【《人体皮肤拉曼光谱分析》8600字】

PAGEPAGE20人体皮肤拉曼光谱分析目录TOC\o"1-3"\h\u25522人体皮肤拉曼光谱分析 1270281.1人体皮肤中生物组分拉曼光谱数据整理检索 1268701.2相关各生物分子拉曼光谱数据分析方法 191.1人体皮肤中生物组分拉曼光谱数据整理检索1.1.1概述拉曼光谱技术作为一种无入侵性、不需预处理的物质检测鉴别技术，很适合进行在自然状态下对人体皮肤的成分检查。作为人体重要的器官和防御屏障，已经有不少科学家对人体皮肤展开各式各样的研究，拉曼光谱技术的出现让这些研究从离体研究逐渐过渡至活体研究，既方便了取样、检测等步骤的过程，又能尽可能保真地还原皮肤的生理状态。西北大学的尹亚宁在导师指导下，对正常皮肤的不同层次进行拉曼光谱采集[10]，并通过对比特征峰位置与强度的差异可以很清晰地得到各层次中富含何种物质的信息。为了便于对比，在下页图10（b）中用红虚线标注出胶原蛋白的特征谱峰（818、855、940、1248cm-1），绿虚线标注苯丙氨酸的特征谱峰（1005、1035、1209cm-1），蓝虚线为脂质（1064、1106、1126、1300cm-1），黑虚线表示黑色素（1375、1580cm-1）。在图10（b）中，曲线、、分别为角质层、表皮与真皮层的拉曼光谱曲线。研究红色虚线与三条谱线的交点我们注意到，818、855、940、1248cm-1四处在真皮层中的强度都高于表皮整体与角质层。红虚线的特征谱峰对应的物质是胶原蛋白，与真皮层中含有大量的胶原蛋白（90%）的事实吻合。研究绿色虚线与三条谱线的交点，可以发现角质层谱线在这几处的特征峰强高于真皮层，且真皮层谱线在1608cm-1处无明显峰强，这是因为绿色虚线对应的物质苯丙氨酸是合成黑色素的酪氨酸的前体，而皮肤中的黑色素主要存在于表皮的基底层中，在真皮层中较少，苯丙氨酸仅作为合成蛋白质必需的一种氨基酸存在。对蓝色虚线处的谱线强度进行对比则可以发现，角质层中脂质的含量远高于真皮层，尤其是1300cm-1处仅在角质层谱线中可以看到特征峰，这是源于神经酰胺的贡献。前文提到，苯丙氨酸与黑色素的合成有关，我们可以看到黑色虚线处三个不同皮肤层次的拉曼谱线也与绿色虚线（苯丙氨酸）的近似，与黑色素主要存在于表皮（准确地说是基底层）中的事实相符。除上述提到的红虚线处与胶原蛋白特征峰重合的谱线峰值外，我们还可以在真皮层拉曼谱的1453和1670cm-1处看到有别于其他两个被测量皮肤层次的明显强信号。1453cm-1处的信号来自于δ(CH2)剪断形成δ(CH2)和δ(CH3)的过程，1670cm-1处的信号则来自物质酰胺I。图10[10]图11[11]图11[11]A：手指背侧B：前臂掌侧C：A和B的差异光谱D：纯化合物的多元回归拟合E：残差：C和D的差异光谱。他们还对人体真皮层汗管内外进行了拉曼检测，如图12，其中a为汗管内的拉曼光谱谱线，b为汗管外测得谱线，c为ab间的差谱，d为光谱a、b及NMF与汗液成分谱线拟合所得，e和f分别为汗液的主要成分乳酸与尿素的拉曼谱线。在a谱线图12（图中*为乳酸特征谱峰位置）[11]我们可以很明显看到与乳酸谱线相符的位于856cm-1处的特征峰，在b谱线中则看不到这样的特征峰；而尿素的特征峰波数处，a谱线的峰强明显高于b谱线。由此可见，在真皮层中汗液只存于汗管中，汗管外汗液的浓度理论上为0。中科院长春精机所的YaoliangJiang采用共振拉曼光谱法对人体皮肤内的类胡萝卜素进行测定[12]。类胡萝卜素是人体抗氧化作用的重要一环，同时还能对癌症进行预防与治疗，其含量浓度可以一定程度反应人体的健康状况。