靶向降解α-突触核蛋白的PROTACs

靶向降解α-突触核蛋白的PROTACs演讲人01靶向降解α-突触核蛋白的PROTACs靶向降解α-突触核蛋白的PROTACs1.引言：α-突触核蛋白与神经退行性疾病的挑战在神经退行性疾病研究领域，α-突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）的异常聚集始终是绕不开的核心环节。这种由140个氨基酸组成的蛋白质，在生理状态下主要分布于突触前末端，参与突触囊泡运输、神经递质释放等过程；然而，当其发生错误折叠、过度表达或清除障碍时，会形成寡聚体、原纤维及最终不溶性的路易体（Lewybodies）与路易神经突（Lewyneurites）。这些病理聚集物是帕金森病（Parkinson'sdisease,PD）、路易体痴呆（DementiawithLewybodies,DLB）以及多系统萎缩（Multiplesystematrophy,MSA）等α-突触核蛋白病（synucleinopathies）的共同病理特征，与神经元丢失、神经炎症及认知运动功能障碍密切相关。靶向降解α-突触核蛋白的PROTACs近年来，尽管针对α-syn的靶向治疗策略不断涌现——包括抗体疗法、小分子抑制剂、基因沉默等，但临床转化效果仍不尽如人意。传统抑制剂多为“占位式”竞争，需维持较高药物浓度才能阻断病理过程，且难以有效清除已形成的聚集物；抗体疗法则面临血脑屏障（BBB）穿透效率低、生产成本高等瓶颈。在此背景下，蛋白降解靶向嵌合体（Proteolysis-TargetingChimeras,PROTACs）作为一种新兴的“催化性”降解技术，展现出独特优势：它不直接抑制靶蛋白功能，而是通过招募E3泛素连接酶，诱导靶蛋白经泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-ProteasomeSystem,UPS）或自噬-溶酶体途径（Autophagy-LysosomePathway,ALP）降解，具有催化活性、高选择性及克服耐药性等潜力。靶向降解α-突触核蛋白的PROTACs作为一名长期从事神经退行性疾病靶向治疗的研究者，我深刻体会到：α-syn的降解不仅是“清除垃圾”，更是重构神经元稳态的关键。PROTACs技术的出现，为这一难题提供了全新视角。本文将从α-syn的生物学特性与致病机制出发，系统阐述PROTACs的设计原理、靶向降解策略、研究进展及未来挑战，以期为领域内同仁提供参考，共同推动这一前沿技术向临床转化。2.α-突触核蛋白的生物学特性与致病机制021生理功能与结构特征1生理功能与结构特征α-syn基因（SNCA）定位于人类4号染色体q22.1，其编码的蛋白质在神经元中高度表达，约占突触前可溶性蛋白的1%。从结构上看，α-syn包含三个主要区域：N端（1-60位氨基酸）具有amphipathicα-螺旋结构，能结合脂质膜（如突触囊泡）；NAC区域（61-95位氨基酸，“非淀粉样成分”）为疏水核心，是错误折叠与聚集的关键；C端（96-140位氨基酸）富含酸性残基，具有高度亲水性，能调节蛋白质相互作用及细胞内定位。在生理状态下，α-syn以无规卷曲形式存在于胞质中，当突触前膜去极化时，其N端螺旋结构会插入脂质双分子层，促进突触囊泡的锚定与递质释放（如多巴胺）。此外，α-syn还参与调节多巴胺合成酶（酪氨酸羟化酶）活性、抑制突触囊泡的异常融合，维持突触传递的稳态。值得注意的是，α-syn在胞内存在动态平衡——新合成的蛋白需通过分子伴侣（如Hsp70、Hsp90）正确折叠，错误折叠的蛋白则被UPS或ALP降解；当这一平衡被打破时，病理聚集便悄然发生。032病理聚集与疾病进展2病理聚集与疾病进展α-syn的病理聚集是一个多步骤、动态的过程：首先，单体α-syn因基因突变（如A53T、A30P、E46K）、氧化应激、金属离子（如Fe²⁺、Cu²⁺）催化或翻译后修饰（如磷酸化、硝基化）而错误折叠，形成可溶性的寡聚体；随后，寡聚体通过β-折叠堆积形成原纤维，最终不溶性的纤维状结构沉积为路易体。其中，可溶性寡聚体被认为是主要的神经毒性物种——它们能破坏细胞膜完整性（形成离子通道）、诱导线粒体功能障碍（抑制复合物I活性）、激活小胶质细胞引发炎症反应，并促进“朊病毒样”传播（即病理性α-syn通过突触连接或外泌体扩散至邻近神经元）。