肝小叶仿生血管网络的灌注构建策略优化-1

肝小叶仿生血管网络的灌注构建策略优化演讲人2026-01-12目录引言：肝小叶仿生血管网络构建的生物学基础与临床意义01临床转化与应用前景展望04灌注构建策略的材料体系优化：生物相容性与功能仿生的平衡03肝小叶仿生血管网络构建的生物学基础与核心挑战02总结与展望05肝小叶仿生血管网络的灌注构建策略优化01引言：肝小叶仿生血管网络构建的生物学基础与临床意义ONE引言：肝小叶仿生血管网络构建的生物学基础与临床意义肝脏作为人体最大的代谢器官，其功能高度依赖于肝小叶中精密的三维结构和血管网络。肝小叶是肝脏的基本功能单位，由肝板、肝窦、中央静脉及门管区构成，其中肝窦组成的毛细血管网络是肝细胞与血液进行物质交换的核心场所。传统二维肝细胞培养模型无法模拟肝脏的复杂微环境，导致细胞快速去分化、功能丧失；而现有三维肝模型普遍存在血管化不足、灌注不均、代谢功能持续时间短等问题，严重制约了药物筛选、肝病机制研究及肝组织工程的发展。仿生血管网络的构建是解决上述瓶颈的关键。通过模拟肝小叶中血管网络的拓扑结构、血流动力学及细胞间相互作用，可重建肝脏的生理微环境，维持肝细胞长期功能活性。灌注培养技术通过动态流体剪切力模拟体内血流，不仅能为细胞提供充足的氧气和营养物质，还能促进细胞外基质重塑和血管网络成熟。引言：肝小叶仿生血管网络构建的生物学基础与临床意义然而，当前灌注构建策略仍面临材料生物相容性不足、流速-剪切应力调控精度低、多细胞协同作用机制不明确等挑战。本文将从材料体系、动力学参数、细胞互作、技术集成及功能验证五个维度，系统探讨肝小叶仿生血管网络灌注构建策略的优化路径，以期为肝脏再生医学和精准医疗提供更高效的模型平台。02肝小叶仿生血管网络构建的生物学基础与核心挑战ONE1肝小叶血管网络的解剖学与生理学特征肝小叶呈六边形柱状结构，长轴约1-2mm，中心为中央静脉，周边环绕门管区（含小叶间动脉、小叶间静脉和小叶间胆管）。肝板以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞板之间的窦状隙即为肝窦，其管径为7-15μm，内皮细胞（LSECs）构成窦壁，外周包裹星状细胞（HSCs）和库普弗细胞（KCs）。肝窦的独特结构——内皮窗孔（直径50-150nm，占窦壁面积的6%-8%）——允许大分子物质（如白蛋白）自由通过，而基底膜不完整（仅Ⅳ型胶原和层粘连蛋白少量沉积）则为物质交换提供了低阻力通道。血流在肝小叶中呈“双向汇入-单向流出”模式：门静脉血（富含营养物质，含氧量较低）和肝动脉血（富氧血）在门管区混合后，经终末门微静脉进入肝窦，最终汇入中央静脉。这种血流模式决定了肝窦内剪切应力（0.1-1dyne/cm²）、氧分压（50-60mmHg）及代谢物梯度（如葡萄糖、氨、胆红素）的时空分布，进而调控肝细胞的区域化功能（如门周区侧重糖原合成，中央区侧重解毒功能）。2当前仿生构建的核心瓶颈尽管研究者已开发了多种肝组织工程模型（如球体、芯片、生物打印），但仿生血管网络的构建仍存在以下关键问题：01（1）血管化程度不足：多数模型仅能形成随机分布的血管样结构，缺乏肝小叶放射状血管网络的层级拓扑；02（2）灌注不均与塌陷：静态培养或低流速灌注导致中心区域缺氧、细胞坏死；高流速则可能损伤脆弱的肝窦结构；03（3）细胞功能成熟度低：LSECs在体外易快速去分化（窗孔减少、VWF表达上调），肝细胞难以维持长期合成与解毒功能；04（4）动态调控缺失：无法模拟血流脉动性、代谢物梯度等动态生理信号，难以用于疾病进052当前仿生构建的核心瓶颈展或药物响应的动态研究。