实验选取人体拇指处的皮肤，对拇指上可能影响测量结果的杂质先用酒精去除，再涂抹甘油增强拉曼散射光的收集。需要注意的是，此处涂抹的甘油吸收峰值（412nm）与激发光波长（450nm）相错开，因此不会影响最终得到的拉曼光谱结果。由下图的对比可以看到涂抹甘油后，拉曼谱峰的强度得到了很好的增强。图图13涂抹甘油的去噪人体皮肤拉曼光谱[12]图14未涂抹甘油的去噪人体皮肤拉曼光谱[12]图15拉曼光谱与近红外谱线对比图15拉曼光谱与近红外谱线对比[13]图16不同皮肤层次拉曼谱线对比[13]他们还对比了冷冻切片中角质层、表皮与真皮层的拉曼光谱（图16）。2波段在角质层的拉曼谱线中出现在1444cm-1的位置，在另外两个皮肤层次的谱线中则出现在1451cm-1处，反映出角质层中含有较多脂质的特性，与其谱线中1296cm-1处的强谱带互相应证这一特性。真皮层谱线中，854cm-1和936cm-1的强谱带反映出其极高的胶原蛋白含量。这一结果与前文尹亚宁的研究一致。Livia和他的团队则设计了另一项有趣的实验，他们打算通过固有老化程度和光老化程度不同的人体皮肤拉曼光谱来测算这两种老化程度的深浅[14]。数十名不同年龄层的志愿者被分为多组，获取暴露性皮肤（前臂背侧处）与非暴露性皮肤（近端内侧臂处）的拉曼光谱。按照选取皮肤的部位与光老化程度的不同，受试者们被分为共六个组，其中暴露性皮肤区分为三组：1P组为5个轻度光老化样本，2P组为4个中度光老化样本，3P组为6个高度光老化样本；非暴露性皮肤也以此区分为三组，分别记作1N、2N、3N组。分析下图我们可以得知，在未曝光区域也就是1N和3N组的谱线上，在938cm-1处的峰的强度值高于曝光处谱线（1P和3P组）。与1P组（轻度光老化）相比，3P组（重度光老化）中该峰值强度也更高。重度光老化组的其他峰值也高于其他组的相似谱峰。结合数学分析我们可以得到如下结论：固有老化中，真皮层合成胶原蛋白的能力下降，抗氧化剂的浓度降低而活性氧的浓度升高；光老化中，紫外线将诱导分解代谢酶产生，真皮层中的胶原蛋白逐渐被弹性蛋白所取代，达到一定程度时，就是所谓“太阳弹性病”。图17[14]Annieke和弗里克·霍尔等人将拉曼光谱技术引入了对基底层癌细胞与周围正常细胞的区分作业[15]。基底细胞癌是一种常见的皮肤癌症，因医生难以在很好地判断出其在体内的范围边界，常导致恶性肿瘤的切除不够彻底从而复发的情况。又由于癌细图18[15]胞的扩散速度很快，一项能实时检测其蔓延至何处的技术亟待开发。结合光纤探针，拉曼光谱助力于肿瘤外科手术的可能性浮出水面。为了能更直观地看到癌症区域与正常区域的边界，科学家们构建了拉曼伪彩色图像与分类模型。如图18为拉曼伪彩色图像，其中黑色区域为癌变区域，白色区域为健康区域，与切片显微图像的①与②区域分别对应。拉曼伪彩色图像由图18c-1（基底细胞癌群集平均拉曼谱线）与图18c-2（健康真皮层群集平均拉曼谱线）得到。可以看到，由群集平均光谱得到的拉曼伪彩色图像几乎与切片得到的实际癌细胞与健康细胞分布无异，能较为准确地反映出体内癌细胞扩散的真实情况与程度。P.J.Caspers从几名志愿者手掌或手臂处获取皮肤样本，运用共聚焦拉曼光谱与共聚焦显微镜研究人体皮肤的含水浓度[16]，将720nm的激光用作激发光，在2000～4000cm-1的区间每频谱1s记录拉曼光谱，水的质量浓度由水（3350～3550cm-1）和蛋白质（2910～2965cm-1）拉曼谱带间的强度之比衡量（如图19）。