新生儿溶血病血清学检查标准操作规程

新生儿溶血病血清学检查标准操作规程1.目的规范新生儿溶血病（HDN）血清学检查的操作流程，确保检验结果的准确性、可靠性和及时性，为临床诊断、治疗新生儿溶血病提供科学依据。2.范围本规程适用于临床实验室开展的新生儿溶血病相关血清学检查，包括新生儿及其母亲的血型鉴定、直接抗人球蛋白试验、游离抗体试验及放散试验等。3.职责3.1检验人员：严格按照本规程进行操作，确保操作规范，结果准确，及时完成检验并提交报告。负责仪器设备的日常维护保养和试剂的正确使用与管理。3.2科室负责人：监督本规程的执行情况，负责检验质量控制，组织人员培训和技术考核。3.3标本采集人员：负责按照标准要求采集合格的血液标本，并正确标识。4.标本采集与处理4.1标本类型：新生儿采集静脉血或足跟血（滤纸干血片仅适用于部分筛查项目，确诊需静脉血）；母亲采集静脉血。4.2采集容器：使用EDTA-K₂抗凝管（紫色帽）。4.3标本标识：清晰标注患儿及母亲姓名、性别、出生日期（或住院号）、标本类型、采集日期和时间、采集人。4.4标本处理：采集后及时送检。若不能及时检验，全血标本应在2-8℃冷藏保存，保存时间不超过规定时限。血清或血浆分离后，可在2-8℃短期保存或-20℃以下冷冻保存，但需避免反复冻融。4.5标本拒收标准：标签不清或错误、标本溶血严重、抗凝不当（如凝固）、容器破损、采集量不足、超过保存时限的标本应拒收，并记录原因，通知重新采集。5.试剂与器材5.1试剂：5.1.1ABO血型定型试剂（抗-A、抗-B、抗-AB，以及A、B、O型红细胞悬液）。5.1.2RhD血型定型试剂（抗-D）。5.1.3抗人球蛋白试剂（多特异性及单特异性，如抗-IgG、抗-C3d等）。5.1.4生理盐水。5.1.5抗体筛选细胞、谱细胞（用于抗体鉴定）。5.1.6其他相关试剂（如放散液等）。所有试剂均应符合国家相关标准，在有效期内使用，按说明书要求储存和处理。5.2器材：5.2.1血型血清学专用离心机。5.2.2恒温水浴箱或孵育器。5.2.3显微镜。5.2.4试管、吸管、加样器及配套吸头。5.2.5记号笔、试管架、离心机转子等。5.3器材校准与维护：定期对离心机、水浴箱等仪器进行校准和维护，确保其性能符合实验要求。6.操作步骤6.1ABO及RhD血型鉴定（新生儿及母亲）6.1.1ABO正定型（新生儿红细胞）：按试剂说明书操作，将新生儿红细胞悬液与抗-A、抗-B、抗-AB血清反应，观察有无凝集。6.1.2ABO反定型（母亲血清，新生儿血清通常因抗体水平低或缺乏，反定型意义不大）：将母亲血清与A、B、O型试剂红细胞反应，观察有无凝集。6.1.3RhD血型鉴定：将待检红细胞悬液与抗-D试剂反应，按说明书判定结果。注意区分弱D表型。6.1.4结果判定：根据有无凝集及凝集强度判断血型。6.2直接抗人球蛋白试验（DAT）6.2.1原理：检测新生儿红细胞表面是否结合有不完全抗体（主要是IgG）或补体成分。6.2.2操作：6.2.2.1取新生儿抗凝血，离心后弃去血浆，用大量生理盐水洗涤红细胞3-4次，末次洗涤后尽量弃净上清液。6.2.2.2制备压积红细胞悬液（通常为5%）。6.2.2.3取适量洗涤后的红细胞悬液加入试管中，加入抗人球蛋白试剂（多特异性），混匀。6.2.2.4按试剂说明书规定的离心条件离心。6.2.2.5轻轻摇动试管，观察有无凝集。若多特异性抗人球蛋白试验阳性，需进一步用单特异性抗人球蛋白试剂（如抗-IgG、抗-C3d）进行试验，以明确致敏红细胞的抗体类型。6.2.3结果判定：出现凝集为阳性，无凝集为阴性。同时做阳性和阴性对照。6.3游离抗体试验6.3.1原理：检测新生儿血清中是否存在能与相应红细胞抗原结合的游离IgG血型抗体。6.3.2操作：6.3.2.1分离新生儿血清。6.3.2.2将新生儿血清与一组筛选红细胞（或已知抗原的试剂红细胞，如母亲可能产生的抗体对应的抗原阳性红细胞）反应。