北大核医学课件01基础篇-6体外分析技术

作者:高识单位:吉林大学中日联谊医院第六章

体外分析技术（一）第一节放射性标记分析技术第二节非放射性标记免疫分析技术第三节其他体外分析方法第四节体外分析实验室质量控制第五节常用体外分析实验室管理方法简介第六节体外分析的临床应用重点难点熟悉了解掌握放射免疫分析与免疫放射分析原理、试剂组成及两者比较非放射性标记免疫分析优点、体外分析实验室质量控制体外分析实验室管理方法、体外分析项目体外分析技术是核医学专业重要的组成部分，是核医学专业发展的基础。核医学体外分析技术是在放射免疫分析基础上发展起来的集各种体外分析方法为一体，以标记免疫分析（放射性核素及各类发光物质为标记物）为核心，其他分析方法为辅助的一类临床实验医学。核医学体外分析是对取自人体的生物样本进行微生物学、免疫、化学、血液学、生物物理、细胞学、病理学或其他检测，为人类疾病早期诊断、预防、治疗或健康评价提供信息的学科。体外分析技术分为放射分析和非放射性分析技术。核医学（第9版）

体外分析技术概述

放射免疫分析法原理与体外分析技术发展示意图RIA是所有标记免疫分析的基础，超微量分析的检测源于RIA，RIA及在此基础上发展起来的检测方法，是临床医疗不可缺的诊断、治疗疗效评价的手段1977Yalow获诺贝尔奖核医学（第9版）放射性标记分析技术第一节一、放射免疫分析放射免疫分析（RIA）是指在体外条件下,利用非标记抗原（含待测抗原及标准品，简称Ag）及定量的放射性核素标记抗原（*Ag）对限量的特异性抗体（Ab）的竞争结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag量的一种超微量分析技术。20世纪50年代，放射免疫分析法的建立与临床应用，开创了微量物质检测的新纪元。核医学（第9版）125IAg标准品\质控品\待测体液*Ag与Ag免疫活性相同；

在一定的反应条件下；*Ag、Ab为恒定量；*Ag＋Ag>Ab。B%=B/(B+F)F%=F/(B+F)R=B/FAg

=*Ag,AgAb

=*AgAb

Ag

>*Ag,*AgAb(B)

*Ag(F)Ag

<*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)核医学（第9版）特异性抗体AbRIA的基本原理示意图，原理是竞争性结合抑制反应1.RIA的基本原理试剂NSB管S0-S5标准管样品管质控管标准品100（零标准品）100——质控血清———50待测样本——100—125I-Ag100100100100蒸馏水100———抗体—100100100混匀，37℃温育1小时分离试剂500500500500充分混匀，室温（15～28℃）下放置15分钟离心前任取两管测量，作为总放射性T，3500rpm（离心力1500g）离心20分钟，立即弃去上清

液，测各管1分钟的发射性计数（cpm）。2.放射免疫分析加样流程核医学（第9版）RIA加样程序（体积：µl）加入已知定量(ml)125IAg标记抗原（*Ag）加入已知定量(ml)抗体

(Ab)温浴反应达平衡分离（固相、液相）B、FB%=B/(B+F)F%=F/(B+F)R=B/F横坐标纵坐标核医学（第9版）3.RIA标准曲线制作RIA标准曲线制作标记物与被测物之间的函数关系可以用标准竞争抑制曲线（标准曲线）来表示。制作方法：

将药盒中一系列已知浓度（递增）的标准品抗原（标准品），分别加入相应的试管；加入固定量的*Ag和Ab；待竞争结合反应达到平衡后，分离抗原的结合部分和游离部分；用放射性测量仪（γ-计数仪）测定*Ag-Ab。（B）或游离*Ag（F）的放射性，在坐标纸或计算机拟合曲线。核医学（第9版）3.RIA标准曲线制作γ-免疫计数仪γ-计数仪：实际测量的放射性信号是仪器输出的电脉冲数，单位为：cpm（countsperminute）或者cps（countspersecond）。3.RIA标准曲线制作常用的计算方式有B、B/B0%等。B或B/B0%作纵坐标来对应标准抗原的浓度作标准曲线，选用的反应变量不同，标准曲线的形状也不同。但是这些标准曲线都是反映的反应变量对应标准抗原浓度变化而变化的函数关系。核医学（第9版）RIA标准曲线核医学（第9版）加入*Ag已知定量(ml)加入已知定量(ml)抗体

