多肽的研究现状与展望［J］.中国酿造,(3):5－7.[4]冯成利,党蕊叶,李校坤,等.猪皮胶原蛋白肽的提取及理化分析［J］.陕西师范大学学报:自然科学版,,35:20－23.[5]曹荣安,李浩,李良玉,等.胶原蛋白的生理功能特性及其应用［J］.肉制品加工与设备,(1):7－9.[6]傅燕凤,沈月新.浅谈鱼皮胶原蛋白的利用［J］.食品研究与开发,,25(2):16－18.[7]S.R.Fahnestock,A.Steinbüchel.Biopolymers(8):PolyamidesandComplexProteinaceousMaterials[M],.[8]PiezKA,EignerEA,LewisMS.Thechromatographicseparationandaminoacidcompositionofthesubunitsofseveralcollagens[J].Biochemistry.1963,(2):58-66.[9]WatanabeK.Collagenolyticproteasesfrombacteria.ApplMicrobiolBiotechnol,,63:520–526.[10]PParkPJ,LeeSH,ByunGH,etal.Purificationandcharacterizationofacollagenasemackerel,Scomberjaponicus.JBiochemMolBiol,,35(6):5765–5782.[11]KumarCG,TakagiH.Microbialalkalineproteases:fromabioindustrialviewpoint.BiotechnolAdv,1999,17(7):561–594.[12]KanthSV,VenbaR,MadhanB,etal.Studiesontheinfluenceofbacterialcollagenaseinleatherdyeing.DyesPigm,,76(2):338–347.[12]蒋挺大,张春萍.胶原蛋白[M].化学工业出版社,[13]菅景颖,张志胜.酶解胶原蛋白研究进展[J].浙江化工,,38(1):18-20[14]RuudA.Bank,MarianneKrikken,BobBeekmanetal.Asimplefiedmesurementofdegradedcollagenintissues:applicationinhealthy,fibrillatedandosteoarthriticcartilage[J].MatrixBiology,1997,16:233-243.[15]S.R.L.Teruel,B.K.Simpson.Characterizationofthecollagenolyticenzymefractionfromwinterflounder(Pseudopleuronectesamericanus)[J].Comp.Biochem.Physiol.1995,lI2B(1):131-136.[16]MasatoHiyama,MasaakiShinozuka,MasaruIizukaetal.DegradationofGelatinandCollagenbySerineProteinaseofAspergillussydowi[J].JournalofFermentationAndBioengineering,1996,81(5):464-465.[17]SiripornDamrongsakkul,KongpobRatanathammapan,KittinanKomolpisetal.Enzymatichydrolysisofrawhideusingpapainandneutrase[J].JournalofIndustrialandEngineeringChemistry,,(14):202-206.[18]J.Friedrich,S.Kern.HydrolysisofnativeproteinsbykeratinolyticproteaseofDoratomycesmicrosporus[J].JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic,,(21):35-37.[19]曾名勇,李八方,陈胜军等.红非鲫鱼皮胶原蛋白酶解条件的研究[J].中国海洋药物杂志.,24(5):24-29.[20]薛勇,薛长湖,杜世振等.岩藻聚糖硫酸酯寡糖-Ce(Ⅳ)配合物水解胶原蛋白的研究[J].中国海洋大学学报,,36(2):273-276.[21]孙爱梅,张贵锋,倪文等.胶原蛋白讲解物高效液相色谱/质谱连用分析[J].中国生物工程杂志.,25(2):66-72.[22]陈秀金,曹健,魏明等.碱性蛋白酶水解脱铬革屑制备胶原水解物的研究[J].中国皮革,,33(1):42-46.[23]MisookKim,SusanE.Hamilton,LukeW.Guddatetal.Plantcollagenase:Uniquecollagenolyticactivityofcysteineproteasesfromginger[J].BiochimicaetBiophysicaActa,,(1770):1627-1635.[24]MagdaGioia,SusannaMonaco,GiovanniFrancescoetal.CharacterizationoftheMechanismsbywhichGelatinaseA,NeutrophilCollagenase,,andMembrane-TypeMetalloproteinaseMMP-14RecognizeCollagenIandEnzymaticallyProcesstheTwoα-Chains[J].J.Mol.Biol,,(368):1101-1113.[25]YoshioYamakawa,TamotsuOmori-Sathoa,Diet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