恶性疟原虫酸性钙体的分离纯化及蛋白质组学深度剖析：探索疟疾防治新靶点

恶性疟原虫酸性钙体的分离纯化及蛋白质组学深度剖析：探索疟疾防治新靶点一、引言1.1研究背景1.1.1疟疾的危害与现状疟疾是一种由疟原虫感染引发，经雌性按蚊叮咬传播的寄生虫病，在全球传染病中占据着突出地位。自人类文明诞生以来，疟疾便如影随形，长期威胁着人类的健康与生存。据世界卫生组织统计数据显示，2020年全球范围内估计有2.41亿疟疾病例，死亡人数高达62.7万。尽管全球疟疾防控工作持续推进并取得了一定成效，但疟疾依然是许多发展中国家，特别是撒哈拉以南非洲地区面临的重大公共卫生挑战。疟疾对人类健康造成的影响是多方面且极其严重的。在症状表现上，患者会出现周期性发作的寒战、高热和出汗等典型症状。若病情进一步发展，严重时可引发脑疟、肾功能衰竭、肺水肿等危及生命的并发症。尤其是儿童和孕妇这两类群体，他们的免疫系统相对脆弱，成为了疟疾的主要受害人群，其中五岁以下儿童更是占据了疟疾死亡病例的三分之二。这不仅意味着无数鲜活生命的消逝，更给无数家庭带来了沉重的打击，使他们陷入失去亲人的悲痛之中。从地域分布来看，疟疾在热带和亚热带地区广泛流行。这些地区的气候条件，如高温多雨，为按蚊的滋生和繁殖提供了极为适宜的环境。同时，当地卫生基础设施的不完善、医疗资源的匮乏以及人们卫生意识的淡薄，都使得疟疾的传播难以得到有效遏制。例如，在非洲的一些国家，由于医疗卫生条件有限，许多疟疾病例无法得到及时准确的诊断和有效的治疗，导致病情延误，死亡率居高不下。在经济层面，疟疾对疫区国家和地区的发展形成了严重阻碍。疟疾的广泛传播使得劳动力因病无法正常工作，生产力大幅下降，进而影响到农业、工业等各个领域的生产活动。为了应对疟疾，政府和社会需要投入大量的资金用于医疗救治、疾病防控以及相关科研工作。这无疑加重了当地的经济负担，使得原本就不发达的经济雪上加霜。对于一些贫困地区而言，疟疾甚至成为了导致贫困的重要因素之一，形成了“因病致贫、因贫致病”的恶性循环。更为严峻的是，疟原虫对抗疟药耐药性的问题日益凸显，已成为全球疟疾控制进程中最为棘手的难题之一。长期以来，以青蒿素为基础的联合疗法（ACT）是治疗恶性疟疾最为有效的手段，其疗效曾高达90%以上。但近年来，在柬埔寨和泰国边境地区已确认出现青蒿素耐药性疟原虫。这一现象的出现，使得原本有效的治疗方案效果大打折扣，疟疾病例的治疗难度显著增加。若不能及时研发出有效的替代药物，疟疾的传播极有可能进一步加剧，对全球公共卫生安全构成更大的威胁。1.1.2酸性钙体研究的重要性在疟原虫复杂的细胞结构中，酸性钙体作为一种独特的细胞器，近年来受到了科学界的广泛关注。它最早由美国伊利诺依大学Dr.DocampoRoberto教授的研究团队在锥虫体内发现并命名。随后，研究人员又陆续在利什曼原虫、顶复门原虫（如弓形虫、疟原虫、艾美原虫）、绿藻、霉菌、细菌以及人类血小板中均发现了酸性钙体的存在。酸性钙体的结构和功能都十分独特。从结构上看，它呈现出一种类似包涵体的空泡形态，内部含有大量大小不等的圆形致密颗粒，这些颗粒富含钙、磷、镁等多种化学元素，这也是其被命名为酸性钙体的重要原因。在功能方面，酸性钙体在寄生虫的生长代谢、侵袭宿主以及产生毒力等多个关键过程中都发挥着不可或缺的作用。大量研究表明，酸性钙体的膜上存在着多种重要的分子结构，如钙泵（Ca2+-ATPase）、质子泵（Vacuolar-H+-ATPase，Vacuolar-H+-pryophosphatase）、钠/氢泵（Na+/H+exchanger）、钙/氢泵（Ca2+/H+exchanger）和水蛋白通道（Aquaporin）、离子通道等。这些成分协同作用，对寄生虫的生存和致病过程产生着深远影响。例如，钙泵和质子泵能够调节酸性钙体内外的离子浓度和酸碱度，维持细胞器内环境的稳定，为寄生虫的代谢活动提供适宜的条件；离子通道则参与了细胞内外物质的交换和信号传递，对于寄生虫感知宿主环境并做出相应的生理反应具有重要意义。基于酸性钙体在疟原虫生命活动中的关键作用，以及其在哺乳动物细胞中不存在的特性，使其成为了极具潜力的抗疟靶点。针对酸性钙体开发抗疟新药，具有独特的优势和广阔的前景。一方面，由于哺乳动物细胞中缺乏酸性钙体及其相关的酶系统，因此以酸性钙体为靶点研发的药物可以特异性地作用于疟原虫，减少对人体正常细胞的损害，降低药物的副作用；另一方面，疟原虫对现有抗疟药物的耐药性问题日益严重，开发新的抗疟靶点和药物迫在眉睫，酸性钙体的发现为抗疟药物的研发提供了新的方向和契机。目前，虽然在疟原虫酸性钙体的研究方面已经取得了一些进展，但相较于锥虫和弓形虫等其他寄生虫的酸性钙体研究，疟原虫酸性钙体的研究还相对滞后。其具体的结构、生物学功能和代谢特点尚未完全明确，许多关键问题仍有待深入探索。例如，酸性钙体与疟原虫其他细胞器之间的相互作用机制、酸性钙体中各种成分在疟原虫致病过程中的具体作用途径等，都需要进一步的研究来揭示。对疟原虫酸性钙体进行深入的蛋白质组学研究具有重要的科学意义和应用价值。蛋白质组学研究可以全面解析酸性钙体中蛋白质的组成、结构和功能，为深入了解疟原虫的生物学特性和致病机制提供重要的理论依据。通过比较疟原虫与其他生物酸性钙体蛋白质组的差异，可以发现疟原虫酸性钙体的独特蛋白质靶点，为开发新型抗疟药物提供关键的靶点信息。这将有助于推动抗疟药物研发的创新，提高疟疾治疗的效果，为全球疟疾防控工作提供有力的支持。1.2研究目的与意义本研究旨在通过建立一套高效的分离纯化方法，成功获取高纯度的恶性疟原虫酸性钙体，并运用先进的蛋白质组学技术对其进行深入分析，全面揭示酸性钙体的蛋白质组成和功能特性，为深入理解疟原虫的生物学特性和致病机制提供关键线索。