1.2.2微生物的选择培养和计数课件+-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第1章

发酵工程

面包和酸奶，或者馒头夹着腐乳，是很多人喜欢的早餐。你知道吗？这些食品的制作都离不开微生物发酵。那么，制作不同的发酵食品，需要的微生物一样吗？如何分离和培养微生物呢？

除了上述可以通过传统发酵技术生产的食品，啤酒、味精乃至胰岛素等药物的工业化生产，也利用了微生物的发酵。然而，工业化大规模生产在菌种的选育和培养、发酵条件的控制等方面比传统发酵生产要复杂得多，需要通过发酵工程来实现。那么，发酵工程的流程是怎样的？它用到的技术与传统发酵技术有什么不同？发酵工程在社会和经济中有哪些应用？第2节

微生物的培养技术及应用（第3课时）02阐明微生物选择培养的原理。进行土壤中分解尿素的细菌的分离与计数。概述培养基的配制方法和微生物纯培养的基本操作要求，进行酵母菌的纯培养。目标0103学习目标温故知新：酵母菌的纯培养酵母菌的纯培养2.接种和分离酵母菌1.制备培养基3.培养酵母菌①配制培养基（马铃薯、葡萄糖、琼脂、水）②灭菌③倒平板（在酒精灯火焰附近操作）培养基：湿热灭菌（高压蒸汽灭菌锅）培养皿：干热灭菌（干热灭菌锅）用接种环在固体培养基上用平板划线法接种平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱培养

自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。稀释涂布平板法呈现的杂菌群该怎么办呢？选择培养基应运而生。一、选择培养基1.实例：1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。寻找耐高温的DNA聚合酶水生栖热菌能在70～80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。(1)水生栖热菌能从热泉中被筛选出来的原因：(2)启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。耐寒微生物耐热微生物石油分解菌

这对在实验室中选择培养特定的微生物有什么启示？如何筛选？什么是选择培养基？一、选择培养基1.实例：寻找耐高温的DNA聚合酶

人为提供_________________的条件(包括_____、_____和____等)，同时___________________________。有利于目的菌生长抑制或阻止其他微生物的生长营养温度PH

在微生物学中，将允许

生长，同时

或

其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。特定种类的微生物抑制阻止一、选择培养基2.实验室中微生物筛选的原理：3.选择培养基的概念：类型条件分离得到的菌种改变培养条件70～80℃的高温添加某种化学物质加入青霉素高浓度食盐特殊碳、氮源石油是唯一碳源营养缺陷不加碳源不加氮源水生栖热菌酵母菌、霉菌等真菌金黄色葡萄球菌能消除石油污染的微生物自养型微生物固氮菌一、选择培养基3.选择培养基的类型：

应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。基础培养基选择培养基

怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？

如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？一、选择培养基

尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。讨论：1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出

来，培养基的配方该如何设计？2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？设计一种选择培养基,尿素作为唯一氮源。区别只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。(细菌生长的氮源)尿素NH3脲酶尿素分解菌选择培养基配方的设计思考·讨论【典例1】据培养基的配方表，回答下列问题：牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000mlKH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml培养基一培养基二1.从物理性质看，两种培养基属于哪类？依据是什么？

培养基的主要用途是什么？固体培养基的主要用途：分离、鉴定、计数。2.从用途上来讲，哪个属于选择培养基？将得到何

种细菌？可获得能分解尿素的细菌。3.两种培养基中共有哪些成分？碳源、氮源、水、无机盐培养基二的碳源为_______，氮源为_______。葡萄糖尿素都属于固体培养基。依据是都添加了凝固剂——琼脂。培养基二编号①②③④⑤成分(NH4)2SO4KH2PO4FeSO4CaCl2H2O含量0.4g4.0g0.5g0.5g100mL【典例2】据某微生物培养基的配方表回答下列问题1.此培养基按物理性质划分属于

