江苏高三生物一轮复习：基因工程的基本工具与操作程序（练习）

第57讲基因工程的基本工具与操作程序

一、单项选择题

1.下列有关重组DNA技术的基本工具的叙述，正确的是（B）

A.限制酶能够识别RNA分子的特定核甘酸序列

B.携带外源DNA片段的质粒可在受体细胞中进行复制

C.DNA连接能不能连接双链DNA片段的平末端

D.DNA连接酶能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键

【解析】限制的能够识别双链DNA分子的特定核甘酸序列，并在特定的碱基之间切开磷酸二酯键，A

错误；携带外源DNA片段的质粒可在受体细胞中进行复制，质粒可以作为目的基因的载体，B正确；E.coli

DNA连接酶和T4DNA连接酶都能连接双链DNA片段的平末端,C错误:DNA连接酶能够连接双链DNA

片段，形成磷酸二酯键，氢键自动生成，D错误。

2.（2025•扬州期初）目前研究混杂DNA群体中的特异DNA序列，一般基于两种不同的方法，即DNA

克隆和DNA分子杂交，如图所示。下列有关叙述错误的是（B）

1M一”…曲1F（导入细胞内进行DNA克降卜①

特异性勺增,----

混杂体外讲行［）NA♦降--②

DNA群体---------------------

--------------H特异性检测HDNA分子杂交|...........③

A.方法①需要限制酶和DNA连接酶

B.方法②需要解旋酶和DNA聚合酶

C.方法③需要对探针进行特殊标记

D.方法①②③都遵循碱基互补配对原则

【解析】方法①中需耍构建甚因表达载体将目的基因导入受体细胞，耍用到限制酶和DNA连接酶，A

正随；方法②体外扩增技术中通过高温使DNA解旋，不需要解旋酶，B错误；方法③需要对探针进行特

殊标记，这样才能特异性检测，C正确。

3.（2024・湖南卷）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原

因并提出解决方法。下列叙述错误的是（B）

A.限制的失活，更换新的限制能

B.酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等

C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA

D.酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶

【解析】限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制前，A正确；酶切条件不合适通

常会使切割效果下降，此时应有部分DNA被酶切，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，

进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，

会导致对DNA甲基化敏感的限制的无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。

4.（2023・新课标卷）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和髀4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两

端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点

如利所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(C)

I

5'-GAATTC-3'5'-GGATCC-3'

3'-CnAAG-5,3'-CCIAGG-5'

t

fifjl做

II

5-CCCGGG-35-AGATCT-3'

3-GGGCCC-53'-TCTAGA-5,

ff

醒3的4

A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.e"DNA连接酣连接

B.质粒用酶3切割、目的基因用前1切割，用T4DNA连接前连接

C.质粒和FI的基因都用酶1和酶2切割，HJT4DNA连接酶连接

D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用Eco"DNA逐接酶连接

【解析】酷3切割后得到的是平末端，DNA连接海连接平末端效率低，应该用T4DNA连接酶

连接；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接；质粒和

目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的

连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒

上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选。

5.如表为四种限制酶所识别的核甘酸序列及相应的切割位置(筋头所指)，下列叙述正确的是(C)

限制酶种类序列及切点

5Z-(i\ATTC-3，

①及oRI

3'-CTTAN；-5'

5CdbATCC-3*

②I

S^CCTAGG-S*

5—&ATCT-3，

③Bg/II

3CTCTACy\-5，

5'-GdbGCCGC-3'

@NotI

3-CGCCGGCG-5'

1

A.①②③④可催化磷酸二酯键和氢键断裂，形成纵性末端

B.①切出的DNA片段，只有用E.co〃DNA连接酶才能连接起来

C.②③切出的末端连接后形成的片段，不能再被②或③识别切割

D.构建基因表达载体时，用②③进行双酹切，可防止目的基因与载体的反向连接

【解析】@©③④均为限制酶，它们可催化磷酸二酯键断裂，但不能催化氢键断裂，且均形成黏性末

端，A错误；①切出的DNA片段带有黏性末端，用E.coliDNA连接晦和T4DNA连接酶均能连接起来，

B错误；②③切出的黏性末端相同，用DNA连接酶连接后形成的片段的碱基序列为

3，—GGATCT_31

3,_CCTAGA-5’，不能再被②或③识别切割，C正确；构建基因表达载体时，用②③进行双酶切,

不能防止目的基因与载体的反向连接，因为这两种限制酶切出的黏性末端是相同的，D错误。

6.重组质粒可以携带目的基因进入受体细胞，则下列不一定可以说明目的基因成功导入受体细胞的是

（B）

A.大肠杆菌中检测到人胰岛素基因的mRNA

B.水稻细胞中检测到氨苇青霉素抗性基因

C.棉花细胞中检测到抗棉铃虫基因

D.鲤鱼细胞中检测到人的生长激素

【解析】氨节青霉素抗性基因属于标记基因，水稻细胞中检测到氨节青霉素抗性基因不能说明目的基

因成功导入受体细胞，也可能导入了空载体。

7.（2025•如皋期初）科研人员将四种酶的基因（反CAT、OsGLOl、EcGCL.7SR）与叶绿体转运肽（引导合

成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图），在水稻叶绿体内构建了一

条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列说法正确的是（C）

-溜^丁HOsG/O级”-嘉雅.