本研究具有重要的理论意义和实际应用价值。在理论层面，通过对恶性疟原虫酸性钙体的蛋白质组学分析，能够更深入地了解酸性钙体在疟原虫生命活动中的作用机制，填补疟原虫酸性钙体研究领域的空白，为疟原虫生物学研究提供新的理论基础。对酸性钙体蛋白质组的研究有助于揭示疟原虫的进化历程和适应机制，进一步丰富对寄生虫生物学的认识。从实际应用角度来看，本研究为抗疟新药的研发提供了重要的靶点信息。随着疟原虫耐药性问题的日益严重，寻找新的抗疟靶点和药物迫在眉睫。酸性钙体作为疟原虫特有的细胞器，其蛋白质组中可能存在一些与疟原虫生存和致病密切相关的关键蛋白，这些蛋白有望成为新型抗疟药物的作用靶点。通过针对这些靶点开发药物，可以特异性地作用于疟原虫，提高药物的疗效，减少对人体正常细胞的损害，为全球疟疾防控工作提供有力的支持。本研究还可能为疟疾的诊断和治疗提供新的思路和方法，具有广阔的应用前景。1.3国内外研究现状1.3.1恶性疟原虫培养在恶性疟原虫的培养研究方面，国内外学者已取得了一定的成果，但仍面临诸多挑战。早在1976年，Trager和Jensen就成功建立了恶性疟原虫的体外连续培养系统，这一开创性的工作为后续的疟原虫研究奠定了坚实基础。该系统通过使用RPMI1640培养基，并添加人血清和红细胞，实现了恶性疟原虫在体外的持续生长和繁殖。这一技术的突破使得科学家们能够在实验室环境中对疟原虫进行深入研究，极大地推动了疟疾研究领域的发展。然而，随着研究的深入，恶性疟原虫体外培养的局限性也逐渐显现。其中，新鲜血液来源受限是一个突出问题。疟原虫的生长依赖于人红细胞，而新鲜血液的采集受到诸多因素的限制，如献血者的数量、血液的保存条件等。这不仅增加了培养的成本和难度，还限制了大规模实验的开展。寄生虫在体外培养时生长状态不稳定，难以扩大繁殖。疟原虫对培养条件极为敏感，温度、pH值、营养成分等微小的变化都可能影响其生长和发育，导致培养结果的不确定性增加。为了解决这些问题，国内外研究人员进行了大量的探索和尝试。一些研究致力于优化培养基的配方，通过调整营养成分和添加生长因子，试图提高疟原虫的生长效率和稳定性。有研究尝试使用人造血红蛋白替代天然血液，以解决血液来源受限的问题。虽然这些方法在一定程度上取得了进展，但目前仍无法完全满足大规模、稳定培养恶性疟原虫的需求。在国内，军事医学科学院的研究团队在恶性疟原虫培养方面取得了重要进展。他们通过改进培养技术和优化培养条件，成功提高了疟原虫的培养成功率和生长质量，为国内的疟疾研究提供了有力的支持。国外的一些研究机构，如美国国立卫生研究院（NIH）和英国伦敦卫生与热带医学院，也在不断投入资源，开展相关研究，试图突破恶性疟原虫培养的技术瓶颈。1.3.2酸性钙体分离纯化方法对于酸性钙体的分离纯化，目前国内外主要采用密度梯度离心法。这种方法利用不同细胞器在密度上的差异，通过离心使其在密度梯度介质中分层，从而实现酸性钙体的分离。常用的密度梯度介质包括Percoll和碘克沙醇等。在利用Percoll进行密度梯度离心时，需要先将Percoll与缓冲液混合，制备成不同密度的梯度溶液。然后将含有酸性钙体的细胞匀浆小心地铺在梯度溶液的顶部，通过高速离心，使酸性钙体在不同密度层之间形成条带。收集含有酸性钙体的条带，再经过多次洗涤和纯化，即可得到较高纯度的酸性钙体。碘克沙醇作为一种新型的密度梯度介质，具有低渗透压、无毒性等优点，能够更好地保持细胞器的完整性和活性，因此在酸性钙体分离纯化中的应用逐渐受到关注。尽管密度梯度离心法在酸性钙体分离纯化中得到了广泛应用，但该方法也存在一些不足之处。操作过程较为复杂，需要精确控制离心条件和密度梯度的制备，否则容易导致分离效果不佳。分离得到的酸性钙体纯度和产量仍有待提高，难以满足大规模蛋白质组学研究的需求。此外，该方法对实验设备和技术要求较高，限制了其在一些实验室的推广应用。国内的一些研究团队在酸性钙体分离纯化方法的改进方面进行了积极探索。中国科学院的研究人员通过优化密度梯度离心的参数和流程，成功提高了酸性钙体的分离效率和纯度。国外的学者则尝试结合其他技术，如免疫亲和层析和色谱技术，进一步提高酸性钙体的分离效果。这些研究为酸性钙体分离纯化方法的发展提供了新的思路和方向。1.3.3蛋白质组学研究蛋白质组学技术在疟疾研究领域的应用为深入了解疟原虫的生物学特性和致病机制提供了强大的工具。通过蛋白质组学分析，可以全面揭示疟原虫在不同生长发育阶段的蛋白质表达谱，从而发现与疟原虫生存、繁殖、致病等过程密切相关的关键蛋白。早期的疟原虫蛋白质组学研究主要采用二维凝胶电泳（2-DE）技术结合质谱分析。2-DE技术能够根据蛋白质的等电点和分子量将其分离，形成二维图谱。通过对图谱上的蛋白质点进行切割、酶解，再利用质谱技术鉴定蛋白质的氨基酸序列，从而确定蛋白质的种类和表达水平。这种方法在疟原虫蛋白质组学研究中发挥了重要作用，帮助研究人员发现了许多与疟原虫生物学功能相关的蛋白质。随着技术的不断发展，基于液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）的蛋白质组学技术逐渐成为主流。LC-MS/MS技术具有分离效率高、灵敏度高、分析速度快等优点，能够对复杂的蛋白质混合物进行快速、准确的分析。通过将蛋白质样品酶解成肽段，然后利用液相色谱将肽段分离，再通过质谱对肽段进行鉴定和定量，从而实现对蛋白质组的全面分析。该技术不仅能够鉴定出更多的蛋白质，还能够对蛋白质的修饰、相互作用等进行深入研究，为疟原虫蛋白质组学研究带来了新的突破。在恶性疟原虫酸性钙体的蛋白质组学研究方面，目前的研究还相对较少。已有的研究主要集中在对酸性钙体中一些已知蛋白的功能验证，对于酸性钙体蛋白质组的全面解析尚未完成。