禽沙门氏菌病主要病原菌的比较基因组分析及其特异性抗原的搜寻研究

禽沙门氏菌病主要病原菌的比较基因组分析及其特异性抗原的搜寻研究一．研究目的沙门氏菌病是一种人畜共患病，禽沙门氏菌病是由肠杆菌科、沙门氏菌属中沙门氏菌引起的禽类疾病总称。家禽感染沙门氏菌后，生产性能会下降，如死淘率提高，产蛋率下降，受精率和孵化率下降，生长速度变缓等。我国禽沙门氏菌病的发病较高，是危害养禽业的重要疾病。故本项目利用生物信息学方法系统分析不同型禽沙门氏菌株的基因组，并构建可以反映各个菌株系统发育和水平基因转移的全基因组进化树，之后筛选出各个菌株特有的或同源性较低的基因，从这些基因编码的蛋白中预测筛选出可能具有较强免疫原性的外膜蛋白，预测其抗原决定簇，为日后禽沙门氏菌病的检测和预防做铺垫，对有针对性的采取相应的净化流程、减少禽伤寒的损失、有效的预防和截断禽伤寒的传播具有科学指导意义。同时，基因组比较分析的结果还可以用于分析这几种禽沙门氏菌的系统进化过程。由于亲缘关系十分接近，传统的16S进化树无法准确反映实际的系统发育关系，故本项目计划利用生物信息学方法系统分析不同型禽沙门氏菌株的基因组，并构建可以反映各个菌株系统发育和水平基因转移的基因组进化树，之后筛选出各个菌株特有的或同源性较低的基因，从这些基因编码的蛋白中预测筛选出可能具有较强免疫原性的外膜蛋白，预测其抗原决定簇，为日后禽沙门氏菌病的检测和预防做铺垫，对有针对性的采取相应的净化流程、减少禽伤寒的损失、有效的预防和截断禽伤寒的传播具有科学指导意义。二．研究背景：沙门氏菌病是一种人畜共患病，家禽感染沙门氏菌后，生产性能会下降，如死淘率提高，产蛋率下降，受精率和孵化率下降，生长速度变缓等。沙门氏菌还能通过垂直传播感染雏鸡，当人食用被沙门氏菌污染的鸡蛋或鸡肉后可能会发生细菌性食物中毒。我国禽沙门氏菌病的发病较高，20世纪90年代种鸡场阳性率平均值为12％。近三年来，鸡白痢发病数量占禽发病总数的1/3左右，是危害养禽业的重要疾病。根据我国疫控中心的数据显示，2016年，曾祖代蛋鸡、祖代蛋鸡、祖代肉鸡，鸡白痢和禽伤寒抗体的阳性率分别高达25%、25%、35%。我国鸡白痢发病多（占禽发病数量的1/3）、流行范围广泛（29省）；中小规模（100只以下和101-1000头之间）和散养户发病率更高。禽类沙门氏菌感染对我国禽类生产造成重大损失，对人民健康也造成了很大威胁。食品安全是人类面临的大问题，沙门氏菌又是极其重要的一类。1885年沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，故定名为沙门氏菌属。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。因沙门氏菌病经粪口途径传播，故摄入污染了沙门氏菌的食物或饮料是唯一的感染方式。沙门氏菌在自然界有广泛的宿主，少数沙门氏菌对宿主有选择性，绝大多数对人和动物均适应，可寄居在哺乳类、爬行类、鸟类、昆虫及人的胃肠道中，种类繁多的家养和野生动物的感染率在1%~20%以上。故各种家禽、家畜在喂养、屠宰、运输、包装等加工处理过程中均有污染的机会。如家禽、家畜屠宰时的卫生条件差，肠腔的沙门氏菌就可污染肉类。此外，肉类等也可在贮藏、市场出售、厨房加工等过程中通过各种用具或直接互相污染，其中在零售市场购买的生肉有1%~58%污染了沙门菌。蛋类或蛋制品的污染来源，可以是禽类卵巢或输尿管，也可以由粪便、肥料、泥土中的沙门氏菌穿过完整蛋壳进入蛋内。一般在许多由蛋混合制成的蛋粉或其他制品中，感染率相当高:乳类及其制品如冰淇淋、袋装熟食等也会受到沙门氏菌的污染。以上各种动物源性食物是引起沙门氏菌感染的最常见媒介物。以动物脏器为原料的某些生物制剂，如酶、激素、胆盐、食用染料等偶尔也会引起感染。发展中国家常常有水源污染造成的暴发流行，污水灌溉、生熟不分是散发或家庭集团内流行最常见的原因。人与人的直接传播常以护理人员的手、医疗器械为媒介，为医院内感染或幼托机构中暴发流行的主要原因。三．研究方法：1.分离收集沙门氏菌的相关菌株基因组数据。从NCBI等数据库下载多种沙门氏菌的全基因组数据。2.