培养基，理由是

；

按功能划分属于

培养基，因为没有碳源，只有

微生物才能

生长(利用空气中的CO2)。2.此培养基含有的微生物的营养成分包括

三类，若加入

氨基酸，则它可充当的营养成分包括

。3.若要观察微生物的菌落特征，培养基中应添加的成分是

。4.若用该培养基来分离尿素分解菌，应除去表中

成分(填表中序号)，应

加入

和

的有机物。液体选择自养型水、无机盐、氮源碳源、氮源凝固剂(琼脂)①尿素不含氮元素没有凝固剂(琼脂)仅通过选择培养基可以知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌吗如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌分离：获得能分解尿素的细菌的纯培养物计数：测定能分解尿素的细菌的数量1、稀释涂布平板法：将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的

菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。注意：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，

来源于样品稀释液中的一个活菌。稀释涂布平板法二、微生物的选择培养梯度稀释涂布平板主要操作2、稀释涂布平板法操作过程1ⅹ1071ⅹ1051ⅹ1061ⅹ1031ⅹ1021ⅹ1049mL无菌水①铲取土样，将样

品装入纸袋中。②将10g土样加入盛有90mL无菌水的

锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。

取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的

试管中，依次等比稀释。1ⅹ1090mL无菌水1mL③取0.1mL菌液，滴加

到培养基表面。④将涂布器浸在盛有

酒精的烧杯中。⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精

燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在

培养基表面。涂布时可转动培

养皿，使涂布均匀。1mL1mL1mL1mL1mL10g二、微生物的选择培养注意：各浓度分别涂布3个平板（重复实验）注意事项三注意事项四注意事项一注意事项二将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，在计算时，不要忽略；由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证注意事项：二、微生物的选择培养稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。

3、菌落培养二、微生物的选择培养待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1-2d。恒温培养箱平板划线法稀释涂布平板法纯化原理接种工具单菌落的获得用途接种效果图相同点通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落接种环涂布器从最后划线的区域挑取稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落分离纯化菌种，获得单菌落①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的。知识归纳比较稀释涂布平板法和平板划线法(1)筛选分解尿素的细菌的培养基以尿素为唯一氮源，且为液体培养基。

()(2)能分解尿素的细菌之所以能分解尿素，是因为其能产生脲酶。()(3)稀释涂布平板法能分离细菌，也能计数(

)(4)平板划线法不仅能纯化细菌，也能计数(

)(5)可利用以石油为唯一碳源的培养基筛选能分解石油的细菌（

）(6)取土壤和稀释土壤溶液时应在酒精灯火焰旁操作（）×√√×√√【基础过关】1、稀释涂布平板法2、显微镜直接计数法血细胞/细菌计数板——间接计数法——直接计数法三、微生物的数量测定稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照三、微生物的数量测定(一)稀释涂布平板法1、原理：

※样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目；当样品的稀释度足够

时，培养基表面生长的一个

，来源于

中的一个

。通过计数平板上的

数，就能推测出样品中大约含有多少

。高菌落样品稀释液活菌菌落活菌当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落原因：_________________________________________________________三、微生物的数量测定(一)稀释涂布平板法2、计数原则：(1)选择菌落数为________、适于计数的平板计数；(2)同一稀释度下，应至少对__个平板进行重复计数，然后求出_______；30-3003平均值3、缺点：统计的菌落数往往比活菌的实际数目____；少※统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示；现学现用：

某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)()A.2.34×108B.2.34×109

C.234

D.23.4C

代表某一稀释度下平板上生长菌落数的平均值；V

代表涂布平板时吸取的稀释液体积数值(mL)；M

代表稀释倍数；则每g（每ml）样品中的细菌数=____________（C÷V）×MB三、微生物的数量测定(一)稀释涂布平板法4、计算公式：1.甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、

100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿

素的细菌数目？（80+90+100）/30.1×105=9×107个巩固练习2.用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数

为106的培养基中得到以下几种统计结果，其中正确的是()A.涂布了1个平板，统计的菌落数是230B.涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238C.涂布了3个平板，统计的菌落数分别是13、234和254，取平均值167D.涂布了3个平板，统计的菌落数分别为210、240和250，取平均值233巩固练习D三、微生物的数量测定(二)显微镜直接计数法1、原理：利用特定的_____________或_______________在________下观察、计数，然后再计算__________的样品中微生物的数量；细菌计数板血细胞计数板显微镜一定体积相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子细菌等较小的细胞快速、直观2、优点：3、缺点：①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，(统计结果