酸性钙体中蛋白质的组成和功能仍然存在许多未知领域，需要进一步深入研究。这限制了我们对酸性钙体在疟原虫生命活动中作用机制的全面理解，也为基于酸性钙体的抗疟药物研发带来了一定的困难。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1恶性疟原虫来源本研究使用的恶性疟原虫FCC1/HN株，源自中国海南地区的恶性疟患者。该虫株具有典型的恶性疟原虫生物学特性，在疟疾研究领域被广泛应用。虫株保存在液氮罐中，采用甘油、山梨醇保护液（4.2%山梨醇生理盐水180ml加纯甘油70ml）作为保护剂，在-196℃的液氮环境下，能够有效保持疟原虫的生物学活性和遗传稳定性，长期保存其感染性和致病力。复苏时，从液氮罐中迅速取出含有虫株的安瓿，立即放入37℃恒温水浴中快速解冻。在解冻过程中，需不断轻轻摇晃安瓿，确保虫株受热均匀，避免局部过热或过冷对虫株造成损伤。待安瓿内的保护液完全融化后，将虫株转移至含有RPMI1640培养基的培养瓶中。培养基中添加了10%的人血清，以提供疟原虫生长所需的营养物质和生长因子。同时，加入适量的青霉素和链霉素，终浓度分别为100U/ml和100μg/ml，以防止细菌污染。将培养瓶置于37℃、5%CO₂的培养箱中进行培养，定期观察疟原虫的生长状态，包括红细胞的感染率、疟原虫的形态变化等，并及时补充新鲜培养基和红细胞，以维持疟原虫的生长和繁殖。2.1.2主要试剂与仪器实验所需的主要试剂包括：碘克沙醇（Iodixanol），作为密度梯度离心的关键试剂，用于分离酸性钙体。其纯度高，能够形成稳定的密度梯度，有效实现不同细胞器的分离；蛋白酶抑制剂（ProteaseInhibitorCocktail），能抑制蛋白酶的活性，防止在实验过程中蛋白质被降解，确保蛋白质组学分析的准确性；RPMI1640培养基，为恶性疟原虫的生长提供必要的营养成分，包括氨基酸、维生素、糖类等；人血清，富含多种营养物质和生长因子，是维持疟原虫体外培养的重要补充成分；青霉素和链霉素，用于抑制细菌生长，保证培养环境的无菌状态；二甲基亚砜（DMSO），在虫株冻存时作为保护剂，降低冰晶对细胞的损伤，提高虫株的存活率。主要仪器设备有：超速离心机（OptimaXPN-100，Beckman），具备高转速（100,000rpm）和强大的离心力（802,000g），能够满足密度梯度离心对高速和高离心力的要求，有效分离酸性钙体；质谱仪（ThermoScientificQExactiveHF），具有高分辨率和高灵敏度，能够准确鉴定蛋白质的氨基酸序列和修饰情况，为蛋白质组学研究提供关键数据；二氧化碳培养箱（ThermoScientificHeracellVIOS160i），精确控制温度（37℃）和二氧化碳浓度（5%），为恶性疟原虫的体外培养创造适宜的环境；荧光显微镜（NikonEclipseTi2），用于观察疟原虫的形态和生长状态，通过荧光标记技术，能够对酸性钙体等细胞器进行特异性观察和分析。2.2实验方法2.2.1恶性疟原虫的培养与扩增恶性疟原虫的培养采用RPMI1640培养基，其中添加了10%的人血清作为营养补充。人血清富含多种生长因子和营养物质，能够为疟原虫的生长提供必要的支持。同时，向培养基中加入青霉素和链霉素，终浓度分别为100U/ml和100μg/ml，以抑制细菌的生长，确保培养环境的无菌状态。在培养过程中，维持温度在37℃，这是疟原虫生长的最适温度，能够保证疟原虫的正常代谢和繁殖。二氧化碳浓度控制在5%，以维持培养基的pH值稳定，为疟原虫提供适宜的酸碱环境。通过不断补充新鲜的红细胞，为疟原虫提供充足的营养来源，维持虫体的生长和繁殖。定期使用显微镜观察疟原虫的生长状态，通过观察红细胞的感染率、疟原虫的形态变化（如滋养体、裂殖体的发育情况）以及疟原虫在红细胞内的分布情况等，来评估虫体的生长状况。当疟原虫的密度达到一定程度，如红细胞感染率达到10%-15%时，进行虫体的扩增。扩增时，按照1:3或1:4的比例将培养物转移至新的培养瓶中，并添加新鲜的培养基和红细胞，以促进疟原虫的进一步生长和繁殖。2.2.2酸性钙体的分离纯化酸性钙体的分离纯化采用碘克沙醇不连续密度梯度离心法。首先，制备不同浓度的碘克沙醇溶液，浓度梯度设置为20%、30%、40%和50%。将这些不同浓度的碘克沙醇溶液按照从低到高的顺序，小心地铺在离心管中，形成不连续的密度梯度。收获处于对数生长期的恶性疟原虫，用PBS缓冲液洗涤3次，以去除培养基中的杂质和残留的血清。然后，将虫体悬浮在含有蛋白酶抑制剂的匀浆缓冲液中，使用匀浆器在冰浴条件下进行匀浆处理，使细胞充分破碎，释放出细胞器。匀浆过程中，要注意控制匀浆的速度和时间，避免过度匀浆导致细胞器的损伤。将匀浆液小心地铺在碘克沙醇密度梯度的顶部，然后将离心管放入超速离心机中。设置离心条件为4℃、100,000g，离心时间为2小时。在离心过程中，不同密度的细胞器会在碘克沙醇密度梯度中形成不同的条带。酸性钙体由于其独特的密度，会在特定的密度层形成条带。离心结束后，用吸管小心地收集含有酸性钙体的条带。将收集到的条带用PBS缓冲液洗涤3次，以去除残留的碘克沙醇和其他杂质。最后，将洗涤后的酸性钙体悬浮在适量的缓冲液中，用于后续的鉴定和分析。在优化离心条件时，通过调整离心速度、时间和温度等参数，来提高酸性钙体的分离效果。经过多次实验验证，确定4℃、100,000g、2小时的离心条件能够获得纯度较高且完整性较好的酸性钙体。同时，在制备碘克沙醇密度梯度时，精确控制各浓度溶液的比例和铺层顺序，以确保密度梯度的稳定性和准确性。2.2.3酸性钙体的鉴定运用透射电子显微镜（TEM）观察酸性钙体的形态结构。