他们得到的结论是，水浓度在手掌的角质层中基本不变，且活表皮中水的质量分数达到70%（每100克湿组织中含有70克水）。图19图19[16]DownesA及其团队[17]将这些生物组分成分及其对应的峰值在如图18所示的乳腺癌细胞拉曼光谱中一一整理对应出来（其中包括DNA和RNA等上表中略去的成分）。图20[17]1.1.2人体皮肤中主要生物组分（纯物质）的拉曼光谱数据整理与检索甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、酰胺I、酰胺III、苯丙氨酸（合成胶原蛋白的主要成分）胶原蛋白是在真皮层中大量存在的蛋白质，其主要成分为甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸。目前对胶原蛋白的拉曼光谱研究主要集中在酰胺I、II、III带和脯氨酸和羟脯氨酸的特征吸收谱带上。在拉曼光谱中，酰胺I和酰胺III带的频率通常可以检测二级结构的差异。该区域与脂质、脯氨酸和羟脯氨酸区域是经常参与胶原蛋白结构构象变化的三个主要区域[28]。Kreplak等人的研究结果表明，1655cm-1处的酰胺I带表明存在一个α-螺旋结构，1630cm-1处的肩部与1675cm-1处的峰值则与β-片状结构有关[26]。尽管胶原蛋白分子的组成顺序已被大致确定，但芳香族侧链的存在及普遍性仍有待确定。为此，科学家们将金和银纳米粒子附着在胶原蛋白纤维上来增强样品的拉曼信号。研究结果显示，拉曼光谱对纤维表面的芳香族侧链的暴露相当敏感。胶原蛋白螺旋结构中的残基在1000cm-1处反映为苯丙氨酸，1605cm-1处反映为苯丙氨酸和酪氨酸。此外，酰胺I和III分别反映在1655cm-1和1268cm-1处。CH3和CH2的变形反映在2933和1447cm-1，而NH的拉伸振动出现在3320cm-1。酰胺I峰在1630cm-1处也反映了一个肩部，是三螺旋二级结构的特征[27]。图21[28]田康振等人利用表面增强拉曼光谱技术得到酰胺III的谱带为1227cm-1（β-片状结构）和1278cm-1（α-螺旋结构）[29]。MATSUI等人在其用于计算对应于身体组织中存在的物质的拉曼光谱中C-H波段和酰胺I波段的光谱强度比，并自动确定物质中的β-淀粉的光谱数据分析器专利中提到，酰胺I的特征谱峰位于1463和1655cm-1处。JokeDeGelder等人在其编纂的《生物拉曼光谱参考数据库》一文中给出了甘氨酸（图22（a））、苯丙氨酸（图23（a））和脯氨酸（图23（e））的拉曼光谱[18]。黑色素黑色素是一种主要存在于基底层、可由紫外线激发生成的色素类物质。黑色素主要由黑色素细胞生成，可以算作一种氨基酸衍生物，相关氨基酸为酪氨酸，其拉曼光谱如图23（b）。除了含有紫外线的日照之外，内分泌失调也可能影响黑色素的生成。ZhiweiHuang等人将乌贼体内的黑色素与合成黑色素（纯物质）的拉曼光谱进行比较[8]，由图24右侧的拉曼谱线可以看到黑色素的特征峰位置在1380和1590cm-1处。图22[18]图23[18]图24[8]类胡萝卜素类胡萝卜素是存在于人体皮肤中的另一种色素，类胡萝卜素是人体抗氧化作用的重要一环，同时还能对癌症进行预防与治疗。我们收集到了吴咏玲在其分子极性对类胡萝卜素共振拉曼光谱影响的研究中给出的拉曼谱线[30]，其中可以看到1005、1155和1520cm-1三个明显的基频区特征谱峰（图25）。JokeDeGelder在其数据库中也给出了类胡萝卜素的拉曼谱线（图26（d））。