基因工程的基本操作程序四班

基因工程的基本操作程序四班第1页基因工程基础操作程序1、目标基因获取2、基因表示载体构建3、将目标基因导入受体细胞4、目标基因检测与判定第2页当前被较广泛提取使用目标基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。基因操作基础步骤一、目标基因获取——将需要基因从供体生物

细胞内提取出来。供体生物细胞取出DNA用限制酶剪去多出个别目标基因限制酶第3页原核细胞基因结构(补充内容）非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点开启子终止子①不编码蛋白质。：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区原核细胞基因结构②调控遗传信息表示,上游有开启子，下游有终止子开启子第4页真核细胞基因结构（补充内容）编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子开启子终止子编码区上游编码区下游真核细胞基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质序列内含子：不能编码蛋白质序列：有调控作用,上游有开启子，下游有终止子非编码序列：包含非编码区和内含子第5页原核细胞真核细胞不一样点编码区是_____编码区是间隔、_____相同点都由能够编码蛋白质______和含有调控作用______区组成原核细胞与真核细胞基因结构比较连续不连续编码区非编码第6页1．以下关于基因结构认识中，正确是（）A．大豆基因中内含子是能够编码蛋白质序列B．乳酸菌与酵母菌基因结构中都存在外显子和内含子C．大肠杆菌基因与RNA聚合酶结合位点位于编码区下游D．水稻细胞基因编码区中存在非编码序列2．（多项选择）原核细胞与真核细胞基因结构共同特点是（）A．编码区都有能编码蛋白质序列B．编码区都是连续C．非编码区都能调控遗传信息表示D．非编码区都有RNA聚合酶结合位点DACD第7页一、目标基因获取(一)、目标基因主要是______________________编码蛋白质基因（二）、获取目标基因常见方法有哪些?1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成阅读教材P8-11如：与生物抗逆性相关基因、与优良品质相关基因、与生物药品和保健品相关基因、与毒物降解相关基因、与工业用酶相关基因等也能够是具调控作用因子等。第8页(1)从基因文库中获取目标基因什么是基因文库？什么是基因组文库？什么是个别基因文库？怎样从基因文库中得到咱们所需目标基因？目标基因相关信息与什么相联络？第9页概念：基因文库（genelibrary）基因组文库个别基因文库（如cDNA文库）将含有某种生物不一样基因许多DNA片段,导入受体菌群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物不一样基因,称为基因文库(genelibrary)第10页基因组文库:

基因文库中包含了一个生物全部基因,这种基因文库叫做基因组文库.个别基因文库:

基因文库中包含了一个生物一个别基因,这种基因文库叫做个别基因文库.第11页基因组文库与个别基因文库关系第12页提取某种生物全部DNA用适当限制酶酶切一定大小DNA片段将DNA片段与载体连接重组载体基因组文库导入受体菌中储存（2）.基因文库构建方法①基因组文库构建第13页思索：基因文库怎样构建？

假如用某种生物发育某个时期mRNA反转录产生各种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就组成了这种生物cDNA文库。这种方法称——反转录法第14页提取某种生物某器官或特定发育时期mRNA单链DNA双链cDNA片段重组载体与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存②

cDNA文库构建-----逆转录法：

第15页mRNARNA－DNA杂合双链单链DNA双链DNA逆转录（cDNA）DNA聚合酶第16页真核生物基因用逆转录法得到cDNA与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？思索？第17页基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库比较第18页基因组DNA文库与cDNA文库比较第19页依据：目标基因相关信息。如：依据基因核苷酸序列基因功效基因在染色体上位置基因转录产物mRNA

基因表示产物蛋白质等特征（4）从基因文库中得到目标基因方法——直接分离法(鸟枪法)第20页1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞A、染色体DNA

B、线粒体DNAC、总mRNA

D、tRNA2、目标基因可从基因文库中取得，以下相关基因文库描述正确是A、某生物全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不一样许多DNA片段，导入某个生物体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一个生物全部基因基因文库叫做基因组文库D、含有一个生物一个别基因基因文库叫cDNA文库AC第21页（2）利用PCR技术扩增目标基因PCR——聚合酶链式反应是一项生物体外复制特定DNA片段核酸合成技术。经过此技术，可获取大量目标基因。第22页PCR技术原理：前提：原料方式PCR扩增仪DNA复制一段已知目标基因核苷酸序列：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环次数）指数2n模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；TaqDNA聚合酶；离子第23页

