免疫组化实验标准操作流程

免疫组化实验标准操作流程免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）技术通过抗原-抗体特异性结合反应，结合显色系统定位检测组织或细胞中靶抗原的表达，广泛应用于病理诊断、基础科研及药物研发等领域。标准化的操作流程是确保实验结果准确、可重复的核心前提，以下结合实践经验，详述免疫组化实验的标准操作流程及关键要点。一、实验前准备：材料与环境（一）试剂准备根据实验需求，提前配置或准备以下试剂（以HRP-DAB显色系统为例）：脱蜡与水化试剂：新鲜二甲苯（Ⅰ、Ⅱ）、梯度乙醇（100%、95%、85%、75%）、蒸馏水。抗原修复液：柠檬酸盐修复液（pH6.0，适用于多数抗原）或EDTA修复液（pH8.0，适用于磷酸化蛋白等难修复抗原）。封闭液：与一抗种属对应的正常血清（如兔抗一抗用山羊血清）或牛血清白蛋白（BSA，5%）。抗体：一抗（按说明书稀释，如1:100-1:500）、二抗（HRP标记，如goatanti-rabbitIgG-HRP，1:200-1:500）。显色系统：DAB显色液（底物液+显色剂，现配现用）。复染试剂：苏木精染液、1%盐酸乙醇分化液、自来水（用于返蓝）。封片试剂：中性树胶、二甲苯（Ⅰ、Ⅱ，透明用）。（二）仪器与耗材仪器：60℃烤箱、微波炉/高压锅（抗原修复用）、恒温孵育箱、水浴锅、超净工作台、光学显微镜、移液器（0.5-10μL、____μL）、湿盒（内置浸湿滤纸保持湿度）。耗材：防脱载玻片、盖玻片、染色缸、量筒、吸水纸、一次性滴管。二、操作流程：从切片预处理到结果观察（一）组织切片预处理：脱蜡与水化1.脱蜡：将石蜡切片置于60℃烤箱烘烤30分钟（厚切片可延长至40分钟），使石蜡融化。随后依次放入新鲜二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10分钟（二甲苯需定期更换，避免脱蜡不彻底），去除切片中残留的石蜡。2.水化：将脱蜡后的切片依次移入100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中各浸泡5分钟，梯度降低乙醇浓度，使组织从有机相过渡到水相，为后续抗原修复创造条件。最后用蒸馏水冲洗2次，每次2分钟。（二）抗原修复：暴露靶抗原表位抗原修复的目的是打破组织固定过程中形成的蛋白交联，暴露被掩盖的抗原表位。根据抗原特性选择修复方式：微波修复（常用）：将切片放入修复液（柠檬酸盐或EDTA）中，置于微波炉内，高火加热至液体沸腾后，调至中火保持微沸15-20分钟（骨组织、纤维组织可延长至25分钟）。修复完成后，自然冷却至室温（避免冷水冲洗导致抗原重新封闭）。高压锅修复：将切片与修复液放入高压锅内，上汽后计时2-3分钟，自然放气后冷却。此方法修复效率高，适用于难修复抗原，但需注意防止切片脱落。酶修复：如胰蛋白酶（0.1%）或胃蛋白酶（0.4%），37℃孵育10-30分钟，适用于特定抗原（需参考抗体说明书）。（三）内源性过氧化物酶阻断（HRP系统必做）为避免组织自身的过氧化物酶干扰显色，需进行阻断：将切片放入3%过氧化氢溶液（甲醇或蒸馏水配制）中，室温孵育10分钟，随后用PBS（含0.05%Tween-20，简称PBS-T）冲洗3次，每次5分钟。（四）封闭非特异性结合位点滴加封闭液（如5%正常山羊血清或BSA）于切片上，室温封闭30分钟（或4℃封闭1小时）。封闭液需覆盖组织区域，避免切片干燥。封闭的目的是阻断血清蛋白或BSA与非特异性IgG结合位点，减少背景染色。（五）一抗孵育：特异性结合靶抗原1.按说明书或预实验结果稀释一抗（如1:200），用抗体稀释液（含BSA和防腐剂）配制，避免反复冻融抗体。2.吸去封闭液，滴加稀释后的一抗，4℃湿盒内孵育过夜（或室温孵育2-3小时，过夜孵育更充分）。