对多个禽沙门氏菌株基因组中的所有蛋白进行同源性比较，筛选出各个菌株特有的或同源性较低的基因。3.用于分析的沙门氏菌株（见下表）。4.不同种属及亚种沙门菌基因组比较。5.构建28株完全测序沙门菌系统进化树。四．研究结果：1.28株完全测序沙门菌基因数目与基因组大小频数分布图上图为已测序的28株菌的基因数与基因组大小的频数分布图，从图中可以看的肠道沙门阁-般基因数量为4600-4700.基因组大小一般在4.8-5.0Mb之间。2.沙门菌致病岛在不同种属及亚种菌株中的分布已完成全基因组测序的28个沙门菌中SamorellarentericaTyphiCT18基因组最大，为5,133.713bp.SalmoneilabongoriNCTC12419基因组最小，为4.460.105.而编码基因最多的足SalmonellarentericoParalyphiB,SPB7，为5772个，编码基因最少的还是SalmonellabongoriNCTC12419。3.28株完全测序沙门菌系统进化树五．讨论：沙门菌是寄居在人类动物肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰阴性杆菌。它是一种肠道致病菌，常常因为误食不洁食物引起，感染者出现严重腹泻。是人类食物中毒的主要病原之一。据世界卫生组织的报告，1985年以来，在世界范围内，由沙门氏菌引起的已确诊的人类患病人数显著增加，在一些欧洲国家已增加五倍以上。在我国内陆地区，由沙门氏菌引起的食物中毒屡居首位。据资料统计，在我国细菌性食物中毒中，70%~80%是由沙门氏菌引起，而在引起沙门氏菌中毒的食品中，90%以上是肉类等动物性产品。动物性产品中含有多种丰富的营养成分，非常适宜于沙门氏菌的生长繁殖，人们一旦摄入了含有大量沙门氏菌(10E5~10E6个/g)的动物性产由沙门氏菌引起的疾病主要分为两大类:一类是伤寒和副伤寒，另一类是急性肠胃炎。其中鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等是污染动物性产品，进而引起人类沙门氏菌食物中毒的主要致病菌。沙门氏菌污染主要来源于患病的人和动物及其带菌者，主要由其粪便、尿、乳汁以及流产胎儿、胎衣和羊水排出的病菌污染水源、土壤和饲料等，其中饲料和水源的污染是导致沙门氏菌传染的主要原因。各种饲料中均可发现沙门氏菌，尤其是动物性饲料(如鱼粉)常见。禽畜感染沙门氏菌可引起相应的传染病，如猪霍乱、鸡白痢等。一般情况下畜禽肠道带菌率比较高，当动物因患病、衰弱、营养不良、疲劳以致抵抗力降低时，肠道中的沙门氏菌即可经肠系膜淋巴结和组织进入血液引起全身感染，甚至死亡。例如，猪霍乱沙门氏菌可引起仔猪副伤寒，急性病例出现败血症变化，死亡率相当高。慢性病例产生坏死性肠炎，影响猪的生长发育。鸡白痢沙门氏菌，主要侵害雏鸡，引起败血症，可造成大批死亡。在成年母鸡则主要引起孵巢炎，可在卵黄内带菌而传给幼雏。后续将从基因组水平对不同血清型的禽沙门氏菌进行系统进化分析。针对亲缘关系十分接近的禽沙门氏菌，传统的单一基因进化树无法准确反映各个菌株间的进化和水平基因转移。后续将采用自主研发的程序将全基因组上千个基因进化树综合构建为可以准确反映各个菌株系统发育和水平基因转移的超级进化树。深化对不同血清型沙门氏菌株的系统进化关系和毒力、耐药性的传播等的研究。后续将利用生物信息学方法高通量预测专一性抗原的抗原决定簇，并采用抗原决定簇肽段替代全蛋白作为检测抗原。此方法将极大地降低生产成本，显著地提高抗原的免疫原性。化学合成的肽段的纯度、一致性、稳定性完全可以保证，也便于检测标准的制定。之后对筛选出的各个菌株特有的或同源性较低的基因编码的蛋白预测筛选出可能具有较强免疫原性的外膜蛋白。由于直接将蛋白用于免疫检测诊断容易产生交叉反应，降低检测的特异性和灵敏度，也将提高研发和生产成本，因此鉴定到的特异性抗原蛋白将利用软件预测其抗原决定簇，但生物信息学筛选出的蛋白将会很多，而一个蛋白通常有多个抗原决定簇。我们将裂解沙门氏菌细胞，利用超速离心的方法分离得到不同的外膜组分。对分离的得到的外膜蛋白进行质谱鉴定，寻找各个菌株的特异性蛋白，并用IEDB