(Ab)温浴反应达平衡分离（固相、液相）B、FAg【各种体液（待测抗原)】与一定量的*Ag(标记抗原）共同与限量特异性Ab发生反应已知未知已知未知4.未知样品的测量RIA分析待测样本测量示意图放免分析的三大试剂特异性抗体（Ab)；标准品抗原(Ag)；标记抗原(*Ag)；此外，还需有将B、F分开的分离试剂（方法）；因此，放免法就是三大试剂，一大分离试剂（方法）。核医学（第9版）5.放射免疫分析的基本试剂RIA试剂盒组成（1）抗体：亲和力、特异性、滴度（稀释度）；（2）标记抗原：

比活度、放射化学纯度、免疫活性、生物活性、半衰期足够长、125I；（3）标准品：化学结构、免疫活性、定量精确。核医学（第9版）5.放射免疫分析的基本试剂RIA法抗体稀释曲线示意图（1）液相分离方法（沉淀法、双抗体法、双抗体法+沉淀法）；（2）固相分离法。核医学（第9版）RIA沉淀分离法示意图RIA固相分离法示意图6.放射免疫分析的分离方法二、免疫放射分析技术核医学（第9版）免疫放射分析技术是指在体外应用放射性核素标记抗体，过量的标记抗体与待测抗原混合，待充分反应后，除去游离的标记抗体，其放射性强度与待测抗原呈正比。IRMA标准曲线示意图IRMA反应原理示意图核医学（第9版）免疫放射分析分离方法1.双抗体夹心法（双位点法）；2.标记第三抗体法（标记双抗法）；3.双标记抗体法；4.生物素

链霉亲和素分离法。核医学（第9版）RIA法与IRMA法比较示意图

RIA法

IRMA法标记物

Ag

Ab原理

竞争性结合

非竞争性结合抗体量

限量

过量标准曲线

负相关

正相关达到平衡的速度

慢

快可测范围

窄

宽应用对象

大分子、小分子

大分子低剂量区不确定因素

有

无IRMA与RIA低剂量区不确定因素比较示意图非放射性标记免疫分析技术第二节核医学（第9版）1.酶标记免疫分析2.化学发光免疫分析（1）直接化学发光免疫分析（2）化学发光酶免疫分析3.电化学发光免疫分析4.光激化学发光免疫分析5.时间分辨荧光免疫分析6.上转发光免疫分析技术核医学（第9版）1.酶标记免疫分析酶标记免疫分析技术（EIA）中以酶联免疫吸附法（ELISA）应用最广泛。ELISA是用聚苯乙烯作微量反应板，酶标记抗原或抗体，反应模式与RIA/IRMA相同，用酶替代了125I，检测仪器是酶标仪。常用的酶有：辣根过氧化物酶、碱化磷酸酶、葡萄糖氧化酶。酶标仪与洗板机核医学（第9版）2.化学发光免疫分析（1）直接化学发光免疫分析用能产生化学发光的化合物代替放射性标记物，标记抗原或抗体，其他步骤和RIA或IRMA基本相同，反应以后，利用碱性条件下化学发光物质在氧化物作用下可以发生单光子放射。检测光子的数量就可以反映复合物的量。常用的化学发光物质是异鲁米那和吖啶酯。吖啶酯的特点是：①分子量小，因而对被标记物的空间位阻小；②发光反应快速而强烈，背景噪音低；③直接发光，无需酶催化，反应时间短，误差小；④受pH和温度影响小，检测精确度高；性质稳定，试剂保存期长。核医学（第9版）2.化学发光免疫分析（2）化学发光酶免疫分析标记物是碱性磷酸酶标记的抗体。经过夹心法免疫反应（和IRMA相似），复合物带有酶标记，加入特殊的底物、酶促反应使底物断裂，使底物发射出光子，产生化学发光。此法光子发射持续时间较长，可靠性比较好。常用的酶及底物是：辣根过氧化物酶（HRP），鲁米诺作为发光底物；碱性磷酸酶