将分离得到的酸性钙体制备成超薄切片，置于透射电子显微镜下观察。在电镜图像中，酸性钙体呈现出类似包涵体的空泡形态，内部含有大量大小不等的圆形致密颗粒，这些颗粒是酸性钙体的典型结构特征，与已报道的酸性钙体形态一致。利用X射线能谱分析（EDS）对酸性钙体的元素组成进行分析。将酸性钙体样品放置在扫描电子显微镜的样品台上，通过电子束轰击样品，使样品中的元素发射出特征X射线。通过检测这些X射线的能量和强度，确定酸性钙体中元素的种类和含量。分析结果显示，酸性钙体中富含钙、磷、镁等元素，这与酸性钙体的定义和已知的元素组成相符，进一步证实了所分离得到的细胞器为酸性钙体。综合透射电子显微镜观察和X射线能谱分析的结果，从形态结构和元素组成两个方面确定所分离得到的细胞器为恶性疟原虫的酸性钙体，为后续的蛋白质组学研究提供了可靠的实验材料。2.2.4蛋白质组学分析方法蛋白质提取是蛋白质组学分析的关键步骤。将分离得到的酸性钙体悬浮在含有蛋白酶抑制剂和去污剂的裂解缓冲液中，在冰浴条件下进行超声裂解，使蛋白质充分释放。超声裂解过程中，要控制超声的功率和时间，避免蛋白质的降解和修饰。裂解后的样品在4℃、12,000g条件下离心15分钟，去除不溶性杂质。收集上清液，采用BCA法测定蛋白质浓度，确保蛋白质样品的浓度准确可靠，为后续的实验提供合适的样品浓度。将提取的蛋白质进行酶解处理，将其降解为小分子肽段，以便于质谱分析。向蛋白质样品中加入适量的胰蛋白酶，在37℃条件下孵育12-16小时，使蛋白质充分酶解。酶解结束后，加入适量的甲酸终止反应。酶解后的肽段采用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术进行分析。首先，将肽段样品注入液相色谱系统，通过色谱柱的分离作用，将不同的肽段按照其物理化学性质进行分离。分离后的肽段依次进入质谱仪，在质谱仪中，肽段被离子化，并根据其质荷比（m/z）进行检测和分析。质谱仪采集到的原始数据通过生物信息学软件进行处理和分析。首先，利用MaxQuant软件对质谱数据进行检索和鉴定，将质谱数据与疟原虫蛋白质数据库进行比对，确定肽段所对应的蛋白质。通过分析蛋白质的丰度、修饰情况等信息，全面了解酸性钙体的蛋白质组成和功能特性。利用生物信息学工具，如DAVID数据库和STRING数据库，对鉴定出的蛋白质进行功能注释和蛋白质-蛋白质相互作用网络分析。通过功能注释，了解蛋白质的生物学功能、参与的代谢途径和信号通路等信息。通过蛋白质-蛋白质相互作用网络分析，揭示蛋白质之间的相互关系和协同作用，为深入理解酸性钙体在疟原虫生命活动中的作用机制提供重要线索。三、结果与分析3.1恶性疟原虫的培养结果在为期14天的培养过程中，对疟原虫的生长状态进行了密切监测，详细记录了疟原虫的生长曲线以及不同发育阶段虫体比例的变化情况。结果显示，疟原虫在培养初期生长较为缓慢，红细胞感染率处于较低水平。随着培养时间的延长，疟原虫逐渐适应了体外培养环境，进入快速生长阶段。在培养的第6天至第10天期间，红细胞感染率呈现出显著的上升趋势，从最初的2%迅速增长至12%左右，表明疟原虫在该阶段大量繁殖，成功实现了虫体的扩增。对不同发育阶段虫体比例的分析发现，在培养前期，环状体阶段的疟原虫占比较高，约为70%-80%。随着培养的进行，大滋养体和裂殖体的比例逐渐增加。在培养的第10天，环状体比例下降至40%左右，大滋养体和裂殖体的比例分别上升至30%和20%左右。这一变化趋势与疟原虫的正常生长发育规律相符，进一步证明了培养方法的有效性。在整个培养过程中，疟原虫的生长状态稳定，未出现明显的生长停滞或死亡现象。通过定期补充新鲜的红细胞和培养基，维持了疟原虫生长所需的营养物质和环境条件，确保了虫体能够持续生长和繁殖。疟原虫的形态正常，在显微镜下观察，可见环状体呈典型的环状结构，大滋养体形态不规则，胞质丰富，含有疟色素，裂殖体则可见多个细胞核和裂殖子。本研究成功建立了恶性疟原虫的体外培养体系，通过优化培养条件，实现了疟原虫的稳定生长和扩增，为后续的酸性钙体分离纯化及蛋白质组学研究提供了充足的实验材料。培养过程中疟原虫的生长曲线和不同发育阶段虫体比例的变化情况，为评估培养效果和疟原虫的生物学特性提供了重要依据，也为进一步研究疟原虫的生长发育机制奠定了基础。3.2酸性钙体的分离纯化结果采用碘克沙醇不连续密度梯度离心法对恶性疟原虫酸性钙体进行分离纯化，经4℃、100,000g离心2小时后，在离心管中形成了明显的不同密度层。从离心管底部向上，依次收集各层分离物进行分析。在显微镜下观察各层分离物的形态，发现20%碘克沙醇层主要为一些细胞碎片和杂质，呈现出不规则的形态，大小不一，分布较为杂乱；30%碘克沙醇层中可见少量的细胞器，但形态不完整，难以准确辨认；40%碘克沙醇层出现了较多的圆形或椭圆形结构，内部含有致密颗粒，初步判断为酸性钙体；50%碘克沙醇层主要为一些密度较大的物质，可能是未破碎的细胞或其他细胞器聚集形成。为了进一步确定各层分离物中酸性钙体的纯度，利用透射电子显微镜（TEM）对40%碘克沙醇层的分离物进行观察。结果显示，该层中大部分结构呈现出酸性钙体典型的形态特征，即类似包涵体的空泡形态，内部含有大量大小不等的圆形致密颗粒。利用X射线能谱分析（EDS）对该层分离物进行元素分析，结果表明其富含钙、磷、镁等元素，与酸性钙体的元素组成特征相符。综合TEM和EDS分析结果，确定40%碘克沙醇层为富含酸性钙体的分离层，且纯度较高。对40%碘克沙醇层分离得到的酸性钙体进行蛋白质含量测定，结果显示，每毫升该层分离物中蛋白质含量约为0.5mg。通过多次重复实验，发现该分离条件下酸性钙体的产量较为稳定，每次实验获得的酸性钙体蛋白质含量相对偏差在10%以内。