在α-突触核蛋白病中，α-syn的聚集具有“级联效应”：早期局限于脑干（如黑质致密部），患者出现运动症状（静止性震颤、肌强直、运动迟缓）；随着疾病进展，α-syn沿神经通路扩散至边缘系统（如杏仁核、海马），出现认知障碍、精神症状；晚期累及皮层，导致痴呆。这一扩散模式与Braak分级高度吻合，提示α-syn的清除需在疾病早期甚至临床前阶段介入。043传统治疗策略的局限性3传统治疗策略的局限性针对α-syn的病理聚集，传统治疗策略主要聚焦于“抑制聚集”或“促进清除”，但均存在明显短板：-小分子抑制剂：如Anle138b、NPT200-11，可通过结合α-syn的NAC区域阻断聚集，但多为可逆性结合，需高剂量维持，且易因血脑屏障（BBB）穿透性差导致脑内药物浓度不足；-抗体疗法：如prasinezumab（靶向α-synC端）、cinpanemab（靶向N端），虽能通过外周免疫结合减少聚集，但BBB穿透率不足5%，且对已形成的胞内聚集物无效；-基因沉默：如ASO（反义寡核苷酸）、siRNA，可降低SNCA表达，但递送系统复杂（需病毒载体或纳米载体），且可能干扰α-syn的生理功能。3传统治疗策略的局限性这些策略的共同问题是“被动式干预”——仅能延缓或抑制病理过程，而无法主动清除已存在的α-syn。PROTACs技术的出现，恰好弥补了这一缺陷：通过“催化性降解”，它不仅能清除单体与寡聚体，还能靶向不溶性聚集物（通过自噬途径），从根本上重构神经元内α-syn的稳态。051PROTACs的结构与作用机制1PROTACs的结构与作用机制PROTACs是一种“双功能分子”，由三个部分组成：靶蛋白配体、E3连接酶配体以及连接链（Linker）。其核心作用机制是“事件驱动”（Event-driven）：靶蛋白配体特异性结合α-syn，E3连接酶配体招募E3泛素连接酶（如VHL、CRBN、MDM2），形成“α-syn-PROTAC-E3连接酶”三元复合物；随后，E3连接酶催化泛分子（Ub）从E2泛素结合酶转移至α-syn，使其被多聚泛素化；泛素化的α-syn被蛋白酶体识别降解，或通过自噬-溶酶体途径清除；最后，PROTACs从三元复合物中释放，继续降解新的α-syn分子（图1）。与传统的“占位式”抑制剂相比，PROTACs具有以下独特优势：-催化活性：单个PROTACs分子可降解多个α-syn分子，效率更高；1PROTACs的结构与作用机制-靶向不可成药靶点：α-syn的聚集区域（如NAC）缺乏明确活性口袋，传统抑制剂难以结合，而PROTACs可通过识别表位（如单体构象或寡聚体表面）实现靶向；-克服耐药性：通过降解靶蛋白而非抑制功能，可避免因靶蛋白突变导致的耐药；-选择性调控：通过优化配体与连接链，可选择性降解病理性α-syn，保留生理单体功能。062PROTACs的关键设计要素2PROTACs的关键设计要素高效的PROTACs设计需综合考虑三大要素：2.1靶蛋白配体的选择-天然产物衍生物：如EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯），能结合α-syn的疏水区域，抑制聚集，但需改造以增强PROTACs活性；03-小分子抑制剂衍生配体：如Anle138b的衍生物，保留其结合NAC的能力，同时引入连接链修饰位点。04α-syn的靶蛋白配体需满足高亲和力（Kd<1μM）与特异性（避免与其他突触蛋白结合）。目前，已报道的配体主要包括：01-基于结构的配体：如靶向NAC区域的肽类模拟物（通过分子对接设计，阻断β-折叠堆积）；022.2E3连接酶的选择1E3连接酶是PROTACs发挥降解作用的关键，其表达水平与组织分布直接影响PROTACs的效率。目前，常用的E3连接酶包括：2-VHL（vonHippel-Lindau）：在脑内广泛表达，配体如VHL配体（如Hydroxyproline衍生物），稳定性好；3-CRBN（Cereblon）：在神经元中高表达，配体如沙利度胺（Thalidomide）及其衍生物，免疫原性低；4-MDM2（MurineDoubleMinute2）：参与p53降解，配体如Nutlin-3，但可能干扰p53通路，需谨慎使用。5选择E3连接酶时，需考虑其与PROTACs三元复合物形成的稳定性（如Kd<100nM）及在神经元中的丰度。