孵育期间需保持湿盒内湿度，可在盒底放置浸湿的滤纸。3.孵育结束后，用PBS-T冲洗切片3次，每次5分钟，洗去未结合的一抗。（六）二抗孵育：放大信号并偶联酶分子1.选择与一抗种属对应的二抗（如兔抗一抗用goatanti-rabbitIgG-HRP），用封闭液或PBS稀释（1:200-1:500）。2.滴加二抗，室温孵育30分钟（避免光照，防止HRP失活）。3.用PBS-T冲洗切片3次，每次5分钟，去除未结合的二抗。（七）显色反应：可视化抗原-抗体复合物1.现配DAB显色液：将DAB底物液与显色剂按1:100比例混合（如1mL底物液+10μL显色剂），避光保存。2.滴加DAB显色液于切片上，室温避光显色3-10分钟，期间需在显微镜下实时观察：当阳性区域出现清晰的棕黄色信号、背景未明显加深时，立即用蒸馏水冲洗终止反应（过染会导致背景浑浊，欠染则信号弱）。（八）复染细胞核：区分组织结构1.滴加苏木精染液，室温孵育3-5分钟（淋巴组织可缩短至2分钟，心肌组织延长至5分钟），使细胞核染成蓝色。2.蒸馏水冲洗后，用1%盐酸乙醇分化液处理10-20秒（轻晃切片，至细胞核蓝色变浅、背景透明），自来水冲洗返蓝5分钟，最后用蒸馏水冲洗干净。（九）脱水、透明与封片1.脱水：将切片依次放入75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中各脱水3分钟，去除组织中的水分。2.透明：移入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各透明5分钟，使组织透明，便于封片后观察。3.封片：滴加1滴中性树胶于切片中央，盖上盖玻片（避免气泡），轻轻按压使树胶均匀分布，室温晾干或37℃烤箱烘干后，即可在显微镜下观察。三、关键注意事项：保障实验质量的细节（一）试剂管理抗体需按说明书分装（如5-10μL/管），-20℃或-80℃保存，避免反复冻融；稀释后的抗体需在4℃短期使用（<1周），或-20℃分装冻存。脱蜡用的二甲苯和乙醇需定期更换（如每周更换1次），防止杂质积累导致脱蜡不彻底或背景污染。DAB显色液为致癌试剂，需佩戴手套、口罩，在通风橱内操作，废液需单独收集处理。（二）操作环境与切片处理实验全程需在洁净环境下进行（如超净台），避免灰尘、毛发等污染切片，尤其是滴加抗体和显色液时。使用防脱载玻片（或涂覆多聚赖氨酸/APES），防止孵育过程中切片脱落；若切片脱落，需重新实验。（三）孵育条件控制湿盒内需放置浸湿的滤纸，保持湿度（湿度不足会导致切片干燥、非特异性染色）；孵育温度需稳定（4℃或室温），避免温度波动影响抗原抗体结合。一抗孵育时间可根据抗体特性调整：高亲和力抗体可缩短至2小时，低亲和力抗体需延长至过夜。（四）显色与复染的灵活性显色时间需“因片而异”：不同组织（如肿瘤vs正常组织）、不同抗体的显色速度不同，需通过预实验确定最佳时间（如3分钟、5分钟、8分钟分别显色，对比效果）。复染时间需平衡细胞核与阳性信号的对比度：苏木精过染会掩盖阳性信号，欠染则细胞核不清晰，需根据组织类型微调（如上皮组织复染3分钟，间质组织复染5分钟）。（五）结果稳定性与重复性同一批次实验需使用相同的试剂、仪器和操作条件（如孵育时间、温度），减少批次间差异。若需定量分析，建议采用图像分析软件（如ImageJ），并设置至少3个重复切片，取平均值。四、结果判读：从信号定位到强度评估镜下观察时，需关注以下要点：信号定位：阳性信号的部位（细胞膜、细胞质或细胞核）可辅助判断抗原的功能状态（如细胞膜抗原提示受体表达，核抗原提示转录因子激活）。染色强度：分为阴性（无棕黄色信号）、弱阳性（淡黄色，低倍镜下隐约可见）、中等阳性（棕黄色，高倍镜下清晰）、强阳性（深棕褐色，信号浓郁）。背景评估：理想的结果应背景清晰（无弥漫性棕黄色染色），若背景过深，需排查封闭不充分、抗体浓度