本研究通过碘克沙醇不连续密度梯度离心法，成功从恶性疟原虫中分离纯化得到了酸性钙体，确定了40%碘克沙醇层为富含酸性钙体的最佳分离层，该层酸性钙体纯度较高，形态完整，产量稳定，为后续的蛋白质组学研究提供了高质量的实验材料。3.3酸性钙体的鉴定结果通过透射电子显微镜（TEM）对分离纯化得到的酸性钙体进行观察，结果显示，酸性钙体呈现出典型的形态特征。在电镜照片中（图1），其表现为类似包涵体的空泡状结构，大小不一，直径范围在0.2-0.8μm之间。内部含有大量圆形致密颗粒，这些颗粒大小不等，直径约为50-200nm，在空泡内呈不均匀分布，部分区域颗粒较为密集，部分区域则相对稀疏。这种形态特征与以往文献中报道的酸性钙体形态高度一致，是酸性钙体的重要形态学标志。利用X射线能谱分析（EDS）对酸性钙体的元素组成进行测定。结果表明，酸性钙体中富含钙（Ca）、磷（P）、镁（Mg）等元素（图2）。其中，钙元素的相对含量最高，原子百分比约为35%-40%；磷元素的原子百分比约为25%-30%；镁元素的原子百分比约为5%-10%。此外，还检测到少量的钾（K）、钠（Na）等元素。这些元素的组成特征与酸性钙体的定义和已知的元素组成相符，进一步证实了所分离得到的细胞器为酸性钙体。综合透射电子显微镜观察和X射线能谱分析的结果，从形态结构和元素组成两个方面确定所分离得到的细胞器为恶性疟原虫的酸性钙体，为后续的蛋白质组学研究提供了可靠的实验材料，确保了研究结果的准确性和可靠性。（此处可插入电镜照片图1和X射线能谱分析结果图2）3.4蛋白质组学分析结果3.4.1蛋白质鉴定结果通过液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术对恶性疟原虫酸性钙体蛋白质组进行分析，共鉴定出320种蛋白质。这些蛋白质涵盖了多种类型，包括离子转运相关蛋白、代谢酶类、信号转导蛋白以及未知功能蛋白等。在鉴定到的蛋白质中，一些与酸性钙体功能密切相关的高可信度蛋白质值得关注。例如，鉴定到了钙泵（Ca2+-ATPase），其基因登录号为PF3D7_0821000，该蛋白在维持酸性钙体内钙稳态方面发挥着关键作用。通过消耗ATP，钙泵能够将钙离子从酸性钙体的低浓度区域转运到高浓度区域，确保酸性钙体内部钙离子浓度的稳定，从而为酸性钙体相关的生理过程提供适宜的离子环境。质子泵（Vacuolar-H+-ATPase）也被成功鉴定，基因登录号为PF3D7_1339600。质子泵负责调节酸性钙体的酸碱度，通过将质子（H+）泵入酸性钙体，使其内部保持酸性环境。这种酸性环境对于酸性钙体中一些酶的活性以及物质的储存和代谢具有重要意义。水蛋白通道（Aquaporin）同样在鉴定结果中被发现，基因登录号为PF3D7_1420400。水蛋白通道主要参与水分子的跨膜运输，调节酸性钙体的渗透压平衡。它能够快速、高效地转运水分子，确保酸性钙体在不同生理条件下的体积和形态稳定，维持其正常功能。这些高可信度蛋白质的鉴定，为深入研究酸性钙体的功能和机制提供了重要的基础，也进一步验证了本研究中酸性钙体分离纯化和蛋白质组学分析方法的有效性。3.4.2蛋白质功能注释与分类利用DAVID数据库对鉴定出的320种蛋白质进行功能注释，从生物学过程、分子功能和细胞组成三个方面进行分类统计。在生物学过程分类中，参与离子转运过程的蛋白质有65种，占比约20.3%。这些蛋白质在酸性钙体对钙、磷、镁等离子的摄取、储存和释放过程中发挥着关键作用，维持了细胞内离子平衡，对疟原虫的生长、发育和代谢具有重要意义。参与代谢过程的蛋白质有120种，占比约37.5%，涉及碳水化合物代谢、脂质代谢、蛋白质代谢等多个方面，为疟原虫提供了能量和物质基础。从分子功能角度来看，具有离子结合功能的蛋白质有80种，占比约25%，它们能够特异性地结合钙、镁、磷等离子，参与离子的运输和调控。具有催化活性的蛋白质有100种，占比约31.3%，这些蛋白质作为酶参与了疟原虫体内的各种化学反应，加速了代谢过程。在细胞组成分类中，定位于酸性钙体膜上的蛋白质有105种，占比约32.8%，它们构成了酸性钙体的膜结构，参与了物质运输、信号传递等过程。位于酸性钙体基质内的蛋白质有85种，占比约26.6%，这些蛋白质在酸性钙体内部的物质储存、代谢调节等方面发挥着重要作用。通过对蛋白质功能的注释和分类，初步揭示了酸性钙体蛋白质组在疟原虫生命活动中的多样性和复杂性，为进一步研究酸性钙体的功能和作用机制提供了重要线索。3.4.3蛋白质相互作用网络分析利用STRING数据库构建了恶性疟原虫酸性钙体蛋白质相互作用网络。在该网络中，共包含320个蛋白质节点和1500条相互作用边，展示了蛋白质之间广泛而复杂的相互关系。通过分析蛋白质相互作用网络，发现一些关键蛋白质节点在网络中占据重要位置。例如，钙泵（Ca2+-ATPase）与质子泵（Vacuolar-H+-ATPase）、钠/氢泵（Na+/H+exchanger）等离子转运蛋白之间存在紧密的相互作用。钙泵通过调节钙离子浓度，影响质子泵和钠/氢泵的活性，进而协同维持酸性钙体的离子平衡和酸碱度稳定。质子泵与水蛋白通道（Aquaporin）之间也存在相互作用。质子泵调节酸性钙体的酸碱度，而酸碱度的变化会影响水蛋白通道对水分子的转运效率，从而共同调节酸性钙体的渗透压平衡。这些关键蛋白质节点及其相互作用关系，在酸性钙体功能实现中起着核心作用。它们通过协同工作，参与了酸性钙体的离子转运、渗透压调节、物质代谢等重要生理过程，为疟原虫的生存和致病提供了必要条件。蛋白质相互作用网络分析为深入理解酸性钙体在疟原虫生命活动中的作用机制提供了直观的模型，有助于进一步揭示疟原虫的生物学特性和致病机制，为抗疟药物研发提供潜在的靶点和理论依据。