耐高温金藻规模化扩繁应用操作规程征求意见稿

青岛微藻产业学会

团体标准

T/QMISXXX-2022

耐高温金藻规模化扩繁操作规程

（Operatingproceduresforscale-up

cultivationtechnologyoftheheat‑tolerance

Isochrysissp.）

(征求意见稿)

2022-××-××发布2022-××-××实施

青岛微藻产业协会发布I

耐高温金藻规模化扩繁操作规程

1范围

本操作规程规定了耐高温金藻规模化扩繁操作规程的范围、术语和定义，耐高温金藻种质来源、高

温适应性、培养条件、设施和工具、培养、收获等内容。

本操作规程适用于渔业苗种生产和养殖中的耐高温金藻培养。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB11893总磷的测定钼酸铵分光光度法

GB11913溶解氧的测定电化学探头法

GB6920pH值的测定玻璃电极法

GB11607渔业水质标准

GB3907海水水质标准

3术语和定义

3.1耐高温金藻定义

本规程中耐高温金藻是指耐高温湛江等鞭金藻（Isochrysiszhangjiangensis），藻种保藏号CCTCCNO:

M2019629，保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉大学）。本规程中耐高温是指湛江等鞭金藻在室外

培养环境中可耐受不高于35℃的温度条件。下列术语和定义适用于本操作规程。

3.2指数生长期

藻细胞迅速生长繁殖。在生长条件合适的环境中，细胞个体尺寸不断扩大，所含的干物质量增加，

达到一定的限度，细胞即分裂产生子细胞。子细胞以几何级数增加，生长与分裂。

3.3一级藻种培养

一级保种培养是以3～5L广口瓶或三角烧瓶作培养容器，用消毒纱布和纸张封口的一种培养方

式，其目的主要是为后续二级、三级培养做好藻种的准备，一般每天需要摇晃震荡培养容器。

3.4二级扩种培养

光生物反应器在二级扩种培养培养过程发挥着至关重要的作用：其中柱式光生物反应器主要由种子

罐、气体发生装置、控制装置与光源等组成，具有传质效率快、微藻培养密度高等优点；平板光生物反

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应器主要由种子罐、气体发生装置、控制装置等组成，具有光照表面积大、光照利用率高、微藻培养密