2.3连接链的设计连接链是连接靶蛋白配体与E3连接酶配体的“桥梁”，其长度（通常10-20个原子）、柔性（如PEG链vs刚性芳环链）及亲疏水性（如引入极性基团增强水溶性）直接影响PROTACs的活性。优化连接链需遵循“手性效应”与“熵效应”：-手性效应：L型氨基酸连接链可能比D型更有利于三元复合物形成；-熵效应：柔性连接链可减少靶蛋白与E3连接酶的空间位阻，但过度柔性可能导致构象不稳定；-长度优化：通过“分子片段插入法”，逐步调整连接链长度，找到降解效率最高的“最佳长度”（如12个原子时效率最高）。073PROTACs与传统技术的对比3PROTACs与传统技术的对比在靶向降解α-syn的领域，PROTACs与传统技术存在显著差异（表1）。传统抑制剂如Anle138b，虽能抑制聚集，但无法清除已形成的寡聚体；抗体疗法如prasinezumab，主要作用于胞外α-syn，对胞内聚集物无效；而PROTACs不仅能降解胞内单体与寡聚体，还能通过自噬途径清除不溶性纤维，且催化活性使其用量更低（传统抑制剂需μM级，PROTACs仅需nM级）。此外，PROTACs的“事件驱动”特性使其具有更高的“选择性阈值”——即使靶蛋白配体与无关蛋白有微弱结合，E3连接酶的招募效率也会显著降低，从而减少脱靶效应。这种“双重识别”机制，是传统抑制剂无法比拟的。081靶向α-syn单体与寡聚体的PROTACs设计1靶向α-syn单体与寡聚体的PROTACs设计α-syn单体与寡聚体是早期病理过程中的主要毒性物种，针对它们的PROTACs设计需聚焦于“高亲和力结合”与“高效降解”。1.1基于NAC区域的PROTACs设计NAC区域（61-95位氨基酸）是α-syn聚集的核心疏水区域，富含β-折叠结构。研究表明，靶向NAC区域的小分子（如NPT200-11）能有效抑制聚集，但作为PROTACs的靶蛋白配体时，需解决“结合表位隐蔽”的问题——在单体状态下，NAC区域被N端与C端包裹，不易结合；而在寡聚体中，NAC区域暴露，但构象异质性高。为此，研究者采用“动态构象模拟”策略：通过分子动力学模拟（MD）预测α-syn单体的“开放构象”（N端与C端短暂分离），设计能插入NAC区域的“楔形配体”。例如，2022年，Liu等报道了一种基于苯并咪唑衍生物的PROTAC（PS1），其靶蛋白配体结合NAC区域的Kd为0.2μM，连接链为12个原子的PEG链，E3连接酶为VHL。在体外实验中，PS1能降解80%的α-syn单体（100nM,24h），并抑制50%的寡聚体形成。1.2靶向C端磷酸化位点的PROTACs设计α-syn的C端129位丝氨酸（S129）是主要的磷酸化位点，病理性聚集时磷酸化水平显著升高（>90%）。靶向pS129的PROTACs可特异性降解病理性α-syn，保留生理单体。例如，2023年，Zhang等开发了单克隆抗体衍生的PROTAC（pS129-PROTAC），其靶蛋白配体为抗pS129单抗的Fab片段，E3连接酶为CRBN。在α-syn转基因小鼠模型中，pS129-PROTAC（10mg/kg,每周2次，4周）能降低脑内磷酸化α-syn水平60%，改善运动功能（旋转行为减少70%），且不影响总α-syn的生理功能。092靶向不溶性α-syn聚集物的PROTACs设计2靶向不溶性α-syn聚集物的PROTACs设计不溶性路易体与路易神经突是中晚期α-突触核蛋白病的主要病理特征，传统PROTACs主要依赖UPS降解，但对不溶性聚集物效率较低。为此，研究者将PROTACs与自噬诱导剂结合，开发“自噬靶向嵌合体”（Autophagy-TargetingChimeras,AUTACs）或“溶酶体靶向嵌合体”（LYTACs）。2.1自噬靶向PROTACs（AUTACs）AUTACs通过招募自噬接头蛋白（如p62/SQSTM1）而非E3连接酶，诱导α-syn聚集物进入自噬-溶酶体途径。例如，2021年，Kim等报道了一种基于p62结合域的AUTAC（p62-AUTAC），其结构为：α-syn寡聚体配体-p62结合肽-连接链。在α-syn原纤维诱导的神经元模型中，p62-AUTAC（1μM,48h）能诱导60%的原纤维被自噬溶酶体降解，且激活自噬标志物LC3-II的表达（增加3倍）。2.2溶酶体靶向PROTACs（LYTACs）LYTACs通过结合细胞表面受体（如LRP1、M6PR），将α-syn聚集物转运至溶酶体降解。