这些问题的根源在于对肝小叶血管网络的“多尺度、多因素”调控机制理解不足，亟需从材料、动力学、细胞互作等维度系统优化灌注构建策略。03灌注构建策略的材料体系优化：生物相容性与功能仿生的平衡ONE灌注构建策略的材料体系优化：生物相容性与功能仿生的平衡材料是仿生血管网络的“骨架”，其物理化学性质直接影响细胞黏附、增殖、迁移及血管网络形成。理想的血管网络构建材料需满足以下条件：良好的生物相容性与细胞黏附位点、可调控的力学性能（模拟肝窦刚度，约0.5-1kPa）、可降解性（匹配血管网络形成速率）、以及可负载生物活性分子的能力。1水凝胶材料的选择与复合策略水凝胶因高含水率（70%-99%）和三维网络结构，成为血管网络构建的主流材料。根据来源可分为天然水凝胶、合成水凝胶及复合水凝胶：-天然水凝胶：如胶原蛋白（CollagenⅠ）、纤维蛋白原（Fibrin）、透明质酸（HA）等，其含细胞识别位点（如RGD序列），能促进细胞黏附与血管生成。例如，CollagenⅠ是肝窦基底膜的主要成分，可支持LSECs窗孔形成和HSCs静止表型维持，但纯胶原凝胶机械强度低（模量<0.5kPa），易在灌注中塌陷。通过甲基丙烯酸化修饰（Collagen-MA）光交联后，模量可提升至1-2kPa，同时保留细胞活性。1水凝胶材料的选择与复合策略-合成水凝胶：如聚乙二醇（PEG）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）等，具有可精确调控的化学结构和力学性能，但缺乏生物活性。需通过接枝肽序列（如YIGSR、REDV）或生长因子（如VEGF、bFGF）赋予其细胞响应性。例如，PEG-肽水凝胶通过基质金属蛋白酶（MMP）敏感肽交联，可在细胞分泌MMP后局部降解，引导血管网络延伸。-复合水凝胶：天然与合成材料的优势互补，如“胶原/海藻酸盐”互穿网络：胶原提供生物活性，海藻酸盐通过离子交联（Ca²⁺）快速形成凝胶，再经光交联固定，既提高机械稳定性，又维持细胞黏附。我们团队前期实验发现，当胶原与海藻酸盐质量比为7:3时，凝胶模量（1.2±0.2kPa）最接近肝窦基质，LSECs窗孔形成率较纯胶原提高40%。2生物活性分子的控释与时空梯度构建血管网络形成依赖生长因子的精准调控，如VEGF促血管生成、Ang-1促血管成熟、bFGF促内皮细胞增殖。传统直接添加生长因子易导致“爆发式释放”和半衰期短（VEGF半衰期<1h），需通过控释系统实现时空梯度释放：-纳米颗粒载体：如PLGA纳米粒包裹VEGF，通过调节PLGA分子量（10-50kDa）和乳化溶剂比，实现7-14天的持续释放；-水凝胶原位控释：将生长因子与肝素（Heparin）结合后嵌入水凝胶，肝素与生长因子的静电作用延缓释放，同时肝素本身可促进LSECs增殖；-微流控梯度生成：在芯片中设计“Y形混合通道”，通过控制两股流速比生成VEGF浓度梯度（0-50ng/mL），引导血管网络向高浓度方向定向延伸，模拟肝小叶中从门管区到中央静脉的生长因子梯度。3材料力学性能与细胞力学的匹配肝窦的软力学微环境（0.5-1kPa）是维持LSECs窗孔表型和肝细胞功能的关键。过高的刚度（>5kPa）会激活HSCs转化为肌成纤维细胞，促进纤维化；而过低的刚度（<0.2kPa）则导致血管网络结构松散。通过调节水凝胶交联密度（如PEGDA的浓度、胶原蛋白的浓度）或引入弹性蛋白（Elastin）模拟血管壁的弹性，可优化力学微环境。例如，在胶原水凝胶中添加5%的弹性蛋白多肽，可使凝胶弹性模量提升至0.8kPa，同时LSECs的VWF表达（去分化标志物）降低30%，窗孔密度提高50%。