(AP)，3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐（AMPPD）作为发光底物，AMPPD在碱性和热环境下稳定性好，故本底低。核医学（第9版）3.电化学发光免疫分析电化学发光是一种在电极表面由电化学引发的化学反应，主要反应物质包括三联吡啶钌[Ru（bpy）3]2+和电子供体三丙胺（TPA），在电场中的阳电极表面[Ru（bpy）3]2+和TPA*可同时失去一个电子而发生氧化反应。标记物可以循环利用，使发光时间更长、强度更高、易于测定。

电化学发光免疫分析原理示意图核医学（第9版）电化学发光免疫检测系统是以三联吡啶钌[Ru（bpy）3]2+为标记物，标记抗原或抗体。三联吡啶钌是高度稳定性的水溶性小分子物质，分子量小、结构简单，可以标记各种分子。电化学发光免疫分析检测步骤简化、易于自动化、标记分子小、可实现多标记、标记物非常稳定、发光时间长、灵敏度高、光信号线性好、动力学范围宽、可重复测量、重现性好、可实现多元检测和均相免疫分析。电化学发光特点电化学发光免疫分析原理示意图核医学（第9版）4.光激化学发光免疫分析光激化学发光（LiCA）免疫分析技术是一种利用化学发光物质进行免疫测定的方法，其基础原理是一种均相免疫反应。它是基于两种微粒表面包被的抗原或抗体，在液相中形成免疫复合物而将两种微粒拉近，在激光的激发下，发生微粒之间的粒子氧的转移，进而产生高能级的红光，通过单光子计算器和数学拟合将光子数换算为靶分子浓度。感光微球发光微球

直径：200nm

包被亲和素

红色激光680nm照射

释放单线态氧

直径：200nm

用于包被抗体/抗原

接受单线态氧

产生610nm光光激化学发光免疫分析原理示意图核医学（第9版）不同品牌化学发光分析仪碱性磷酸酶发光分析仪器吖啶酯发光免疫分析仪器吖啶酯发光免疫分析仪器三联吡啶钌电化学发光免疫分析仪器其他体外分析方法第三节核医学（第9版）一、质谱分析二、分子诊断技术三、流式细胞技术核医学（第9版）质谱分析质谱的基本概念质谱是什么？

特殊的天平：称量离子的质量；

质谱能做什么？

定性：化合物的结构；定量：混合物的组成。领域：化学、生物学、医学、药学、环境、物理、材料、能源等。

质谱的独到之处是什么？

Sensitivity：灵敏；Speed：快速；Specificity：特异；Stoichiometry：化学计量。质谱示意图，称原子的称核医学（第9版）液相色谱-串联质谱联用技术（LC-MS）是将色谱分析的高效分离能力和质谱分析的准确、特异、灵敏、多组份检测有机结合在一起的检测方法，是临床检验领域最富有生命力的新技术。LC-MS应用日益广泛，涉及到多学科的微量物质检测，如激素、儿茶酚胺类物质、氨基酸、维生素、药物浓度监测、新型生物标志物分析等等。尤其是各种生物样品中小分子化合物定量检测上应用越来越广泛，已成为现代分析手段中必不可缺的组成部分，它必将成为临床检验常规应用最重要的方法。作者：高识单位：

吉林大学中日联谊医院第六章

体外分析技术（二）第一节放射性标记分析技术第二节非放射性标记免疫分析技术第三节其他体外分析方法第四节体外分析实验室质量控制第五节常用体外分析实验室管理方法简介第六节体外分析的临床应用重点难点熟悉了解掌握放射免疫分析与免疫放射分析原理、试剂组成及两者比较非放射性标记免疫分析优点、体外分析实验室质量控制体外分析实验室管理方法、体外分析项目体外分析实验室质量控制第四节核医学（第9版）