度高等优势。特殊情况下，可采用容积为50L～100L塑料桶等封闭式培养，培养期间连续充入空气。

3.5三级规模化培养

本规程中耐高温金藻三级培养初始接种密度约为103cells/μL，控制温度约为25-35℃，培养池pH为

7.5-8.5，主要采用面积为20m2～40m2的培养池或光孵化器。由于有充足的光照和空气流通（通气量

~0.1vvm，通气时间每天约为12h），藻类的繁殖比较快。

3.6土池培养

主要是在指三级培养在养殖塘施肥、接种耐高温金藻的过程。

3.7批式培养

指在一定的容器中进行，根据藻类的营养需要加入特定的培养液并接种，当藻类细胞生长繁殖达到

较高的密度后，一次全部收获或做进一步扩大培养，是耐高温金藻类常用的培养方法。

3.8半连续培养

指当培养的藻细胞达到一定密度时，根据藻类的生长状态和对藻类的需求量收获一部分密度高藻

液，并补充等量的新培养液继续培养。

3.9连续培养

指在培养容器内不断取出达到一定密度的藻细胞培养液的同时，加入等量新的培养液。培养液的交

换量根据藻细胞的生长密度人为控制。一般适用于室内封闭式进行，采用人工光源日光源、自动控制、

充气培养。

4培养条件、设施和工具

4.1培养用水质条件

培养水质应符合GB11607、GB3907标准。

4.2培养设施

主要有保种室、培养室等设施，并配有显微镜、生物培养箱、空调等设备。

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4.3培养容器

保种和小型培养的容器主要有0.1～5L的三角烧瓶，二级培养主要采用10～20L玻璃广口瓶或塑

料桶、50～100L的塑料桶等；三级大面积培养主要采用水泥池、光生物反应器、土池等。

5耐高温金藻扩繁简易流程

藻种保存培养→培养液制备→一级培养→二级培养→三级培养

6藻种保存

6.1耐高温金藻各级培养消毒

培养过程的容器、工具都必须经过消毒。藻种保存及各级培养消毒方法如下：

藻种保存、一级培养二级培养三级培养

保存和培养高浓度微将保种室中培养的藻高温消毒：将经120目化学药剂消毒：将经将池子冲洗干净，加

藻藻种的房间，一般种扩种到3～5L的玻棉袋过滤培养水烧开120目棉袋过滤培养经过滤的水到水位

采用0.1～1L的三角璃瓶，用水需经过脱脂注入桶内密封，冷却水注入桶内，煮沸或80～120m，充气泼洒

烧瓶培养，用水需经棉过滤煮沸，煮沸后维后加培养液，接种培加漂白片有效氯20～经80目过滤的漂白粉

过脱脂棉过滤煮沸，持5分钟～10分钟，封养。充气管、气石煮50mg/L，充气-停气-50～100mg/L，用漂

煮沸后维持5分钟～闭冷却后使用。培养母沸消毒，煮沸5～10分密封，12～24小时后白水将池壁和过道淋

10分钟，封闭冷却后液放入高压灭菌锅中，钟。充气加硫代硫酸钠中洗，充气30～60分钟

使用。将洗净的三角加温到121℃，维持20和，加培养液，接种后停气，12～24小时

烧瓶、培养母液放入分钟。玻璃容器瓶口上培养。充气管、气石后泼洒硫代硫酸钠，

高压灭菌锅中，加温放一普通的玻璃漏斗，煮沸消毒或漂白精消充气1小时左右施肥

到121℃，维持20分加水煮沸5分钟～10分毒，培养母液煮沸，接种。

钟，灭菌后放入烘箱，钟，消毒完毕即用消毒煮沸5～10分钟。

加热至120℃后，恒温的纸或消毒的纱布包

2小时进行干燥消毒。扎瓶口。

6.2接种

6.2.1藻种质量

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藻种无污染，主要借助水色、触摸、味道、镜检等有无异常判断。指数生长期，耐高温金藻藻液应

均匀，细胞无附壁。

6.2.2接种浓度

接种时间在早上8:00～10:00。接种的藻类在指数生长期，一级培养接种浓度为1:5～1:10，当一级

种子细胞浓度达到5000cells/μL时可接入二级扩种培养；二级培养接种浓度1:10～1:50，而当二级种子

细胞浓度约为2000-3000cells/μL时可接入三级扩种培养；三级培养根据天气、扩繁规模来接种，接种

浓度1:15～1:30。

6.3培养液配置

选择合适容积的容器，按照6.1描述的方法进行灭菌、干燥及消毒。准确称量硝酸钾、磷酸氢二钾、

柠檬酸铁、尿素，使用消毒海水定容，将液体放入高压灭菌锅中，加温到121℃，维持20分钟。灭菌冷

却后加入维生素B1及维生素B12。

附表1耐高温金藻规模化扩繁培养液配方

培养液名称培养液配方

成份一级培养用量二级培养用量三级培养用量

硝酸钾（KNO3）60.00g50.00g20.00g

磷酸二氢钾（KH2PO4）5.00g5.00g3.00g

柠檬酸铁（FeC6H5O7）0.5g0.5g0.30g

耐高温金藻

培养液尿素（NH2CONH2）/10.00g10.00g

维生素B10.10mg0.05mg/

维生素B120.01mg0.005mg/

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消毒海水1m31m31m3

7日常管理

7.1观察与处理

定期进行显微镜检查，从藻细胞的形态、悬浮、污染情况等了解细胞生长是否正常。注意观察藻液

颜色，有无附壁、沉淀、菌膜和敌害生物现象，如发现异常，立即去除，及时接种培养。

7.1.1一级培养

保种室保持干净，注意天气变化，调控温度室内温度保持在27～35℃，盐度30g/L，光照用日光

灯调节在100μmolm-2s-1左右，每天摇晃4～6次。如附图1所示。

7.1.2二级培养

二级培养室保持良好采光通风，光照采用自然光照结合人工光源，光照强度调节在100μmolm-2s-1

左右。柱式反应器使用时加入占总体积2/3的培养基加藻液，随后盖上塞子与插入玻璃通气管，打开气

体发生装置通入所需气体，调整通气量。调整室内空气与反应器光照强度。将平板光反应器与地面垂直

放置，将其平行置于两排灯管之中，调整气体流量计与温度。如附图1所示。

7.1.3三级培养

三级培养区注意池子的消毒、过道的消毒，尤其在夏季高温要注意通风和光照，及时开窗、用遮光

帘或遮阳布等设施，调节温度避免高于35℃。检查充气量、藻种培养状况，发现污染及时处理。施肥

是将营养盐用淡水或中和的消毒水融化，全池泼洒。如附图1所示。

7.2营养盐补充

镜检三级培养藻细胞状态、pH值、水温及藻细胞浓度变化，根据藻细胞镜检状态及培养液中检测到

的营养盐浓度等情况及时补充营养盐。

8投喂

8.1鲜活藻体投喂

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在接种3～5天后，根据耐高温金藻生长情况，及时进行补充培养液或进行投喂。耐高温金藻经各

培养阶段，最终达到苗种及养殖生产单位所要求的藻种浓度和质量。投喂的指数生长期藻种为宜，投喂

耐高温金藻的藻种浓度约在~103cells/μL左右。

8.2冷冻藻体投喂

8.2.1冷冻保存

培养出来的耐高温金藻如果暂时不能投喂时，利用离心、浓缩设备收集藻类，-18℃以下冷冻保存，

以备随时投喂使用。

8.2.2冷冻后投喂

附图1耐高温金藻各级培养示意图

藻种保存与一级培养二级培养图三级培养图

藻株保存一级培养二级培养三级培养

9记录

9.1藻种记录

包括藻细胞数、色泽、培养基及培养条件。

9.2养殖过程记录

包括一级、二级、三级培养中藻细胞数、色泽、气味、污染杂菌及培养条件。

9.3记录一般保存两年

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前言

金藻作为高值化开发利用的重要藻类，也是饵料微藻的典型代表。温度是影响水产养殖生物生长的

重要环境因子，微藻的耐高温特性对水产养殖有着重要科学意义，为指导耐高温金藻的水产应用及规范

性扩繁操作，提高社会效益，制定本标准。

本标准按GB/T1.1《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由宁波大学提出，青岛微藻产业学会归口管理。