图25[30]图26[18]（四）角鲨烯、棕榈酸与胆固醇（皮脂主要成分）JokeDeGelder在其数据库中给出了棕榈酸的拉曼谱线[18]（图27（c））。特征峰值位置为1070、1134、1443（图给基频区内）、2894cm-1处[32]。图27[18]DavidW.Hall和他的团队运用拉曼光谱法快速测定鲨鱼肝油中的角鲨烯[31]，测得基频区特征峰在1330、1383、1440cm-1的拉曼谱线。此外，角鲨烯还有位于1670和2961cm-1处强度更高的特征谱峰。图28[31]兰州大学的邱文元对纯胆固醇晶体进行激光拉曼光谱测定，得到分别位于100-3500cm-1的拉曼谱线（图29）。本文中选取特征谱峰明显的900-1700cm-1段作为参考数据收录[33]。可以看到在1440cm-1处有强度较大的特征谱峰出现。图29[33]乳酸、尿素（汗液的主要成分）乳酸与尿素是汗液的主要成分。ValentinaM等人在文章《乳酸基深层天然共晶溶剂提取葎草的生物活性代谢物：超分子组织、植物化学分析和生物活性》中，给出了乳酸的拉曼光谱（图30中蓝色线），并与乳酸的近红外光谱进行了对比[34]。他们认为，在基频区部分，乳酸的拉曼谱线与红外光谱具有相同的特征峰，在大约1720cm-1的尖锐峰值，归因于羧酸基团的羰基拉伸，以及存在于1300到1000cm-1区域的峰值，与C-O-C拉伸振动有关，突出了这两种振动光谱的互补性。此外，在拉曼光谱中，1450cm-1的峰值被指定为-CH3基团的不对称弯曲（δas），825cm-1的强线被指定为-COOH基团的C-C拉伸振动（ν）。图30[34]王琴及其团队提出了一种基于激光拉曼光谱技术同步测量尿素水溶液液膜厚度和浓度的方法[35]，在图31中可以看到，尿素水溶液在1004cm-1处有一个属于C-N-C对称拉伸模式的特征谱峰。（该图为尿素水溶液浓度固定为5%时膜厚度的变化对拉曼谱线的影响）图31[35]水隗群梅在其对不同水质的研究中[36]，给出了蒸馏水的拉曼谱线，并标注出其三个特征谱峰，其中位于1595cm-1处的谱峰源自键角∠ＨＯＨ的改变引起的振动称为弯曲振动或变性振动，位于3652和3756cm-1处的谱峰分别源于O-H键长度改变的对称伸缩振动与反对称伸缩振动（如下页图32（e）所示）。图32[36]DNA与RNA物质皮肤中也存在DNA与RNA物质，包括嘌呤和嘧啶等物质。JokeDeGelder在其数据库一文中给出了DNA与RNA中五种嘌呤与嘧啶的拉曼谱线[18]，其中尿嘧啶为RNA中含有而DNA中不含有的嘧啶。可以看到腺嘌呤较为明显的特征谱峰为723、1248和1371cm-1处；胞嘧啶的明显特征谱峰为792、1250和1275cm-1处；鸟嘌呤的明显特征谱峰在650cm-1处，937、1234和1266cm-1处也有强度较小的特征谱峰；胸腺嘧啶的特征谱峰在1369和1702cm-1处，617和767cm-1处也有强度较小的特征峰；尿嘧啶的特征谱峰主要位于790和1255cm-1处。图33（a-腺嘌呤，b-胞嘧啶，c-鸟嘌呤，d-胸腺嘧啶，e-尿嘧啶）[18]葡萄糖上文提到皮肤中也含有葡萄糖成分，浓度约为血糖浓度的2/3。在相关参考文献中，一般对葡萄糖溶液进行拉曼光谱分析。本文收集到天津工业大学的郑志勇所作《拉曼光谱的预调鸡尾酒成分在线检测研究》一文中获得的葡萄糖溶液拉曼光谱[37]，其中203、228、341cm-1处谱峰为H-O键摇摆运动的结果，1141cm-1处的峰值源自葡萄糖分子环中的碳碳键伸缩，1236cm-1处的谱峰是葡萄糖分子中CH3O官能团中的H-C-H键剪式振动的结果，1449、1610、1759cm-1处的谱峰是由C-H的伸缩摇摆产生的。