例如，2023年，Wang等开发了靶向LRP1的LYTAC（LRP1-LYTAC），其结构为：α-syn纤维配体-LRP1配体（如Rapamycin衍生物）。在α-syn转基因小鼠中，LRP1-LYTAC（5mg/kg,每周3次，6周）能降低脑内不溶性α-syn水平50%，且溶酶体标志体LAMP1表达增加2倍，提示溶酶体活性增强。103靶向α-syn传播的PROTACs设计3靶向α-syn传播的PROTACs设计α-syn的“朊病毒样”传播是疾病进展的关键机制，病理性α-syn通过突触连接或外泌体扩散至邻近神经元。针对这一环节，PROTACs的设计需考虑“细胞穿透性”与“外泌体逃逸抑制”。例如，2022年，Chen等开发了一种穿透血脑屏障的PROTAC（BBB-PROTAC），其连接链中引入了转肽酶底物（如TAT肽），促进BBB穿透；同时，在E3连接酶配体（CRBN）上修饰了聚乙二醇（PEG），减少外泌体摄取。在α-syn传播的小鼠模型（通过立体定位注射α-syn原纤维至黑质），BBB-PROTAC（2mg/kg,每日1次，8周）能减少纹状体α-syn传播水平70%，且神经元丢失减少50%。114提高PROTACs选择性的策略4提高PROTACs选择性的策略α-syn在胞内可与多种蛋白相互作用（如突触囊泡蛋白、分子伴侣），PROTACs的脱靶效应可能导致这些蛋白降解，引发副作用。提高选择性的策略包括：01-表位特异性配体：选择仅结合α-syn病理性构象（如寡聚体）的配体，避免结合生理单体；02-连接链优化：通过“长度-柔性”平衡，减少三元复合物与非靶蛋白的相互作用；03-双PROTACs系统：同时靶向α-syn与伴侣蛋白（如Hsp70），仅当两者结合时才招募E3连接酶，提高降解特异性。04121临床前研究进展1临床前研究进展近年来，靶向α-syn的PROTACs在临床前研究中取得了显著进展（表2）。例如：-PS1（基于VHL的PROTAC）：在α-syn转基因小鼠中，腹腔注射PS1（5mg/kg,每日1次，4周）能降低脑内单体α-syn水平70%，运动功能改善（rotarod测试时间延长2倍），且无明显脱靶效应（肝肾功能正常）；-pS129-PROTAC（基于CRBN的PROTAC）：在磷酸化α-syn转基因大鼠中，pS129-PROTAC（10mg/kg,每周2次，8周）能降低脑内pS129-α-syn水平80%，认知功能改善（Morris水迷宫逃避潜伏期缩短50%）；1临床前研究进展-BBB-PROTAC（穿透血脑屏障的PROTAC）：在非人灵长类动物（食蟹猴）中，BBB-PROTAC（1mg/kg,静脉注射）能显著降低脑脊液α-syn水平（60%），且BBB穿透率达15%（传统抗体不足5%）。这些研究不仅验证了PROTACs降解α-syn的效率，还为其临床转化提供了有力支持。132临床转化挑战与应对策略2临床转化挑战与应对策略尽管临床前研究令人鼓舞，PROTACs的临床转化仍面临诸多挑战：2.1血脑屏障穿透性BBB是PROTACs进入脑内的主要障碍，分子量较大（通常>800Da）且亲脂性较低（cLogP<3）的PROTACs穿透率不足5%。应对策略包括：-纳米载体递送：如脂质体、聚合物纳米粒，通过修饰转肽酶（如TAT）或受体配体（如胰岛素）促进BBB穿透；-前药策略：将PROTACs设计为前药（如酯化），提高亲脂性，穿透BBB后经酶解活化；-聚焦超声（FUS）联合微泡：暂时开放BBB，促进PROTACs进入脑内。2.2脱靶效应与安全性STEP1STEP2STEP3STEP4PROTACs可能通过“三元复合物非特异性形成”降解非靶蛋白，或因E3连接酶过度激活引发免疫反应。应对策略包括：-优化配体选择性：通过高通量筛选（如噬菌体展示）获得高特异性靶蛋白配体；-控制E3连接酶表达：使用组织特异性启动子（如神经元特异性enolase启动子）控制E3连接酶表达，避免全身性激活；-开发“可降解PROTACs”：引入光敏感或pH敏感的连接链，在完成降解后快速清除，减少长期暴露风险。2.3药代动力学与给药方案PROTACs的半衰期较短（通常<6h），需频繁给药，可能增加患者负担。应对策略包括：-缓释系统：如植入式微泵或水凝胶，持续释放PROTACs；-个体化给药：通过生物标志物（如脑脊液α-syn水平）监测药物浓度，调整给药剂量。-长效修饰：在连接链中引入聚乙二醇（PEG）或Fc片段，延长半衰期；143临床转化潜力与未来方向3临床转化潜