（2025年版）病理科免疫组化检测实践指南

（2025年版）病理科免疫组化检测实践指南目的免疫组化检测在病理诊断中具有关键作用，它能够通过抗原抗体反应，对组织细胞内的特定抗原进行定位、定性及相对定量研究。本2025年版病理科免疫组化检测实践指南旨在为病理科工作人员提供全面、规范且可操作的指导，确保免疫组化检测结果的准确性、可靠性和重复性，提高病理诊断的水平，为临床治疗和患者管理提供有力支持。前置条件人员要求专业培训：参与免疫组化检测的人员应具备医学检验、病理学等相关专业背景，并接受过系统的免疫组化技术培训。培训内容应包括理论知识（如免疫学原理、抗原抗体反应机制等）和实践操作（如标本处理、试剂使用、仪器操作等）。资质认证：操作人员需取得相应的专业资质证书，如临床检验技师资格证等。定期参加继续教育和学术交流活动，不断更新知识和技能。实验室环境空间布局：免疫组化实验室应合理分区，包括标本处理区、试剂储存区、染色操作区、显微镜观察区等。各区域应相对独立，避免交叉污染。环境条件：实验室应保持清洁、通风良好，温度控制在2025℃，相对湿度控制在40%60%。定期对实验室进行清洁和消毒，记录环境条件数据。仪器设备主要设备：配备高质量的切片机、烤片机、自动免疫组化染色仪、显微镜等仪器设备。定期对仪器进行校准、维护和保养，确保其性能稳定。辅助设备：包括离心机、移液器、天平、冰箱等。这些设备应定期检查和校准，保证其准确性和可靠性。试剂和耗材试剂选择：选用经过国家药品监督管理部门批准、质量可靠的免疫组化试剂。根据检测项目和实验要求，选择合适的抗体、显色剂、封闭剂等试剂。试剂储存：严格按照试剂说明书的要求储存试剂，一般抗体应保存在-20℃或-80℃冰箱中，其他试剂应根据其性质保存在相应温度的冰箱或室温环境中。定期检查试剂的有效期，避免使用过期试剂。耗材准备：准备足够的载玻片、盖玻片、染色缸、移液器吸头、离心管等耗材。耗材应符合质量标准，无杂质和污染。详细步骤标本采集与处理标本采集手术标本：手术切除的标本应及时固定，一般采用10%中性福尔马林固定液，固定时间为24小时左右。固定液的体积应至少为标本体积的10倍。穿刺标本：穿刺活检标本应立即放入固定液中，固定时间根据标本大小而定，一般为46小时。标本脱水：将固定好的标本依次放入不同浓度的酒精中进行脱水处理，从低浓度到高浓度，酒精浓度依次为70%、80%、90%、95%、无水酒精Ⅰ、无水酒精Ⅱ，每个梯度脱水时间根据标本大小而定，一般为12小时。透明：脱水后的标本放入透明剂（如二甲苯）中，使标本透明，便于石蜡浸入。透明时间一般为23次，每次1530分钟。浸蜡：将透明后的标本放入熔化的石蜡中，进行浸蜡处理。一般采用梯度浸蜡，从低熔点石蜡到高熔点石蜡，浸蜡时间根据标本大小而定，一般为23小时。包埋：将浸蜡后的标本放入包埋模具中，加入熔化的石蜡，迅速将标本摆放整齐，待石蜡凝固后，取出包埋块。切片与烤片切片：使用切片机将包埋块切成46μm厚的切片。切片时应注意切片的完整性和连续性，避免出现皱折、刀痕等现象。展片：将切好的切片放入温水中展平，水温一般为4045℃。展片时间不宜过长，以免切片变形。捞片：用载玻片将展平的切片捞起，注意切片应平整地附着在载玻片上。烤片：将捞好切片的载玻片放入烤片机中，在60℃下烤片23小时，使切片牢固地附着在载玻片上。脱蜡与水化脱蜡：将烤好的切片放入二甲苯中进行脱蜡处理，一般进行23次，每次510分钟。水化：脱蜡后的切片依次放入不同浓度的酒精中进行水化处理，从高浓度到低浓度，酒精浓度依次为无水酒精Ⅱ、无水酒精Ⅰ、95%、90%、80%、70%，每个梯度水化时间为23分钟。最后将切片放入蒸馏水中冲洗23次，每次23分钟。抗原修复选择修复方法：根据抗体的要求和标本的类型，选择合适的抗原修复方法。常用的抗原修复方法有高温高压修复法、微波修复法、酶消化法等。高温高压修复法：将水化后的切片放入抗原修复液中，置于高压锅中加热至沸腾，盖上锅盖，继续加热至喷气后计时35分钟，然后迅速冷却至室温。