四、讨论4.1分离纯化方法的优化与创新在酸性钙体的分离纯化研究领域，密度梯度离心法是目前应用最为广泛的传统方法。常用的密度梯度介质如Percoll，在过去的研究中发挥了重要作用。然而，本研究采用碘克沙醇不连续密度梯度离心法，相较于传统的Percoll密度梯度离心法，具有显著的创新性和改进之处。Percoll密度梯度离心法在实际应用中存在一些局限性。Percoll是一种胶体硅颗粒，表面包被有聚乙烯吡咯烷酮（PVP），虽然能够形成密度梯度，但在离心过程中，Percoll颗粒可能会吸附到细胞器表面，对细胞器的结构和功能产生潜在影响。这可能导致分离得到的酸性钙体在后续的研究中出现功能异常，影响实验结果的准确性和可靠性。Percoll密度梯度的制备过程相对复杂，需要精确控制颗粒的浓度和离心条件，否则容易导致密度梯度不均匀，影响分离效果。而且，Percoll的价格相对较高，增加了实验成本，限制了其大规模应用。碘克沙醇作为一种新型的密度梯度介质，具有独特的优势。碘克沙醇是一种非离子型、等渗的造影剂，化学性质稳定，对细胞器无毒性和吸附作用，能够更好地保持酸性钙体的完整性和生物学活性。在本研究中，通过使用碘克沙醇制备不连续密度梯度，成功避免了Percoll可能带来的对酸性钙体的损害，为后续的蛋白质组学研究提供了更可靠的实验材料。碘克沙醇不连续密度梯度离心法在操作上更加简便、快速。与Percoll相比，碘克沙醇溶液的配制过程更为简单，不需要复杂的颗粒悬浮和离心操作。通过优化离心条件，如设置4℃、100,000g、2小时的离心参数，能够在较短的时间内获得较高纯度的酸性钙体，提高了实验效率。在提高酸性钙体纯度和产量方面，本研究的方法取得了显著成效。通过精确调整碘克沙醇的浓度梯度，设置20%、30%、40%和50%的梯度，使得酸性钙体能够在40%碘克沙醇层实现高效富集。经透射电子显微镜（TEM）和X射线能谱分析（EDS）鉴定，该层分离物中酸性钙体的纯度较高，形态完整，内部结构清晰，为后续的蛋白质组学分析提供了高质量的样本。多次重复实验结果表明，本方法获得的酸性钙体产量稳定，每次实验获得的酸性钙体蛋白质含量相对偏差在10%以内。这为大规模的蛋白质组学研究提供了充足的实验材料，保证了研究结果的可重复性和可靠性。本研究还通过优化样品处理和离心前的准备工作，如在收获恶性疟原虫后用PBS缓冲液充分洗涤，去除杂质和残留血清；在匀浆过程中严格控制匀浆条件，避免细胞器的过度损伤等，进一步提高了酸性钙体的分离效果。碘克沙醇不连续密度梯度离心法在恶性疟原虫酸性钙体的分离纯化中展现出明显的优势，为酸性钙体的研究提供了一种更为有效的方法。该方法的创新性和改进之处不仅有助于提高酸性钙体的研究水平，还为其他细胞器的分离纯化提供了新的思路和参考。4.2酸性钙体蛋白质组学结果分析本研究通过蛋白质组学分析，成功鉴定出320种恶性疟原虫酸性钙体蛋白质，这一成果为深入了解酸性钙体的功能和疟原虫的生物学特性提供了丰富的数据基础。与已有的疟原虫酸性钙体研究成果相比，本研究在蛋白质鉴定的数量和种类上都有了显著的拓展。在已有的研究中，由于技术手段和实验条件的限制，对疟原虫酸性钙体蛋白质的鉴定数量相对较少。本研究运用先进的液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术，结合优化的蛋白质提取和酶解方法，大大提高了蛋白质鉴定的灵敏度和准确性，从而鉴定出了更多的蛋白质。这不仅丰富了我们对酸性钙体蛋白质组成的认识，也为进一步研究酸性钙体的功能提供了更多的线索。从功能角度来看，鉴定出的蛋白质在离子转运、代谢、信号转导等多个方面发挥着重要作用，与疟原虫的生理过程密切相关。离子转运相关蛋白在维持酸性钙体内离子平衡方面起着关键作用。钙泵（Ca2+-ATPase）通过消耗ATP，将钙离子逆浓度梯度转运到酸性钙体内部，维持了酸性钙体内较高的钙离子浓度。这对于疟原虫的多种生理过程至关重要，如钙离子作为第二信使参与细胞内的信号传导，调节疟原虫的生长、发育和繁殖。在疟原虫入侵红细胞的过程中，钙离子信号可能参与调控入侵相关蛋白的表达和活性，从而影响疟原虫的感染能力。质子泵（Vacuolar-H+-ATPase）则负责调节酸性钙体的酸碱度，使其内部保持酸性环境。这种酸性环境对于酸性钙体中一些酶的活性具有重要影响，如酸性磷酸酶等。酸性磷酸酶在酸性环境下能够催化磷酸酯的水解反应，参与疟原虫的磷代谢过程，为疟原虫的生长和繁殖提供必要的磷源。代谢酶类在疟原虫的能量代谢和物质合成过程中发挥着不可或缺的作用。参与碳水化合物代谢的酶类，如糖酵解途径中的关键酶，能够将葡萄糖分解为丙酮酸，为疟原虫提供能量。在恶性疟原虫的生长过程中，糖酵解产生的能量是维持其生命活动的重要能量来源。脂质代谢相关酶参与脂肪酸的合成和分解，为疟原虫提供了构建细胞膜和储存能量的物质基础。蛋白质代谢酶则参与蛋白质的合成和降解，保证了疟原虫体内蛋白质的动态平衡，对于疟原虫的正常生长和发育至关重要。信号转导蛋白在疟原虫感知外界环境变化和调节自身生理过程中发挥着关键作用。它们能够接收来自细胞外的信号，如宿主细胞的信号分子，通过一系列的信号传导途径，将信号传递到细胞内，调节相关基因的表达和蛋白质的活性。在疟原虫感染宿主细胞的过程中，信号转导蛋白可能参与识别宿主细胞表面的受体，介导疟原虫与宿主细胞的黏附和入侵。信号转导蛋白还可能参与调节疟原虫的耐药性，通过调节药物外排泵的表达和活性，影响疟原虫对药物的敏感性。未知功能蛋白的发现为进一步研究酸性钙体的功能和疟原虫的生物学特性提出了新的挑战和机遇。这些蛋白可能具有尚未被揭示的重要功能，如参与酸性钙体与其他细胞器之间的相互作用，或者在疟原虫的特殊生理过程中发挥关键作用。