图34葡萄糖溶液拉曼光谱[37]综合本节所收集的各种皮肤中含有的纯物质及其拉曼光谱特征峰，我们给出如下表格整理:表2物质名称特征谱峰/cm-1参考文献甘氨酸未查找到相关数据脯氨酸未查找到相关数据羟脯氨酸未查找到相关数据酰胺I1463，1655（27），（29）酰胺III1227，1278（29）苯丙氨酸1000，1605（27）黑色素1380，1590（8）酪氨酸未查找到相关数据类胡萝卜素1005，1155，1520（18），（30）角鲨烯1330，1383，1440（31）棕榈酸1070，1134，1443（18），（32）胆固醇1440（33）乳酸825，1450（34）尿素1004（35）水1595，3652，3765（36）腺嘌呤723，1248，1371（18）胞嘧啶792，1250，1275（18）鸟嘌呤650，937，1234，1266（18）胸腺嘧啶1369，1702（18）尿嘧啶790，1255（18）葡萄糖203,238,341,1141,1236,1449,1601,1759（37）表21.2相关各生物分子拉曼光谱数据分析方法在上节的叙述中，我们简要地提到过几种拉曼光谱数据的分析方法。本节中我们将结合更多参考文献，总结出常用的几种方法。首先是较为简单的特征谱峰比对，对拉曼光谱数据进行定性分析。在尹亚宁、P.J.Caspers和格罗德·卢卡森的实验中，均使用到这一方法，将不同皮肤层次拉曼信号的特征谱峰与已知生物分子拉曼光谱特征峰进行比对，可以得到该层次中含有的物质及含量的多少。在对真皮层主要成分胶原蛋白的拉曼光谱分析中，我们将真皮层拉曼信号的特征谱峰波数处与胶原蛋白的拉曼谱线对比，可以看到胶原蛋白谱线中的818、855、940和1248cm-1四个特征峰均在真皮层拉曼谱线中有所体现。此外，一些在生理化学反应中有转换关系的生物分子的拉曼光谱，也是可以相互对比得出结论的对象。前文提到，苯丙氨酸与酪氨酸，也就是形成黑色素的主要氨基酸有关，将这两种物质特征峰处与真皮层与表皮拉曼光谱比较，即可得到黑色素主要存在于表皮（基底层）中。DownesA在他的文章里，也提到了几种利用光谱进行定性分析方法。最常见的光谱分析方法为主成分分析法（PCA）[17]。将一组光谱转换到一个新的坐标系统。每个获得的光谱都被转换为一组基础光谱（或坐标），因此每个获得的光谱都可以从混合物中重建。的比例重建。这个基础集的第一个光谱，被称为第一主成分，在所有获得的光谱之间给出最大的方差（即差异）。这个第一主成分光谱在每个获得的光谱中的比例，可以被绘制在图表的一个轴上。第二主成分包含所有获得的光谱之间的第二大方差，该光谱在每个获得的光谱中的比例将被绘制在图表的第二轴上。如图36所示，Downes采用PCA法，对图35中的深度30-40μm处皮肤组织共焦拉曼光谱进行分析。图35[17]图36[17]聚类分析是一种无监督技术，适用于已经用PCA处理过的一组拉曼光谱。这组光谱可以来自一系列的细胞或组织样本，或者来自拉曼图像中的像素阵列。K-均值聚类分析将所有的数据点（即光谱）分为预定数量的组，即k。最初，在PCA图上选择随机点作为组的中心点，然后每个数据点被分配到最接近这些中心点的位置。这些中心点。当所有的点都被分配到组中时，新的中心点被定义为组中所有光谱的平均值。这个过程重复进行，直到所有的点都保持在相同的组中。层次聚类分析（HCA）是一种更严格的聚类分析。在总数中的每一对点之间的距离将并计算成一个（n×n）矩阵。