Analysis等软件预测其抗原决定簇肽段序列。六．展望沙门氏菌病是一种人畜共患病，家禽感染沙门氏菌后，生产性能会下降，如死淘率提高，产蛋率下降，受精率和孵化率下降，生长速度变缓等。本项目为日后禽沙门氏菌病的检测和预防做铺垫，对有针对性的采取相应的净化流程、减少禽伤寒的损失、有效的预防和截断禽伤寒的传播具有科学指导意义。同时，研究结果将为我们了解不同血清型沙门氏菌株的系统进化关系和毒力、耐药性的传播等等具有重要的科学指导意义。从基因组水平对不同血清型的禽沙门氏菌进行系统进化分析。针对亲缘关系十分接近的禽沙门氏菌，传统的单一基因进化树无法准确反映各个菌株间的进化和水平基因转移。本项目将全基因组上千个基因进化树综合构建为可以准确反映各个菌株系统发育和水平基因转移的进化树。深化对不同血清型沙门氏菌株的系统进化关系和毒力、耐药性的传播等的研究。利用比较基因组、比较蛋白质组等研究方法筛选鉴定不同禽类伤寒病原体的特异性抗原蛋白，并进一步得到专一、高效、准确的特异性免疫检测抗原肽段。并通过产品转化，使得通过简单的显色、试纸等方法就能快速的鉴定禽类感染了哪种伤寒病原体。从而能有针对性的采取相应的净化流程，减少禽伤寒的损失，并有效的预防和截断禽伤寒的传播。降低禽类养殖的成本，保证禽蛋食品的安全。参考文献[1]冯杰.嗜盐古生菌Natrinemasp.J7-2全基因组分析及其分泌蛋白质组初步研究[D].武汉大学,2012.[2]苏远科,王志宏,郭晓燕,吕斐,崔常勇.16SrRNA序列分析在沙门氏菌鉴定分型中的应用[J].食品安全质量检测学报,2017,8(11):4153-4160.[3]秦娜,杨金宝.禽沙门氏菌病的流行情况与防控措施[J].现代畜牧科技,2018(12):97.

[4]米琳华,伏国伟.雏鸡沙门氏菌病的防控技术[J].畜牧兽医科技信息,2018(06):128.

[5]Ye

F

,

Johnston

R

N

,

Gui-Rong

L

,

et

al.

Genomic

Comparison

between

Salmonella

Gallinarum

and

Pullorum:

Differential

Pseudogene

Formation

under

Common

Host

Restriction[J].

PLoS

ONE,

2013,

8(3):e59427-.[6]Baum

BR.

Combining

trees

as

a

way

of

combining

data

stes

for

phylogenetic

inference,

and

the

desirability

of

combining

gene

trees[J].

Taxon,

1992,

41(1):3-10

[7]Ragan

MA.

Matrix

representation

in

reconstructing

phlogenetic

relationships

among

the

eukaryotes[J].

Biosystems,

1992,

28

(1-3):

47-55

[8]Saitou

N

and

Nei

M.

The

neighbor-joining

method:

a

new

method

for

reconstructing

phylogenetic

trees[J].

Mol

Biol

Evol,

1987,

4

(4):

406-25

[9]Bryant

D

and

Moul