「ELISA问诊室」双抗夹心ELISA保姆级教程：从样品处理到结果读值全流程值得收藏

「ELISA问诊室」双抗夹心ELISA保姆级教程：从样品处理到结果读值全流程，值得收藏！还在为ELISA实验的繁琐步骤头疼？为标准曲线拟合不佳而焦虑？或是在抗体选择和样品处理上频频踩坑？酶联免疫吸附实验（ELISA）作为免疫学领域的"金标准"技术，凭借其皮克级（pg/mL）的超高灵敏度，早已成为基础研究、临床诊断和生物制药不可或缺的工具。在直接法、间接法、夹心法、竞争法等多种类型中，双抗夹心法以其卓越的特异性和灵敏度脱颖而出，成为科研工作者最常用的检测方案。「ELISA问诊室」将带你从零开始，完整拆解双抗夹心ELISA的实验原理、操作流程及避坑指南。无论你是初次接触的新手，还是希望优化实验细节的进阶者，这份保姆级教程都值得收藏转发。一、双抗夹心ELISA实验原理理解原理是做好实验的第一步。双抗夹心法的核心机制可以形象概括为"三明治"结构——两种抗体像面包片一样"夹"住中间的抗原。具体而言，首先将捕获抗体包被在固相载体（如96孔板）上，加入待测样品后，目标抗原被特异性"捕获"。经过洗涤去除杂质，再加入检测抗体结合抗原的另一个表位，形成"捕获抗体-抗原-检测抗体"的复合物。最后加入酶底物（如HRP-TMB体系），通过显色反应的颜色深浅实现定量分析。·捕获抗体（CaptureAntibody）：固定在孔板底部，特异性结合目标抗原。·检测抗体（DetectionAntibody）：识别并结合抗原的另一个非重叠表位。检测抗体通常与酶（如HRP或碱性磷酸酶）偶联，或者通过间接结合二抗进行检测。·显色反应：常用HRP-TMB显色体系。底物TMB在过氧化物酶HRP催化下转化成蓝色，通过酸终止反应变成黄色。终止反应后在酶标仪上测光密度（OD）值。颜色的深浅与样品中的蛋白质呈正相关，根据标准品OD值制作标准曲线并计算样品中抗原的含量。二、样品处理及冻存掌握原理后，规范的样品处理是确保数据可靠性的前提。双抗夹心法可检测样本范围十分广泛，如血液（血清、血浆）、组织匀浆或提取物、细胞培养上清、细胞裂解液、分泌物（唾液、乳汁）、排泄物（尿液、大便）等。血清：使用不含热原和内毒素的试管收集血液，1000g离心10min，将血清和红细胞迅速小心的分离。血浆：1000g离心30min，取上清。凝血剂中的EDTA、柠檬酸盐、肝素等可直接用于检测。细胞培养上清：1000g离心10min，取上清。组织匀浆：加入适量生理盐水捣碎。1000g离心10min，取上清。处理后的样品如果不立即使用，应将其分成小份，于-70℃保存，避免反复冷冻。冻存样品不能在37℃或更高温度加热解冻，应在室温（22-28℃）下进行，并确保样品均匀、充分解冻。以上部分是常用样品的快速简便处理方案，仅供参考。三、双抗夹心法操作步骤1）准备酶标板在实验开始前，应将本次实验所使用的试剂置于室温（22-28℃）平衡30分钟以上。如果缓冲液中有晶体形成，可延长室温平衡时间，期间轻轻摇晃至晶体完全溶解。Tips：试剂不能直接在37℃平衡。试剂或样品稀释时确保混匀，尽量减少气泡。如果是购买的商品化ELISA试剂盒，需确定测定的孔数。对于可拆酶标条，请根据实验需求选择合适的条数。将未使用的酶标条从板框上取下，放回铝箔袋中，重新密封好。商品化试剂盒一般已包被捕获抗体，可直接使用。在每孔中加入300μL1×洗剂液，室温静置2min。弃掉洗剂液，并在吸水纸上将板孔拍干。重复2次。Tips：浸泡洗板完成后，请立即使用酶标板，不用让其干燥。如果是自己开发双抗夹心ELISA，还需要进行捕获抗体包被操作：①