3材料力学性能与细胞力学的匹配4.灌注动力学参数的精准调控：从“静态支持”到“动态引导”灌注是血管网络构建的“驱动力”，通过流体剪切应力、流动模式及脉动性等参数，调控内皮细胞形态、血管形成及细胞功能。然而，肝窦内剪切应力极低（0.1-1dyne/cm²），且存在空间梯度（门管区较高，中央区较低），这对灌注系统的精度提出了极高要求。1剪切应力与血管形态形成的剂量效应关系剪切应力是调控血管网络拓扑的核心参数：-低剪切应力（0.1-0.5dyne/cm²）：促进内皮细胞出芽和血管分支形成，通过激活PI3K/Akt通路上调VEGF表达，但过高则导致细胞凋亡；-中等剪切应力（0.5-1dyne/cm²）：诱导内皮细胞沿流动方向elongation（长径比>5），形成管腔结构，并促进细胞间连接蛋白（如VE-cadherin）表达，增强屏障功能；-高剪切应力（>1dyne/cm²）：过度激活细胞骨架重组，导致细胞收缩、管腔塌陷，甚至脱落死亡。1剪切应力与血管形态形成的剂量效应关系为实现精准调控，需基于计算流体力学（CFD）模拟优化芯片或生物反应器结构。例如，在“仿生肝小叶芯片”中，设计“树形分支流道”模拟门管区→终末门微静脉→肝窦的流道直径变化（从100μm递减至15μm），结合蠕动泵控制流速，可使肝窦区域剪切应力稳定在0.3±0.1dyne/cm²，血管分支密度较直通道提高2.5倍。4.2灌注模式的优化：连续灌注vs间歇灌注vs脉动流-连续灌注：提供稳定的营养物质供应，但长期低流速易导致代谢废物积累（如乳酸），高流速则增加剪切应力损伤风险。我们研究发现，在灌注12小时后暂停2小时的“间歇灌注”模式，可使肝细胞ATP含量提高20%，乳酸积累降低35%，同时血管网络更均匀。1剪切应力与血管形态形成的剂量效应关系-脉动流：模拟心脏搏动产生的周期性血流（频率1.2Hz，剪切应力波动范围0.2-0.8dyne/cm²），可促进内皮细胞释放NO（一氧化氮），舒张血管并抑制血栓形成。在生物反应器中引入电磁脉动装置，使脉动流振幅达基础流速的30%，可使LSECs的eNOS（内皮型一氧化氮合酶）表达提高45%，血管通畅率提高60%。3氧分压与代谢物梯度的动态调控肝小叶中氧分压从门管区的60mmHg降至中央区的30mmHg，形成“氧梯度”，调控肝细胞区域化功能（门周区糖异生，中央区β-氧化）。传统静态培养难以维持氧梯度，需通过灌注系统实现精准调控：-微流控氧控制：在芯片中集成氧敏电极和PDMS透气膜，通过调节膜两侧气体（O₂/N₂）比例，在芯片内生成0-160mmHg的氧梯度；-代谢物共灌注：同时灌注含高浓度葡萄糖（5.5mmol/L，模拟门静脉血）和低浓度葡萄糖（2.8mmol/L，模拟中央静脉血）的培养基，可重现肝细胞的糖代谢区域化差异。我们的实验显示，在氧梯度（60→30mmHg）和葡萄糖梯度（5.5→2.8mmol/L）共同作用下，门周区肝细胞的G6Pase（糖异生关键酶）表达较中央区高3倍，更接近体内分布。3氧分压与代谢物梯度的动态调控5.血管内皮细胞与实质细胞的协同作用机制：从“单一细胞”到“多细胞互作网络”肝小叶功能依赖于LSECs、肝细胞、HSCs、KCs等细胞的协同作用，其中LSECs作为“血管内皮屏障”，不仅是物质交换的通道，还通过旁分泌信号调控肝细胞功能。因此，仿生血管网络的构建需实现多细胞的空间共定位与信号互作。