本标准起草单位：宁波大学，福建省大来种苗科技有限公司

本标准主要起草人：徐继林、曹嘉懿、周成旭、程鹏飞、周海波

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耐高温金藻规模化扩繁操作规程

1范围

本操作规程规定了耐高温金藻规模化扩繁操作规程的范围、术语和定义，耐高温金藻种质来源、高

温适应性、培养条件、设施和工具、培养、收获等内容。

本操作规程适用于渔业苗种生产和养殖中的耐高温金藻培养。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB11893总磷的测定钼酸铵分光光度法

GB11913溶解氧的测定电化学探头法

GB6920pH值的测定玻璃电极法

GB11607渔业水质标准

GB3907海水水质标准

3术语和定义

3.1耐高温金藻定义

本规程中耐高温金藻是指耐高温湛江等鞭金藻（Isochrysiszhangjiangensis），藻种保藏号CCTCCNO:

M2019629，保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉大学）。本规程中耐高温是指湛江等鞭金藻在室外

培养环境中可耐受不高于35℃的温度条件。下列术语和定义适用于本操作规程。

3.2指数生长期

藻细胞迅速生长繁殖。在生长条件合适的环境中，细胞个体尺寸不断扩大，所含的干物质量增加，

达到一定的限度，细胞即分裂产生子细胞。子细胞以几何级数增加，生长与分裂。

3.3一级藻种培养

一级保种培养是以3～5L广口瓶或三角烧瓶作培养容器，用消毒纱布和纸张封口的一种培养方

式，其目的主要是为后续二级、三级培养做好藻种的准备，一般每天需要摇晃震荡培养容器。

3.4二级扩种培养

光生物反应器在二级扩种培养培养过程发挥着至关重要的作用：其中柱式光生物反应器主要由种子

罐、气体发生装置、控制装置与光源等组成，具有传质效率快、微藻培养密度高等优点；平板光生物反

T/QMISxxx-2022

应器主要由种子罐、气体发生装置、控制装置等组成，具有光照表面积大、光照利用率高、微藻培养密

度高等优势。特殊情况下，可采用容积为50L～100L塑料桶等封闭式培养，培养期间连续充入空气。

3.5三级规模化培养

本规程中耐高温金藻三级培养初始接种密度约为103cells/μL，控制温度约为25-35℃，培养池pH为

7.5-8.5，主要采用面积为20m2～40m2的培养池或光孵化器。由于有充足的光照和空气流通（通气量

~0.1vvm，通气时间每天约为12h），藻类的繁殖比较快。

3.6土池培养

主要是在指三级培养在养殖塘施肥、接种耐高温金藻的过程。

3.7批式培养

指在一定的容器中进行，根据藻类的营养需要加入特定的培养液并接种，当藻类细胞生长繁殖达到

较高的密度后，一次全部收获或做进一步扩大培养，是耐高温金藻类常用的培养方法。

3.8半连续培养

指当培养的藻细胞达到一定密度时，根据藻类的生长状态和对藻类的需求量收获一部分密度高藻

液，并补充等量的新培养液继续培养。

3.9连续培养

指在培养容器内不断取出达到一定密度的藻细胞培养液的同时，加入等量新的培养液。培养液的交

换量根据藻细胞的生长密度人为控制。一般适用于室内封闭式进行，采用人工光源日光源、自动控制、

充气培养。

4培养条件、设施和工具

4.1培养用水质条件

培养水质应符合GB11607、GB3907标准。

4.2培养设施

主要有保种室、培养室等设施，并配有显微镜、生物培养箱、空调等设备。

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4.3培养容器

保种和小型培养的容器主要有0.1～5L的三角烧瓶，二级培养主要采用10～20L玻璃广口瓶或塑

料桶、50～100L的塑料桶等；三级大面积培养主要采用水泥池、光生物反应器、土池等。

5耐高温金藻扩繁简易流程

藻种保存培养→培养液制备→一级培养→二级培养→三级培养

6藻种保存

6.1耐高温金藻各级培养消毒

培养过程的容器、工具都必须经过消毒。藻种保存及各级培养消毒方法如下：

藻种保存、一级培养二级培养三级培养

保存和培养高浓度微将保种室中培养的藻高温消毒：将经120目化学药剂消毒：将经将池子冲洗干净，加

藻藻种的房间，一般种扩种到3～5L的玻棉袋过滤培养水烧开120目棉袋过滤培养经过滤的水到水位

采用0.1～1L的三角璃瓶，用水需经过脱脂注入桶内密封，冷却水注入桶内，煮沸或80～120m，充气泼洒