)

不能区分死菌与活菌。②个体小的细菌在显微镜下难以观察。偏大血细胞计数板常用于____________________________等的计数细菌计数板可对________________进行观察和计数；相关信息4、计算公式：三、微生物的数量测定(二)显微镜直接计数法每小格平均细菌数×400×104×稀释倍数每毫升原液所含细菌数＝

25×16内容显微镜直接计数法稀释涂布平板间接计数法原理

利用特定细菌计数板或血细胞计数板，

在显微镜下计算一定容积的样品中微

生物的数量。

当样品的稀释度足够高时，培养基表面

生长的一个菌落，来源于样品稀释液中

的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，

就能推测出样品中大约含有多少活菌。计数依据细菌个数培养基上菌落数优点计数方便、操作简单计数的是活菌计算公式每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×104×稀释倍数每克样品中的菌株数:(C÷V)×MC:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数缺点不能区分死菌与活菌

当两个或多个细胞连在一起时,平板上

观察到的只是一个菌落结果比实际值偏大比实际值偏小二微生物的选择培养和计数三、微生物的数量测定1、提出问题：（1）如何从土壤中分离出能够分解尿素的细菌？（2）每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌？2、基础知识：

绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用__________________的_____培养基，可以从土壤中分离出_________的细菌。脲酶以尿素作为唯一氮源选择分解尿素CO(NH2)2+H2O脲酶2NH3+CO2组分含量KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0gH2O定容至1000mL

土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践（1）土壤取样①取样地点要求：细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长。②取样土层：细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。（2）制备培养基①选择培养基：以尿素为唯一氮源。组分含量葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g琼脂15.0g蒸馏水1000ml②牛肉膏蛋白胨培养基：

作为对照组，用来判断选择培养基是否具有选择作用。③KH2PO4和Na2HPO4的作用是：提供无机盐；调节pH。

土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践3、实验设计：①测细菌的数量时，一般选用1×104、1×105、×106倍稀释的稀释液

进行平板培养。②在第一次实验时，对于稀释的范围没有把握，可以选择一个比较宽

的稀释范围，例如，可以将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂

布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数为30～300的平板进

行计数。（3）样品的稀释

土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践3、实验设计：①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），

4为牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。②如何验证培养基中是否含有杂菌？设置2个平板作为对照：不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。

土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践（4）涂布平板3、实验设计：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。①培养条件：（细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d）②观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致菌落数目遗漏。

土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践3、实验设计：（5）微生物的培养与观察一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等）③结果：(1)将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。(2)要按照前面学习过的无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。(3)本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。(4)本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。

土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践4、操作提示：1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30-300的平板？在这一稀释度下，是否至

少有2个平板的菌落数接近？

3.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果

接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？提示：如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。

如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，

说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。提示：如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，

操作比较成功，能够进行菌落的计数。提示：如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，

就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。

土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践5、结果分析与评价：

本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。CO(NH2)2+H2O脲酶2NH3+CO2方法：在培养基中加入酚红指示剂——鉴别培养基呈碱性，遇酚红指示剂呈红

色。①液体培养基可以直接看液体的变色情况；②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带。

土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践6、进一步探究：项目选择培养基鉴别培养基原理加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应用途培养、分离出目标微生物鉴别目标微生物举例培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈深紫色，并有金属光泽)图示尿素分解菌大肠杆菌拓展延伸比较选择培养基与鉴别培养基课堂小结微生物的数量测定选择培养基的作用微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法微生物的选择培养和计数选择培养基微生物的选择培养科学实例筛选原则选择培养基的概念及举例稀释涂布平板法的操作过程间接计数法—稀释涂布平板法直接计数—计数板计数法土壤中分解尿素的细菌的分离与计数培养基的制备实验设计（1）土壤取样（2）样品的稀释（3）稀释涂布平板法接种（4）微生物的培养与观察实验设计练习与应用1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中

筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。（1）这种培养基是一种选择培养基。（）（2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（）（3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油

降解菌（）√√√一、概念检测

2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的

菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是()

A.菌落中的细菌数目是固定的

B.平板上的一个菌落就是一个细菌

C.通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同

D.平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌一、概念检测D1.反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种