6.3.2.3按规定条件孵育（通常37℃），然后离心观察有无凝集。6.3.2.4若出现凝集，需进一步用谱细胞进行抗体鉴定，确定抗体特异性。6.3.3结果判定：与筛选红细胞出现凝集为阳性，提示存在游离抗体。6.4放散试验6.4.1原理：将致敏在新生儿红细胞上的抗体解离下来，然后检测放散液中的抗体特异性。6.4.2操作（以热放散法为例，具体方法根据实验室常规和试剂说明选择）：6.4.2.1取洗涤干净的新生儿压积红细胞，加入适量生理盐水或放散液。6.4.2.2置于56℃水浴中孵育一定时间，期间不断轻轻振摇。6.4.2.3离心，分离上清液即为放散液。6.4.2.4将放散液与一组谱细胞反应，按抗体鉴定方法操作，观察有无凝集。6.4.3结果判定：放散液与相应抗原的红细胞出现凝集为阳性，可确定抗体特异性。7.结果判读与解释7.1血型鉴定：根据正、反定型结果确定ABO及RhD血型。新生儿ABO血型可能因母体抗体干扰或抗原表达弱而出现正反定型不符，需结合母亲血型及其他试验综合判断。7.2DAT结果：7.2.1阳性：提示红细胞表面结合有抗体或补体，是新生儿溶血病的重要指标。需结合抗体类型（IgG或C3d）及其他试验结果分析。7.2.2阴性：不能完全排除新生儿溶血病，需结合临床及其他血清学试验结果综合判断，如ABO溶血病中DAT可呈弱阳性或阴性。7.3游离抗体试验：阳性提示血清中存在游离的血型抗体，可能来自母体，与新生儿红细胞抗原结合可导致溶血。抗体特异性明确时更有意义。7.4放散试验：阳性且抗体特异性明确时，对新生儿溶血病的诊断具有确诊意义，尤其是DAT阳性时。放散出的抗体通常与母体血清中的抗体一致。7.5综合判断：结合母婴血型、DAT、游离抗体及放散试验结果，判断是否存在新生儿溶血病及其可能的原因（如ABO血型不合、Rh血型不合或其他稀有血型不合）。8.结果报告与记录8.1结果报告：检验完成后，及时、准确地出具检验报告。报告内容应包括：患者基本信息、标本信息、检验项目、检验结果（包括血型、各项试验结果及抗体特异性等）、结果解释（必要时）、检验者、复核者及报告日期。8.2报告审核：检验结果需经授权人员审核后方可发出。审核者应确认检验过程符合规程，结果准确无误，解释合理。8.3记录保存：所有检验原始记录（包括试剂信息、质控结果、标本信息、操作过程、观察结果、结果计算、报告等）应完整、清晰、规范地记录，并按规定保存一定年限，确保可追溯性。9.质量控制9.1室内质量控制：每批次实验均应设置阳性对照和阴性对照。定期进行试剂性能验证、仪器设备校准、人员操作比对等。9.2室间质量评价：积极参加国家或地方组织的室间质量评价活动，对不合格项目及时分析原因并采取纠正措施。9.3试剂质量控制：试剂到货后应进行验收，检查标签、有效期、外观等，必要时进行性能验证。9.4人员培训与考核：定期对检验人员进行专业知识和操作技能培训及考核，确保其具备相应的能力。10.注意事项10.1生物安全：严格遵守生物安全操作规程，穿戴个人防护用品（如手套、口罩、实验服），正确处理医疗废弃物。10.2试剂使用：严格按照试剂说明书操作，注意试剂的储存条件和有效期，避免污染。10.3操作规范：所有操作应轻柔、准确，避免剧烈振摇导致假阴性。离心条件应严格控制。10.4结果观察：观察凝集结果时，应在良好光线下，轻轻摇动试管，仔细观察有无凝集及凝集强度。必要时可借助显微镜观察。10.5防止交叉污染：加样器吸头、试管等应一次性使用，实验台面和器材应定期消毒。10.6保密：保护患者隐私，不得泄露检验结果。11.异常情况处理11.1若出现异常结果（如与预期不符、质控失控等），应立即停止报告，查找原因（如试剂问题、操作失误、仪器故障等），必要时重新实验。11.2若标本出现严重溶血、脂血等可能干扰试验结果的情况，应通知临床重新采集标本或在报告中注明可能的影响。11.3仪器设备发生故障时，应立即停止使用，报告科室负责人，并联系维