微生物细胞破碎原理和技术

为了研究细胞破碎，提升其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁组成和结构微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌霉菌壁厚/nm20-8010-13100-300100-250层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白质脂多糖（1-4%）肽聚糖（5-10%）脂蛋白脂多糖（11-22%）磷脂蛋白质葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋白质（6-8%）脂类（8.5-13.5%）多聚糖（80-90%）脂类蛋白质一、细胞壁组成和结构第1页细菌破碎主要阻力来自于肽聚糖网状结构，网状结构越致密，破碎难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌坚固；酵母细胞壁破碎阻力也主要决定于壁结构交联紧密程度和它厚度；因为霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌细胞壁有所提升。第2页为了破碎细胞，必须克服主要阻力是网状结构共价键。各种微生物细胞壁结构和组成差异很大，壁结构不但取决于遗传信息，也取决于生长环境，真菌壁结构还随发酵罐中混合机械作用而改变。

在用酶法或化学法来溶解细胞壁时，细胞壁结构和组成显得尤其主要，可用来作为选择溶菌酶和化学方法依据。第3页分类作用机理适应性机械法珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目标产物易失活，浆液分离困难高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温猛烈，不适合大规模操作X-press法固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目标产物不适合非机械法酶溶法酶分解作用含有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差化学渗透法改变细胞膜渗透性具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差渗透压法渗透压猛烈改变破碎率较低，常与其它方法结合使用冻结融化法重复冻结-融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目标产物干燥法改变细胞膜渗透性条件改变猛烈，易引发大分子物质失活二、微生物细胞破碎技术＝＝＝＝基本说出第4页细胞破碎机理图第5页1、机械方法为了粉碎微生物细胞，经常选择机械方法，因为它们处理量大，破碎速度较快。采取这些方法，细胞受到由高压产生高剪切力，但在大多数情况下要采取冷却办法，方便除去因为消耗机械能而产生过多热量，预防生化物质破坏。第6页（1）珠磨机

研磨是惯用一个方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使到达细胞某种程度破碎。

高速组织捣碎机和Braun匀浆器是试验室规模细胞破碎设备，利用玻璃小珠撞击微生物细胞而到达破碎目标。这些装置主要缺点是在破碎期间样品温度快速升高，经过用二氧化碳来冷却容器可得到部分处理。第7页在工业规模破碎中，能够采取高速珠磨机。在这种设备中，因为圆盘高速旋转，使细胞悬浮液和玻璃珠相互搅动，细胞破碎是由剪切力层之间碰撞和磨料滚动而引发。第8页（2）高压匀浆器采取高压匀浆器是大规模破碎细胞惯用方法。利用高压迫使细胞悬浮液经过针形阀，因为突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂。在工业规模细胞破碎中，对于酵母菌等难破碎及浓度高或处于生长静止期细胞，常采取屡次循环操作方法。第9页（3）X－press法另一个改进高压方法是将浓缩菌体悬浮液冷却至－25℃至－30℃形成冰晶体，利用500MPa以上高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是因为冰晶体磨损，包埋在冰中微生物变形所引发。此法称为X－press法，主要用于试验室中。该法优点是适用范围广，破碎率高，细胞碎片粉碎程度低以及活性保留率高。该法对冷冰－融解敏感生化物质不适用。第10页（4）超声波法细胞破碎是因为超声波空穴作用，从而产生一个极为强烈冲击波压力，由它引发粘滞性旋涡在介质中悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。对于不一样菌种发酵液、超声波处理效果不一样，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞轻易破碎，对酵母菌效果极差。超声波振荡轻易引发温度猛烈上升，操作时能够在细胞悬浮液中投入冰或在夹套中通入冷却剂进行冷却。该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高能量来提供必要冷却，这是困难。第11页（1）酶解法利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊键，从而到达破壁目标。2、非机械法非机械方法很多，包含酶解、渗透压冲击、冻结和融化、干燥法和化学法溶胞等。第12页惯用溶酶溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等溶菌酶主要用于细菌类细胞壁溶解酶是几个酶复合物溶菌酶是应用最多酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子α-1，4糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。外加酶法第13页对酵母细胞采取酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露葡聚糖层，最终只剩下原生质体，这时若缓冲液渗透压改变，则细胞膜破裂，释出胞内产物。利用溶酶系统处理细胞时必须依据细胞壁结构和化学组成选择适当酶，并确定对应次序。酶溶法优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不一样菌种需选择不一样酶），产物抑制存在。在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。第14页自溶作用是酶解另一个方法，所需溶胞酶是由微生物本身产生。影响自溶过程原因有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢路径等。自溶法在一定程度上能用于工业规模，不过，对不稳定微生物轻易引发所需蛋白质变性，自溶后细胞培养液过滤速度也会降低。第15页