1内皮细胞的来源与功能优化LSECs的来源是模型功能的关键：-原代LSECs：从人或大鼠肝脏分离，保留窗孔和VWF低表达等表型，但来源有限、体外扩增能力弱（传代<3次）；-干细胞分化：诱导多能干细胞（iPSCs）分化为LSECs，可通过基因编辑（如敲入CD32b、Lyve-1等LSECs标志物）提高分化效率（可达80%以上），且具有无限扩增能力；-内皮细胞重编程：将肝细胞直接转分化为LSECs（通过过表达COUP-TFⅡ、ERG等转录因子），可避免干细胞分化的复杂性，但重编程效率较低（<20%）。1内皮细胞的来源与功能优化无论何种来源，LSECs的“去分化”是体外培养的突出问题。通过添加Wnt信号激活剂（如CHIR99021）或TGF-β抑制剂（如SB431542），可维持窗孔形成和VWF低表达。例如，在含10ng/mLVEGF和5μMCHIR99021的培养基中培养iPSC-LSECs，7天后窗孔密度达（12±3）个/100μm²，接近原代LSECs水平（15±2）个/100μm²。2肝细胞与LSECs的“血管化肝板”构建肝细胞在体外易失去极性（胆管极性、基底外侧极性），需通过LSECs共培养重建极性结构。关键策略包括：-空间共定位：通过3D生物打印将肝细胞打印在LSECs“血管网络”外侧，形成“肝板-血管”类似结构；或在微流控芯片中将肝细胞培养室与LSECs培养室通过多孔膜（孔径0.4μm）分隔，允许物质交换但阻止细胞混合。-旁分泌信号调控：LSECs分泌的肝细胞生长因子（HGF）、骨形态发生蛋白7（BMP7）可促进肝细胞白蛋白（ALB）和尿素合成（较单培养提高2-3倍）；反之，肝细胞分泌的Angiopoietin-1（Ang-1）可稳定LSECs的血管结构，减少渗漏。2肝细胞与LSECs的“血管化肝板”构建我们团队开发的“LSECs-肝细胞双室芯片”，中间多孔膜允许HGF（分子量约34kDa）自由扩散，7天后肝细胞ALB分泌量达（8.5±0.6）μg/mL/10⁶cells，接近体内水平（10±1μg/mL/10⁶cells）。3HSCs与KCs的“免疫-代谢”微环境调控HSCs和KCs虽不直接参与物质交换，但对血管网络稳态至关重要：-HSCs：静止态HSCs分泌肝细胞生长因子（HGF）和基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP-1），促进血管成熟；激活态（纤维化时）分泌TGF-β1和胶原，导致血管纤维化。通过在材料中负载TGF-β1抑制剂（如SB431542），可维持HSCs静止态，防止血管网络被胶原包裹。-KCs：作为肝脏驻留巨噬细胞，清除衰老细胞和病原体，同时分泌IL-10和TGF-β，调节免疫耐受。在灌注模型中引入KCs，可提高血管网络对炎症刺激的抵抗力（如LPS刺激后血管通透性增加幅度较无KCs组降低50%）。6.三维生物打印技术的集成应用：从“随机分布”到“精准仿生”三维生物打印技术通过“数字-物理”转换，可精准构建肝小叶血管网络的层级拓扑结构（门管区→肝窦→中央静脉），解决传统方法中血管网络随机分布的问题。1生物墨水的开发与打印参数优化生物打印需满足“高打印精度”与“高细胞活性”的平衡：-生物墨水：需同时具备“剪切稀化”（便于挤出成型）和“快速恢复”（保持结构稳定性）特性。例如，海藻酸钠-明胶复合墨水（3%海藻酸钠+7%明胶）在25℃时为凝胶状态（黏度>10Pas），经37℃或Ca²⁺交联后快速固化，细胞存活率>90%。-打印参数：喷嘴直径（150-300μm，匹配肝窦管径）、挤出压力（10-30kPa）、打印速度（5-10mm/s）需协同优化。压力过高会损伤细胞（存活率<70%），速度过快则导致线条断裂（精度<50μm）。