微波修复法：将水化后的切片放入抗原修复液中，置于微波炉中加热至沸腾，然后调至中火，继续加热510分钟，取出冷却至室温。酶消化法：将水化后的切片滴加酶消化液，在37℃孵育1030分钟，然后用PBS冲洗3次，每次35分钟。封闭内源性过氧化物酶配制封闭液：一般采用3%过氧化氢溶液作为封闭液。封闭处理：将抗原修复后的切片用PBS冲洗3次，每次35分钟，然后滴加封闭液，室温孵育1015分钟，以封闭内源性过氧化物酶。血清封闭配制封闭血清：根据抗体说明书的要求，选择合适的封闭血清，如山羊血清、兔血清等。一般用PBS稀释成5%10%的封闭血清溶液。封闭处理：将封闭内源性过氧化物酶后的切片用PBS冲洗3次，每次35分钟，然后滴加封闭血清，室温孵育1530分钟，以减少非特异性染色。一抗孵育抗体稀释：根据抗体说明书的要求，用抗体稀释液将一抗稀释至合适的浓度。孵育条件：将血清封闭后的切片甩干多余液体，滴加稀释好的一抗，放入湿盒中，在4℃冰箱中过夜孵育或37℃孵育12小时。二抗孵育二抗选择：根据一抗的种属来源，选择合适的二抗，如抗兔IgG、抗鼠IgG等。孵育条件：将一抗孵育后的切片用PBS冲洗3次，每次35分钟，然后滴加二抗，室温孵育3060分钟。显色配制显色剂：根据检测系统的要求，配制合适的显色剂，如DAB显色剂、AEC显色剂等。显色处理：将二抗孵育后的切片用PBS冲洗3次，每次35分钟，然后滴加显色剂，室温孵育510分钟，观察显色效果，待显色满意后，用蒸馏水冲洗终止显色。复染复染液选择：常用的复染液为苏木精染液。复染处理：将显色后的切片放入苏木精染液中复染12分钟，然后用自来水冲洗，再用盐酸酒精分化数秒，最后用自来水冲洗返蓝。脱水、透明与封片脱水：将复染后的切片依次放入不同浓度的酒精中进行脱水处理，从低浓度到高浓度，酒精浓度依次为70%、80%、90%、95%、无水酒精Ⅰ、无水酒精Ⅱ，每个梯度脱水时间为23分钟。透明：脱水后的切片放入透明剂（如二甲苯）中，使切片透明，一般进行23次，每次23分钟。封片：将透明后的切片滴加适量的封片剂，盖上盖玻片，避免产生气泡。结果观察与判断显微镜观察：使用显微镜对封片后的切片进行观察，先在低倍镜下观察切片的整体情况，然后在高倍镜下观察细胞和组织的染色情况。结果判断：根据阳性对照和阴性对照的结果，结合检测项目的标准，对切片的染色结果进行判断。阳性结果表现为细胞或组织出现特定颜色的染色，阴性结果则无染色或仅有极微弱的背景染色。结果判断应客观、准确，必要时可请多位病理医生进行会诊。常见问题与排错提示染色背景过高原因分析：可能是血清封闭不充分、抗体浓度过高、孵育时间过长、洗涤不彻底等原因导致。解决方法：增加血清封闭时间和封闭血清的浓度；适当降低抗体浓度，缩短孵育时间；加强洗涤步骤，增加洗涤次数和时间。染色阳性信号弱或无阳性信号原因分析：可能是抗体效价低、抗原修复不充分、显色时间过短等原因导致。解决方法：更换高质量的抗体或调整抗体浓度；优化抗原修复方法和条件；适当延长显色时间。非特异性染色原因分析：可能是内源性过氧化物酶未封闭完全、组织中存在交叉反应抗原等原因导致。解决方法：加强内源性过氧化物酶的封闭处理；选择特异性更高的抗体，或在抗体孵育前进行预吸附处理。切片脱片原因分析：可能是烤片时间不足、载玻片处理不当、抗原修复温度过高或时间过长等原因导致。解决方法：延长烤片时间；使用防脱玻片或对载玻片进行特殊处理；优化抗原修复条件，避免温度过高和时间过长。质量控制阳性对照：每次免疫组化检测都应设置阳性对照切片，阳性对照切片应选择已知阳性的组织标本，其染色结果应呈现典型的阳性反应。阴性对照：同时设置阴性对照切片，阴性对照切片可以采用不加一抗或用无关抗体代替一抗的方法。阴性对照切片应无染色或仅有极微弱的背景染色。内部质量控制：定期对免疫组化检测结果进行分析和评估，建立质量控制图，及时发现和解决检测过程中出现的问题。外部质量评价：积极参加室间质量评价活动，与其他实验室进行比对，不断提高免疫组化检测的准确性和可靠性。报告与记录报告内容：免疫组化检测报告应包括患者基本信息、标本类型、检测项目、染色结