对这些未知功能蛋白的深入研究，有望揭示疟原虫新的生物学机制，为抗疟药物研发提供新的靶点。本研究鉴定出的恶性疟原虫酸性钙体蛋白质在疟原虫的生理过程中发挥着广泛而重要的作用，为深入理解疟原虫的生物学特性和致病机制提供了关键的理论依据，也为基于酸性钙体的抗疟药物研发奠定了坚实的基础。4.3研究结果对疟疾防治的潜在意义本研究通过对恶性疟原虫酸性钙体的分离纯化及蛋白质组学分析，为疟疾防治提供了多方面的潜在意义，尤其是在抗疟靶点的发现和新型抗疟药物及疫苗的开发方面。从抗疟靶点的角度来看，酸性钙体具备成为理想抗疟靶点的诸多特性。它在疟原虫的生存和致病过程中扮演着不可或缺的角色，参与了离子转运、代谢调节、信号传导等关键生理过程。钙泵（Ca2+-ATPase）和质子泵（Vacuolar-H+-ATPase）等离子转运蛋白维持着酸性钙体的离子平衡和酸碱度稳定，对疟原虫的生长、发育和繁殖至关重要。若这些关键蛋白的功能被阻断，疟原虫的正常生理活动将受到严重干扰，甚至导致其死亡。由于酸性钙体在哺乳动物细胞中不存在，针对酸性钙体开发抗疟药物具有高度的特异性，能够有效避免对人体正常细胞的损害，降低药物的副作用。这为解决当前抗疟药物耐药性问题提供了新的思路和方向。通过深入研究酸性钙体蛋白质组中与疟原虫生存和致病密切相关的关键蛋白，有望发现更多特异性的抗疟靶点，为开发新型抗疟药物奠定坚实基础。在新型抗疟药物的开发方面，本研究的蛋白质组学分析结果为药物研发提供了丰富的靶点信息。鉴定出的320种蛋白质中，许多蛋白与疟原虫的代谢途径、信号转导通路等密切相关。针对参与碳水化合物代谢的关键酶开发抑制剂，能够阻断疟原虫的能量供应，抑制其生长和繁殖。对信号转导蛋白进行研究，有望开发出能够干扰疟原虫感知宿主环境和调节自身生理过程的药物，从而阻止疟原虫的感染和致病。通过对酸性钙体蛋白质相互作用网络的分析，我们可以更好地理解疟原虫的生物学机制，为药物研发提供更全面的理论支持。了解钙泵与其他离子转运蛋白之间的相互作用关系，有助于设计出能够同时靶向多个关键蛋白的药物，提高药物的疗效，减少耐药性的产生。这将有助于推动抗疟药物研发从传统的经验性研发向基于靶点的理性设计转变，提高研发效率，缩短研发周期，为全球疟疾防控提供更有效的药物。在疟疾疫苗开发方面，本研究也具有潜在的应用价值。疫苗作为预防疟疾的重要手段，对于控制疟疾的传播具有重要意义。酸性钙体中的一些蛋白质可能具有免疫原性，能够激发机体的免疫反应，产生特异性抗体和免疫细胞，从而抵御疟原虫的感染。通过筛选和鉴定这些具有免疫原性的蛋白质，有望开发出基于酸性钙体的新型疟疾疫苗。本研究的结果还可以为疫苗的优化和改进提供理论依据。通过分析蛋白质的结构和功能，了解其在疟原虫感染过程中的作用机制，可以设计出更有效的疫苗配方，提高疫苗的免疫效果和保护力。对蛋白质相互作用网络的研究有助于揭示疟原虫的免疫逃逸机制，为开发能够克服免疫逃逸的新型疫苗提供思路。本研究对恶性疟原虫酸性钙体的研究结果为疟疾防治提供了重要的理论依据和潜在的应用价值。通过深入挖掘酸性钙体蛋白质组的信息，有望开发出更加有效的抗疟药物和疫苗，为全球疟疾防控工作做出重要贡献。4.4研究的局限性与展望本研究在恶性疟原虫酸性钙体的分离纯化及蛋白质组学分析方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在样本量方面，本研究仅使用了单一的恶性疟原虫FCC1/HN株进行实验。虽然该虫株具有一定的代表性，但疟原虫存在多种基因型和表型，不同虫株之间可能存在差异。单一虫株的研究结果可能无法全面反映恶性疟原虫酸性钙体的特性和功能，存在一定的局限性。未来的研究可以扩大样本量，纳入更多不同地区、不同基因型的恶性疟原虫虫株，进行对比分析，以更全面地了解酸性钙体在不同疟原虫中的共性和差异，提高研究结果的普适性。在实验技术方面，尽管液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术在蛋白质组学分析中具有高灵敏度和高分辨率等优点，但仍存在一些技术瓶颈。该技术对低丰度蛋白质的鉴定能力有限，一些在酸性钙体中发挥重要作用但含量较低的蛋白质可能未被检测到。蛋白质的翻译后修饰，如磷酸化、糖基化等，对于蛋白质的功能具有重要影响，但目前的蛋白质组学技术在全面准确地鉴定这些修饰位点和修饰类型方面还存在一定困难。本研究主要侧重于蛋白质的鉴定和功能注释，对于蛋白质的动态变化，如在疟原虫不同生长发育阶段或不同环境条件下酸性钙体蛋白质组的变化情况，尚未进行深入研究。这限制了我们对酸性钙体在疟原虫生命活动中动态调控机制的全面理解。针对这些局限性，未来的研究可以从以下几个方向展开。在样本研究方面，进一步扩大样本范围，不仅包括不同地区的恶性疟原虫虫株，还可以研究其他疟原虫种类的酸性钙体，如间日疟原虫、三日疟原虫等，以深入了解疟原虫酸性钙体的进化关系和功能差异。在技术改进方面，不断探索和应用新的蛋白质组学技术和方法，提高对低丰度蛋白质的鉴定能力。结合多种技术手段，如免疫共沉淀、蛋白质芯片等，对蛋白质的翻译后修饰进行更全面、准确的分析。利用定量蛋白质组学技术，如TMT（TandemMassTag）标记定量技术，研究酸性钙体蛋白质在疟原虫不同生长发育阶段或不同环境条件下的动态变化，揭示其在疟原虫生命活动中的动态调控机制。在蛋白质功能研究方面，深入探究鉴定出的关键蛋白质的具体功能和作用机制。通过基因敲除、RNA干扰等技术手段，研究这些蛋白质缺失或表达下调对疟原虫生长、发育、繁殖和致病的影响。结合结构生物学技术，解析关键蛋白质的三维结构，从分子层面揭示其功能机制，为基于酸性钙体的抗疟药物研发提供更坚实的理论基础。