（2）渗透压冲击是较温和一个破碎方法，将细胞放在高渗透压介质中（如一定浓度甘油或蔗糖溶液），到达平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，因为渗透压突然改变，水快速进入细胞内，引发细胞壁破裂。渗透压冲击方法仅对细胞壁较脆弱菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是适当。

（3）重复冻结一融化，可用于一些细胞破碎，或释放一些细胞组分。冻结－融化法系将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，重复屡次而到达破壁作用。因为冷冻，首先能使细胞膜疏水键结构破裂，从而增加了细胞亲水性能，另首先胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度改变，引发细胞突然膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱菌体，可采取此法。但通常破碎率很低，即使重复循环屡次也不能提升收率。另外，还可能引发对冻融敏感一些蛋白质变性。第16页（4）干燥法可采取空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。它使细胞膜渗透性改变，当用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就轻易被抽提出来。空气干燥主要适合用于酵母菌，普通在25－30℃气流中吹干，然后用水、缓冲液或其它溶剂抽提。空气干燥时，部分酵母可能产生自溶，所以较冷冻干燥、喷雾干燥轻易抽提。真空干燥适合用于细菌干燥。冷冻干燥适合用于较不稳定生化物质，将冷冻干燥后菌体在冷冰条件下磨成粉，然后用缓冲液抽提。第17页（5）化学渗透法:一些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，能够改变细胞壁或膜通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。该法取决于化学试剂类型以及细胞壁膜结构与组成。第18页如TritonX-100是一个非离子型清洁剂，对疏水性物质含有很强亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜磷脂双分子层，使一些胞内物质释放出来。其它表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可使细胞破碎。表面活性剂可促使细胞一些组分溶解，其增溶作用有利于细胞破碎。第19页处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜磷脂来填补，从而造成内层膜通透性增强。EDTA螯合剂酸碱使蛋白质易于溶解第20页能分解细胞壁中类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。有机溶剂变性剂盐酸胍（Guanidinehydrochloride）和脲（Urea）是惯用变性剂。变性剂与水中氢键作用，减弱溶质分子间疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。第21页不一样细胞可采取化学渗透处理方式细胞类型变性剂清洁剂有机溶剂酶抗生素生物试剂螯合剂革兰氏阴性细菌******革兰氏阳性细菌***酵母菌******植物细胞****巨噬细胞****表适用第22页通用性差；时间长，效率低，普通胞内物质释放率不超出50%；有些化学试剂有毒。化学渗透法优点：缺点：对产物释放有一定选择性，可使一些较小分子量溶质如多肽和小分子酶蛋白透过，而核酸等大分子量物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和深入提取。值得一提是，除了应研究破碎细胞方法外，还应研究在生物合成过程中减低细胞牢靠程度方法。第23页三、破碎率测定为了测定细胞破碎程度，取得定量结果，就需要准确分析技术，可采取以下几个方法：1、直接测定法利用显微镜或电子微粒计数器可直接计数完整细胞量，所以可用于破碎前细胞计量。可是破碎过程中所释放物质如DNA和其它聚合物组分会干扰计数，此时可采取染色法把破碎细胞从未损害完整细胞中区分开来，方便于计数。比如，破碎革兰氏阳性菌常可染色成革兰氏阴性菌颜色，利用革兰氏染色法未受损害酵母细胞展现紫色，而受损害酵母细胞展现亮红色。＝＝＝＝第24页2、测定释放蛋白质量或酶活力细胞破碎后，测定悬浮液中细胞内含物增量来估算破碎率。通常将破碎后细胞悬浮液离心，测定上清液中蛋白质含量或酶活力，并与所取得标准数值直接比较。3、测定导电率利用破碎前后导电率改变来测定破碎程度快速方法。导电率改变是因为细胞内含物被释放到水相中而引发。导电率伴随破碎率增加而呈线性增加。因为导电率读数取决于微生物种类、处理条件、细胞浓度、温度和悬浮液中电解质含量，所以，应预先采取其它方法来进行标化。第25页四、