其中找到距离最近的两个点，并将其作为第一个聚类。这一个聚类和其余的点被视为n-1个对象，最接近的两个对象再被分配为第二个聚类。这个过程重复n-1次，直到所有的点都被归入一个单一的点群。其结果是一个树状图，数据点可以被分组到任何所需数量的组。北京理工大学的吴正洁等人在其利用拉曼光谱对血红蛋白浓度进行定量分析的文章中，提到几种定量分析方[19]。其中一种是以谱峰强度的最高点作为归一化参照的定量分析，对甲醇和乙醇进行定量分析，相对误差率在4%左右。在该论文中，吴等人选取血红蛋白的四个特征峰（如图37），将峰强与血红蛋白浓度作线性回归分析，获得各自的线性回归方程，并通过相关系数R和决定系数R2及各线性方程的平均相对误差来判断该线性方程的准确性（如图38、39中表格所示）。图37[19]图38[19]图39[19]通过分析我们可以看到，1546cm-1处的线性相关是最良好的。此外，根据相关文献，1356cm-1处是去氧血红蛋白的特征谱线，而1371cm-1则是处于氧合状态的血红蛋白特征谱线。若谱线中两种特征谱峰同时出现，证明血红蛋白正处于去氧到氧合状态的转化中，此时若运用该文提到的归一化法做定量分析，可能得到不准确的数据。Gautam和他的团队在《拉曼和红外光谱多维数据处理综述》[20]一文中，对PCA及其他更加细致的统计学数据处理方法进行了介绍与整理。该文提到，PCA能够识别出拉曼光谱数据提供的一些重要信息，但它的辨别能力较弱，因为它是一个无监督的过程。PCA并不试图对那些对一个群体和另一个群体进行分类或对预期结果进行量化的重要模式进行建模，而是对那些能够准确地代表数据的模式进行建模。为了解释通图40[20]过振动光谱技术获得的复杂的生化信息需要进一步的数据分析，使用监督下的程序，如LDA、HCA、PLS、PCR等。LDA（LinearDiscriminantAnalysis），即线性判别分析，其主要的目的是找到“判别轴”，将数据最佳地分为两组及以上的多个类别。LDA与PCA最大的不同在于PCA寻找最大化方差的投影，而LDA寻找的是最大化类间与类内散点比例的投影（如图25）。数据可以通过LDA找到的轴投射到新的维度空间中，在该维度空间里每个观测值将包含更少的变量，同时属于同一类别的观测值将形成聚类，每个聚类将被清晰地区分开来。还可以采用类比的软性建模（SoftIndependentModelingofClassAnalogy）对PCA得到的数据进行细化分类。在考虑类别成员时，该建模方法考虑到未知样本可能与其他样本类似，因此，未知样本将被投射到每一个由PCA得出的PC模型上，并且将未知样本相对于当前PC模型的残差与当前PC模型的平均残差进行比较。若该未知样本的残差为0或超过每个PC模型的特定阈值，将被认定为是离群值，不加入任何一个PC模型。然而如果该残差小于一个以上PC模型的特定阈值，这个未知样本将有可能被归类到数个不同的PC模型中。此外，SIMCA对PC建模阶段使用的数据非常敏感，这也是该数据分析方法的缺点之一。但尽管如此，这个分析方法仍成功地运用来解决了许多对光谱数据的分类问题。该文章中还提到运用ANN（ArtificialNeuralNetwork，人工神经网络）的数据分析方法，该方法是受人脑中枢神经系统功能启发的计算模型。在模型中，许多人工节点（与人脑中枢神经系统中的神经元相对应）被分层排列，每个节点都与相邻层的所有其他节点相连。这些层被分为输入层、隐藏层和输出层。对于一个给定的人工神经网络，只有一个输入层和一个输出层，但可以有许多隐藏层。隐藏层越多，神经网