T-SNLT 0028-2025 牛结核病荧光PCR检测操作技术规程

石河子农产品流通协会发布ICS65.020.20CCSB052025-09-18发布T/SNLT0028-2025 1 3 IT/SNLT0028-2025本文件按照GB/T1.1-2020给出的规则起草。本文件由第八师石河子市畜牧水产发展服务中心提出并归口。本文件起草单位：第八师石河子市畜牧水产发展服务中心、新疆生产建设兵团第八师一四二团农业和林业草原中心、新疆生产建设兵团第八师一四四团农业和林业草原中心。本文件主要起草人：陈强斌、窦立静、王强、房文斌、宋德强、赵艳梅、刘强、王宏伟、蔺文龙、李怡、周彬、杨阳、潘谱宁、程军。1T/SNLT0028-2025牛结核病荧光PCR检测操作技术规程本文件规定了规模化奶牛场牛结核病荧光PCR检测的技术要点和操作规范。本文件适用于规模化奶牛场牛结核病的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本使用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T18645动物结核病诊断技术GB/T27639结核病病原菌实时荧光PCR检测方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1牛结核病bovinetuberculosis牛结核病是由牛分支杆菌引起的一种人兽共患慢性细菌性传染病。3.2Ct值Cyclethreshold每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环次数。4器材与试剂4.1器材荧光定量PCR仪、台式高速冷冻离心机（离心力可达15000g）、涡旋混匀振荡器、PCR管离心机、Ⅱ级生物安全柜、冰箱(2℃~8℃,-20℃)、全自动核酸提取仪、不同量程微量可调移液器。无酶过滤吸头（10μL加长、200μL、1000μL加长）、无酶离心管（1.5mL、2mL）、0.1mL无酶荧光定量PCR8联反应管。4.2试剂牛结核病荧光PCR检测试剂盒（48T细菌基因组提取试剂盒（48T结核杆菌核酸提取试剂盒T/SNLT0028-2025（48T）。5荧光PCR操作方法5.1样品前处理按照GB/T18645的规定执行。5.2核酸提取按照细菌基因组提取试剂盒或者结核杆菌核酸提取试剂盒说明书进行核酸提取。5.3荧光PCR检测5.3.1扩增试剂的准备与配置（试剂配置区）使用前应该将荧光探针体系置于室温完全融化后混合均匀，再瞬时离心使液体全部沉于管底，根据检测样品数量，用移液器吸取20μL/份，分装至PCR8联反应管中，通过传递窗将PCR8联反应管转移至样品制备区。5.3.2加样（样品制备区）在已装有荧光探针引物体系的PCR8联反应管中每管中加入制备好的核酸样本，使每管总体积达到25μL，盖上管盖，标记好每个反应管对应的样品编号，通过传递窗转移至核酸扩增区。5.3.3荧光PCR扩增（核酸扩增区）将加样后的PCR8联反应管放入荧光定量PCR仪内，编辑样品表，选定荧光报告基因为FAM，淬灭基因为None.反应程序见表1，表1荧光PCR反应程序112退火/延伸6结果判定6.1结果分析条件设定根据分析仪器读取的各项数据及扩增曲线，设定合理的阈值和基线，使仪器显示正确的结果。6.2结果成立条件a）阳性对照：Ct值≤30并出现特异性扩增曲线；3T/SNLT0028-2025b）阴性对照：无Ct值并且无特异性扩增曲线；c）以上两个条件应同时满足，否则本次实验无效。6.3结果描述及判定a）若测定样品Ct值＜36并出现特异性扩增曲线，判为牛结核病核酸检测阳性；b）若测定样品Ct值≥36并出现特异性扩增曲线，判为牛结核病核酸检测可疑。可疑样品需重新提取核酸进行重复，测定后仍在可疑区间的样品判为牛结核病核酸检测阳性；c）若测定样品无Ct值或无特异性扩增曲线，判为牛结核病核酸检测阴性；d）对于某些未呈现S型曲线，但本底较高的样品，应判为阴性。7注意事项7.1生物安全所有实验均应按照GB19489实验室生物安全通用要求的规定执行。实验操作需在生物安全二级（BSL-2）实验室进行。7.2PCR实验应严格分区操作PCR实验应严格分区操作，流程顺序为试剂配置区→样品制备区→核酸扩增区。各区