过程变性、退火、延伸三步曲变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至55～60℃个别引物与模板单链DNA特定互补部位相配对和结合延伸：加热至70～75℃以目标基因为模板，合成互补新DNA链变性退火延伸第24页1、在遗传工程中，若有一个控制有利性状DNA分子片段为ATGTG／TACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予条件是①双链DNA分子为模板②ATGTG或TACAC模板链③四种脱氧核苷酸④四种核苷酸⑤DNA聚合酶⑥热稳定DNA聚合酶⑦引物⑧温度改变⑨恒温A．①③④⑦⑨B．①④⑥⑦⑧C．②⑤⑥⑦⑨D．①③⑥⑦⑧D2、在基因工程中，把选出目标基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸个数是A.540个 B.8100个 C.17280个 D.7560个B第25页（3）人工合成——依据已知氨基酸序列合成DNA蛋白质氨基酸序列mRNA核苷酸序列结构基因核苷酸序列推测推测目标基因化学合成第26页1、在已知序列信息情况下，获取目标基因最方便方法是A、化学合成法

B、基因组文库法C、cDNA文库法

D、聚合酶链反应2、以下获取目标基因方法中需要模板链是①从基因文库中获取目标基因②利用PCR技术扩增目标基因③反转录法④经过DNA合成仪利用化学方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④ D．②③AD第27页3、目标基因主要是指_______________结构基因。取得目标基因常见方法有三种：（1）从基因文库中获取目标基因，依据基因_________序列，基因在________上位置，基因________产物mRNA，基因_______产物蛋白质等获取目标基因。（2）利用PCR技术扩增目标基因，该技术是一项在________完成核酸合成技术，前提条件是有一段已知目标基因________序列，方便于合成_________。（3）假如基因较小且核苷酸序列已知，能够经过____________方法。编码蛋白质核苷酸染色体转录表示体外核苷酸引物人工合成第28页二、基因表示载体构建——关键（1）用一定_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。（2）用___________切断目基因，使其产生_________________。（3）将切下目标基因片段插入质粒______处，再加入适量___________，形成了一个重组

DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一个限制酶黏性末端切口DNA连接酶相同1.过程:第29页质粒目标基因限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口取得目标基因DNA连接酶表示载体同种1.过程:第30页2、基因表示载体作用a、使目标基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目标基因能表示和发挥作用思索：作为基因工程表示载体，只需含有目标基因就能够完成任务吗？为何？第31页不能够。因为目标基因在表示载体中得到表示并发挥作用，还需要有其它控制元件，如开启子、终止子和标识基因等。必须构建上述元件主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物本身基因开启子才能比较有利于基因表示；（2）经过cDNA文库取得目标基因没有开启子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目标基因是否导入受体生物中需要有筛选标识；（4）为了增强目标基因表示水平，往往还要增加一些其它调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目标基因表示产物存在于细胞什么部位，往往要加上能够标识存在部位基因（或做成目标基因与标识基因融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。第32页3.基因表示载体组成：它们有什么作用？a、目标基因b、开启子c、终止子d、标识基因位于基因首端,是mRNA结合位点位于基因末端,终止转录检测目标基因是否导入受体细胞第33页1、（多项选择）一个基因表示载体构建应包含A．目标基因B．开启子C．终止子D．标识基因ABCD2、以下关于基因表示载体叙述不正确是A．开启子是与RNA聚合酶识别和结合部位，是起始密码B．开启子和终止子都是特殊结构DNA短片段，对mRNA转录起调控作用C．标识基因是为了判别受体细胞中是否有目标基因从而便于筛选D．基因表示载体构建视受体细胞及导入方式不一样而有所差异A3、当前转基因工程能够A.打破地理隔离但不能突破生殖隔离B.打破生殖隔离但不能突破地理隔离C.完全突破地理隔离和生殖隔离D.个别突破地理隔离和生殖隔离C第34页常见受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目标基因导入受体细胞原理借鉴细菌或病毒侵染细胞路径。三、将目标基因导入受体细胞吸附、注入、合成、装配、释放第35页1、将目标基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力Ti质粒T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上转化过程:Ti质粒目标基因构建表示载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表示新性状转入农杆菌第36页（2）基因枪法