包被：用碳酸盐或磷酸盐缓冲液按比例将捕获抗体稀释到一定浓度，每孔加入100μL，37℃2h或者4℃过夜。②

洗板：弃孔内液体，甩干。每孔加300-350μL10mMPBST（含0.05%Tween-20），浸泡1-2min，在吸水纸上将板孔拍干。重复2次。③

封闭：每孔加300-350μL封闭液，封闭液为10mMPBST中添加1%BSA或5%脱脂牛奶。37℃孵育2h。④

洗板：同步骤②2）孵育样品和标准品⑤每孔中加入100μL样品或标准品，盖上或密封板子，室温下孵育2h。2倍倍比法稀释标准品：首先制备浓度最高的标准品，如取20μL浓度为50ng/mL的标准品储备液，加入980μL1×稀释缓冲液，制成1000μL1ng/mL的最高浓度标准品。然后将其进行六次2倍稀释，取6支新的试管，每管中加入500μL1×稀释缓冲液，第一个试管中加入500μL最高浓度的标准品，充分混匀后，从第一个试管中吸取500μL液体加入到第二个试管中，依次类推。空白孔中一般加入100μL1×稀释缓冲液。如果是细胞培养物上清，也可以加入100μL的培养基。Tips：标准品稀释液要现用现配。样品和标准品要在同一块酶标板上孵育，不要分开操作。⑥

洗板：弃掉液体，每孔加入300μL1×洗涤缓冲液，静置约1-2min。吸出或倾倒液体并在纸巾上拍干。重复洗板3次。Tips：为获得理想实验结果，必须彻底移除残留液体。洗涤不当可能会导致信号错误升高和重现性差。洗板完成后，请立即进行下步操作，不要让板孔干燥。3）检测抗体孵育⑦

稀释检测抗体：按照说明书或预实验，用1×稀释缓冲液将检测抗体稀释到需要的浓度。⑧

孵育：每孔加入100μL检测抗体，室温孵育1h。⑨

洗板：同步骤⑥Tips：如果采用间接双抗夹心法，还需要进行二抗孵育，操作步骤同检测抗体孵育。二抗除了用1×稀释缓冲液稀释外，也可用10mMPBST稀释。4）显色反应⑩

加底物显色：每孔加入100μL显色底物TMB（一般为显色液A和B的等量混合物），避光，室温孵育15-20min。Tips：可根据实际显色情况酌情缩短或延长显色时间，但不可超过30min。当标准品孔颜色出现明显梯度时，前4孔出现明显的蓝色梯度，后3-4孔不明显，即可终止反应。5）终止反应⑪每孔加入100μL终止液。终止液加入顺序应与底物加入顺序相同。Tips：终止液加入后酶标板孔内液体的颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化不均匀，请轻轻叩击板框，水平充分混匀。⑫提前15min打开酶标仪预热。6）吸光度读值⑬

读数：加入终止液后10分钟内，在450nm波长处读取整个板的吸光度（OD）。⑭

结果判读：a

每个标准品和样本的OD值须减去零孔的OD值b如设置复孔，则应取其平均值c以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线d

根据标准曲线，代入样品OD值计算出相应的拟合浓度，再乘以稀释倍数即为样本的测定浓度。Tips：建议进行630nm和450nm双波长检测。630nm的OD值为酶标板材质的吸收值，用450nm测定的OD值减去630nm的OD值，数据准确性更高些。注：以上步骤主要参考义翘神州人IL-6ELISA试剂盒的操作步骤，不同厂家的试剂盒操作细节可能会不同，请在开始前一定要仔细阅读产品说明书！四、双抗夹心法小结双抗夹心ELISA凭借“双高”特性（高灵敏度和高特异性），广泛用于科学研究和临床研究中。比如在抗体药研发领域，ICHQ5E指南推荐PK定量分析、杂质分析以及结合活力等测定时使用此方法。双抗夹心ELISA利用捕获抗体和检测抗体识别抗原的不同表位，降低了非特异性信号和交叉反应。灵敏度比直接法和间接法高2-5倍，可检测低至皮克级的抗原，适合低浓度靶抗原检测，常用于病毒（如HIV、流感）、生物标志物（细胞因子、肿瘤标志物等）检测。双抗夹心ELISA也存在一些局限性。仅适用于具有多个抗原表位的大分子蛋白，小分子抗原建议使用竞争法。捕获抗体和检测抗体必须识别不同表位，筛选比较困难。操作中需避免钩状效应（抗原过量导致假阴性），可通过稀释样本或优化抗体浓度解决。核心操作要点回顾：实验开始之前将所用试剂、样品平衡至室温，不可在37℃加热。酶标仪请在显色反应终止前15分钟开机预热。样品复融后如果有沉淀需要再次离心，取上清