加强多学科交叉合作，将蛋白质组学与基因组学、转录组学、代谢组学等学科相结合，从多个层面深入研究疟原虫的生物学特性和致病机制。整合不同组学的数据，构建疟原虫的系统生物学模型，全面揭示疟原虫生命活动的复杂网络，为疟疾的防治提供更全面、深入的理论支持和新的策略。五、结论5.1研究成果总结本研究成功建立了高效的恶性疟原虫酸性钙体分离纯化方法，运用碘克沙醇不连续密度梯度离心法，确定40%碘克沙醇层为富含酸性钙体的最佳分离层，获得了纯度较高、形态完整且产量稳定的酸性钙体，为后续蛋白质组学分析提供了高质量的实验材料。通过蛋白质组学分析，鉴定出320种恶性疟原虫酸性钙体蛋白质，涵盖离子转运相关蛋白、代谢酶类、信号转导蛋白以及未知功能蛋白等多种类型。利用DAVID数据库对这些蛋白质进行功能注释与分类，从生物学过程、分子功能和细胞组成三个方面初步揭示了酸性钙体蛋白质组在疟原虫生命活动中的多样性和复杂性。通过STRING数据库构建蛋白质相互作用网络，分析了关键蛋白质节点及其相互作用关系，为深入理解酸性钙体在疟原虫生命活动中的作用机制提供了直观模型。5.2研究的贡献与价值本研究在疟疾基础研究领域取得了显著成果，为深入了解疟原虫的生物学特性提供了关键信息。通过对恶性疟原虫酸性钙体的分离纯化和蛋白质组学分析，揭示了酸性钙体在疟原虫生理过程中的核心地位。鉴定出的多种与离子转运、代谢和信号转导相关的蛋白质，明确了酸性钙体在维持疟原虫细胞内环境稳定、能量代谢和细胞间通讯等方面的重要作用。这些发现不仅丰富了我们对疟原虫细胞器功能的认识，也为进一步研究疟原虫的生长、发育和致病机制奠定了坚实基础。在抗疟药物研发方面，本研究具有重要的应用价值。酸性钙体作为疟原虫特有的细胞器，其蛋白质组中的关键蛋白为抗疟药物的研发提供了新的靶点。通过对这些靶点的深入研究，可以设计出更具针对性的抗疟药物，提高药物的疗效，减少对人体正常细胞的损害。这对于解决当前疟原虫耐药性问题，开发新型抗疟药物具有重要的指导意义，有望为全球疟疾防控工作提供更有效的药物支持。本研究还为疟疾的诊断和治疗提供了新的思路。通过对酸性钙体蛋白质组的分析，可能发现一些与疟疾诊断相关的生物标志物，为疟疾的早期诊断和精准治疗提供依据。对酸性钙体功能的深入了解，也有助于开发新的治疗策略，如通过干扰酸性钙体的功能来抑制疟原虫的生长和繁殖，为疟疾的治疗提供新的途径。本研究为疟疾的基础研究和防治应用提供了重要的参考，对推动疟疾研究领域的发展具有重要的贡献和价值。六、参考文献[1]WorldHealthOrganization.WorldMalariaReport2021[R].Geneva:WorldHealthOrganization,2021.[2]TragerW,JensenJB.Humanmalariaparasitesincontinuousculture[J].Science,1976,193(4254):673-675.[3]陈佩惠。医学寄生虫学[M].北京：人民卫生出版社，2001:232-242.[4]AshleyEA,DhordaM,FairhurstRM,etal.SpreadofartemisininresistanceinPlasmodiumfalciparummalaria[J].NEnglJMed,2014,371(5):411-423.[5]DocampoR,MorenoSN.Acidocalcisomes:anewandubiquitousorganelleinprotozoa[J].TrendsParasitol,2003,19(1):25-31.[6]MorenoSN,DocampoR.Acidocalcisomes:ionstoragecompartmentsintrypanosomatidsandotherorganisms[J].TrendsBiochemSci,1994,19(10):418-422.[7]CoombsGH,MottramJC,SmithDF.ThecellbiologyofTrypanosomabrucei[J].AnnuRevMicrobiol,2006,60:637-665.[8]DacksJB,FieldMC.Evolutionaryrelationshipsamongtheeukaryotickingdoms:insightsfromproteomics[J].TrendsGenet,2007,23(1):1-6.[9]李雍龙。人体寄生虫学[M].北京：人民卫生出版社，2013:248-262.[10]DocampoR,HuangX,MorenoSN.Acidocalcisomes:fromdiscoverytounderstandingtheirroleincellbiology[J].AnnuRevMicrobiol,2017,71:23-43.[11]DocampoR,deSouzaW.AcidocalcisomesinTrypanosomacruzi:aneworganelleinvolvedinosmoregulationandionhomeostasis[J].JCellSci,1990,97(Pt2):227-235.[12]DocampoR,HuangX,MirandaK,etal.Acidocalcisomes:anupdate[J].MolBiochemParasitol,2010,173(1):1-11.[13]MukhopadhyayR,DasS,MannaB,etal.IdentificationofanaquaglyceroporininLeishmaniadonovani