基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生动力，将包裹在金属颗粒表面表示载体DNA打入受体细胞中，使目标基因与其整合并表示方法。第37页（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目标基因），使目标基因借助花粉管通道进入受体细胞。第38页2、将目标基因导入动物细胞方法:显微注射技术操作程序:提纯含目标基因表示载体取受精卵显微注射移植到子宫受精卵发育新性状动物第39页3、将目标基因导入微生物细胞常见法：Ca2+处理常见菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表示载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA第40页1、基因工程中科学家常见细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是A．结构简单、操作方便B．繁殖速度快C．遗传物质含量少、简单D．性状稳定、变异少2、基因工程常见受体细胞有①大肠杆菌②枯草杆菌③支原体④动植物细胞A．①②③④B．①②③C．②③④D．①②④BD3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工，在基因操作基础步骤中，不进行碱基互补配正确步骤是A.人工合成基因B.目标基因与运载体结合C.将目标基因导入受体细胞D.目标基因检测和表示C第41页4.采取基因工程方法培育抗虫棉，以下导入目标基因做法正确是①将毒素蛋白质注射到棉受精卵中②将编码毒素蛋白DNA序列注射到棉受精卵中③将编码毒素蛋白DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉子房并进入受精卵中④将编码毒素蛋白DNA序列与质粒重组，导入细菌感染棉体细胞，再进行组织培养A．①②B．②③C．③④D．①④C5.以下属于基因工程中导入目标基因方法是①农杆菌转化法②基因枪法③花粉管道法④显微注射法⑤胚胎移植⑥DNA分子杂交法A．①②③④⑤⑥B．①②③④⑤C．①②③④D．①③④⑤⑥C第42页(四)目标基因检测与判定检测①导入检测：目标基因是否导入受体细胞方法——DNA分子杂交②表示检测转录检测——分子杂交翻译检测——抗原抗体杂交分子检测法判定抗虫判定抗病判定活性判定等个体水平判定第43页知识延伸——DNA分子杂交技术该方法是依据碱基互补配对标准，把互补双链DNA解开，把单股DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标识，之后同被检测DNA中同源互补序列杂交，从而检出所要查明DNA或基因。第44页返回第45页1、用β-珠蛋白DNA探针能够检测出遗传病是A．镰刀状细胞贫血症B．白血病C．坏血病D．苯丙酮尿症A2、应用基因工程技术诊疗疾病过程中必须使用基因探针才能到达检测疾病目标。这里基因探针是A．用于检测疾病医疗器械B．用放射性同位素或荧光分子等标识DNA分子C．合成β-珠蛋白DNAD．合成苯丙羟化酶DNA片段BA第46页思索与探究：2.依据农杆菌可将目标基因导入双子叶植物机理,你能分析出不能导入单子叶植物原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?①要选择适当农杆菌菌株，因为不是全部农杆菌菌株都能够侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导物质，普通为乙酰丁香酮等，目标是使农杆菌向植物组织受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌Vir区（诱导）基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。3.利用大肠杆菌能够生产出人胰岛素，联络前面相关细胞器功效知识，结合基因工程操作程序基础思绪，思索一下，若要生产人糖蛋白，能够用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，所以，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能。第47页4.β-珠蛋白是动物血红蛋白主要组成成份。当它成份异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程方法，使大肠杆菌生产出鼠β-珠蛋白，想一想，应怎样进行设计？（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因编码序列（cDNA)。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中能够适用开启子，另外加上抗四环素基因，构建成一个表示载体。（3）将表示载体导入无四环素抗性大肠杆菌中，然后在含有四环素培养基上培养大肠杆菌。假如表示载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；假如培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明