一、检验质量要求（做质控）为什么很重要?如果我们的检验结果不能击中我们的质量目标，产生的误差和变异就击中了患者！错误的数据对于患者来说比没有数据更危险！每天做质量控制的重要性：除了校准品，唯一可以依靠的是质控品和它的均值与标准差!实验室只能依赖每天做质量控制，从每天的控制值与均值比较，可以大致上了解今天检测结果的可靠性。质量控制的重要性二、检验误差在检测过程中的比例检验过程的误差核医学（第9版）、、核医学（第9版）广义：是指用于预防误差或检测误差的整体过程、程序和技术，包括良好的教育、在职培训，以及正确的采集、处理、分析标本并将实验结果报告给正确的人。狭义：仅指过程质量控制，通常称为统计质量控制（SQC），用于监测和控制实验室检测过程的分析质量。SQC是一种广泛应用的技术，保证样本在独立的分析批、不同天数或很长一段时间后足够稳定，用商品化的质控品。好的质量控制三要素：正确的质控品；合理的测定方式及相应工具；合适的结果评价及判定方式。建议采用风险管理减少误差，改进和控制质量。三、质量控制概念核医学（第9版）是由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本实验室工作的精密度。必须有相应的EQA文件化支持，文件需适应本实验室的实际情况。

可概括为

◆

执行者：实验室技术人员；

◆目

的：监测实验室测定的精密度；

◆功

能：决定了当批测定的有效性，报告可否发出。

◆是对实验室测定的即时性评价。四、室内质量控制（internalqualitycontrol，IQC）室内质量控制质控图室内质量控制失控分析基本线路图1.室内质量控制失控分析核医学（第9版）室内质量控制失控处理方法通过六西格玛、人机料法环、PDCA循环查找失控原因，按照质控规则进行整改2.室内质量控制失控处理方法核医学（第9版）核医学（第9版）临检中心：是独立的外部机构（国际、国家、地方）。

多家实验室分析同一标本，采取一定的办法，连续、客观评价实验室结果，衡量各实验室的质控数据，比较测定结果与靶值的差异，给出得分和质评结果。

◆评价实验室操作的过程，通过实验室间的比对判定实验室的校准、检测能力以及监控其持续能力。◆发现误差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性。◆是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用来决定实时定结果的可接受性。必须有相应的EQA文件化支持，文件需适应本实验室的实际情况。五、室间质量评价（externalqualityassessment，EQA）室间质评证书室间质量评价的作用

评价实验室的检测能力；识别问题并采取相应的改进措施； 改进分析能力和实验方法；确定重点投入和培训要求；实验室质量的客观证据；支持实验室认可；增加实验室用户的信心；实验室质量保证的外部监督工具。核医学（第9版）准确度

（accuracy）：不确定度（uncertainty）总误差（totalerror）EQA正确度（trueness）：均值与真值的接近程度

系统误差偏倚（BIAS）

EQA精密度（precision）：重复测量结果之间的接近程度

随机误差

标准差（SD）

IQC好好＋结果准确医患信赖室内质控室间质评核医学（第9版）六、室内质控与室间质评的关系精密度、正确度、准确度的关系核医学（第9版）七、实验室风险管理实验室风险管理风险管理：风险识别示意图实验室风险识别鱼骨图核医学（第9版）核医学（第9版）评估剩余风险不可接受控制措施控制措施评估剩余风险风险控制（riskcontrol）：通过一系列决策和保护措施，降低风险或把风险控制在可接受水平的过程。旧的风险处理或控制的同时，有可能会出现新的风险，应加强全面质量和安全管理，以降低风险发生的几率。风险管理：风险控制示意图常用体外分析实验室管理方法简介第五节核医学（第9版）一、核医学体外分析实验室管理规范《核医学体外分析实验室管理规范》是第一部由核医学人编写的规范核医学实验室质量管理的标准。《管理规范》适用于核医学体外分析实验室的质量管理，核心内容是：组织管理：实验室组织结构，实验室人员组成。质量管理：设备、试剂准入及方法学评价，分析前质量保证、分析中质量控制、分析后质量管理。安全管理：场所、设施和环境的安全标准，安全管理制度和要求。风险管理：检测过程中发生损失和不安全事件的不确定性及可能性，通过发生概率和影响程度来衡量。核医学体外分析实验室管理规范核医学（第9版）核医学（第9版）二、ISO15189《医学实验室质量和能力认可准则》ISO15189介绍ISO15189内涵核医学（第9版）六西格玛（6σ、SixSigma、6Sigma）是管理策略、方法、工具；核心特征是顾客与组织的双赢以及经营风险的降低。当检测过程有缺陷时，通过6σ找出如何系统地减少缺陷的方法。检测要想达到6σ标准，那它的