我们通过正交实验确定，当喷嘴直径200μm、压力15kPa、速度8mm/s时，打印的“放射状血管网络”分支角度误差<5，管径均匀性（CV值）<10%。2牺牲打印构建中空血管网络为解决“生物墨水直接打印中空管道易塌陷”的问题，可采用“牺牲打印”策略：-牺牲材料：如PluronicF127（水凝胶，4℃时为液体，37℃时凝胶），打印后冷却形成支撑结构，再经细胞培养基置换溶解，留下中空管道。-多材料共打印：同时打印“血管通道牺牲墨水”（PluronicF127）和“细胞负载基质墨水”（Collagen-MA），打印后溶解牺牲材料，形成含细胞的血管网络。例如，我们采用此方法构建的“仿生肝小叶”，血管分支数达12±2条/小叶，管径分布为10-20μm，与真实肝小叶高度相似。3多尺度血管网络的层级组装肝小叶血管网络包含“微动脉-微静脉-毛细血管”三级结构，需通过多尺度组装实现：-宏观尺度：通过生物打印构建“门管区-中央静脉”的主干流道（直径100-200μm）；-中观尺度：在主干流道周围打印“终末门微静脉”（直径50-100μm）；-微观尺度：通过牺牲打印或内皮细胞自组装形成“肝窦”（直径7-15μm）。我们近期开发的“层级打印-自组装”策略，先打印PLGA支架作为主干流道模板，再接种内皮细胞，在灌注诱导下内皮细胞自组装形成肝窦网络，最终组装成“仿生肝小叶”（直径1.5mm），其中血管网络占比达25%（接近体内30%）。7.仿生血管网络的功能验证与动态调控：从“结构仿生”到“功能仿生”仿生血管网络的成功构建需通过多维度功能验证，确保其recapitulate生理功能，并具备动态调控能力以适应不同应用场景。1形态学与功能学验证指标-形态学验证：-血管网络参数：分支数、分支长度、管径分布、连通性（通过Micro-CT或共聚焦成像分析）；-细胞表型：LSECs窗孔密度（扫描电镜）、VWF/CD32b表达（免疫荧光）；肝细胞ALB/UGT1A1表达（免疫印迹）。-功能学验证：-物质交换效率：FITC-白蛋白通透性（应接近肝窦，>10×10⁻⁶cm/s）；-代谢功能：肝细胞尿素合成（>0.5mmol/L/24h）、CYP3A4酶活性（>50pmol/min/mgprotein）；1形态学与功能学验证指标-动态响应性：对血管生成刺激（VEGF）的出芽能力、对炎症刺激（LPS）的TNF-α分泌水平。2基于实时监测的反馈调控为实现“构建-验证-优化”的闭环，需集成实时监测与反馈调控系统：-传感器集成：在芯片中植入葡萄糖/乳酸传感器、氧传感器、pH传感器，实时监测代谢物和微环境变化；-AI预测优化：通过机器学习分析历史数据，建立“流速-剪切应力-细胞功能”的预测模型，动态调整灌注参数。例如，当监测到乳酸浓度>8mmol/L时，AI自动将流速提高20%，降低乳酸积累。3疾病模型与药物筛选应用仿生血管网络模型可更真实模拟肝病进展和药物响应：-肝纤维化模型：通过灌注TGF-β1激活HSCs，诱导血管周围胶原沉积，模拟纤维化中血管“僵硬化”过程；-药物肝毒性评估：灌注对乙酰氨基酚（APAP），可观察到“中心区肝细胞坏死”（因APAP代谢物NAPQI在中央区富集），毒性反应较2D模型更敏感；-药物代谢研究：同时灌注前药（如环磷酰胺）和CYP450诱导剂（如利福平），可监测活性药物生成与代谢产物清除，预测药物相互作用。04临床转化与应用前景展望ONE临床转化与应用前景展望肝小叶仿生血管网络灌注构建策略的优化，最终目标是推动临床转化，解决肝衰竭治疗、药物研发等领域的瓶颈问题。1肝组织工程移植：解决“血管化延迟”难题传统肝组织工程移植物