---------------------------------T-DNA----------------------------------------

注：o扇动了-D终止于勿叶绿体转运肽基因

A.限制酶需要识别特定的序列，具有专一性，DNA连接酶不具有专一性

B.含卡那霉素的培养基上不能存活的植物受体细胞未成功导入四种目的基因

C.OsGLOT、EcCAT基因转录时以DNA的不同单链为模板

D.利用PCR等技术检测OsGLO\基因是否转录时，需要的酶是TaqDNA聚合酌

【解析】限制酶需要识别特定的序列，具有专一性，DNA连接酶具有专一性，但对碱基序列无专一

性，A错误；卡那霉素抗性基因不在T-DNA上，不能进入植物细胞，成功导入四种目的基因的植物受体

细胞在含潮霉素的培养基上能够存活，导入或者未导入目的基因的植物细胞在含「那霉素的培养基上都不

能存活，B错误；利用PCR等技术检测OsGLOl基因是否转录时，需要逆转录酶和左夕DNA聚合酶，D

错误。

8.如图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①@③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙

述正确的是（D）

①链humIIminitinIIitIIminIIififIIIIif

L5V^33,④5,R

A.②链从L到R的方向为3'f5',①@链均可作为子缝合成的模板

B.PCR过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制

C.以1个DNA为模板经3次循环需消耗8个引物③

D.物质③的5'端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得含该序列的双链产物

【解析】根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从L到R的方向为5'-3',图中①

②链均可作为子链合成的模板，A错误；PCR过程需要通过高温处理使双链中氢键断裂成为单链，而后通

过降温使子链和引物之间形成双链结构，再调节温度使子链沿着引物的3'端延伸，B错误；以I个DNA

为模板经3次循环产生的DNA分子数目为23=8,则需消耗引物③的数目为7个，C错误。9.在基因工

程中，常采用花粉管通道法和土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。如图为花粉管通道法的一般原

理示意图。相关叙述正确的是(C)

花粉落到滴管硼外源DNA联赛卵㈱要

柱头上刺外源DNA沿花粉管6又苗卵机整口

激花粉管溶液涂抹通道进入

萌发并生雌性柱头胚囊

长至子房

A.外源DNA进入胚囊最终获得的种子均含有目的基因

B.植物生K各个时期均可通过花粉管通道导入外源DNA

C.花粉管通道法最大的优点是无需植物组织培养，技术简单

D.含外源DNA的种子发育成植株后均具有相应性状

【解析】外源DNA进入胚囊，不一定能整合到染色体上，故最终获得的种子不一定含有目的基因，A

错误；图示花粉管通道法应在雌荒成熟时进行操作，B错误；花粉管通道法可以直接实现转基因植物的自

然生成，无需经过植物组织培养这一过程，C正确；含外源DNA的种子发育成的植株不一定具有相应性

状，还需进行个体生物学水平等的检测，D错误。

二、多项选择题

10.(2024・海安中学)反向PCR是一种通过已知序列设计反向引物对未知序列(图中L、R)法行扩增的技

术，其过程如下图所示。相关叙述正确的有(AD)

已知序列

R

=,_Q_

y■*T5碑切

化并

环

人

根

福切位点丽切位点加

已

知

据②

列

合

序

的

引

成

物

A.过程①可用同一种限制酎对未知序列两端进行切割

B.过程③和①获得的DNA片段长度相同，序列不同

C.过程②需使用DNA连接酶，形成氢链和磷酸二酯键

D.该技术可检测T-DNA整合到植物细胞染色体DNA上的位置

【解析】反向PCR的FI的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA,即这一反应体系不是在一对引物之间

而是在引物外侧合成DNA。过程③为PCR扩增，过程③和①获得的DNA片段长度不同，B错误；DNA

连接酶只作用于磷酸二酯键，C错误。

11.（2024.湖南卷）最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核廿三磷

酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP）,子链延伸时，双脱氧核甘三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加

入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP,延伸终止：若配对的为脱氧腺甘三磷酸（dATP）,继续延伸；

PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。卜.列叙述

正确的是（AC）

♦ddATP»dd（IP*dd（iTPtddTIP+ddATAP4ddeCTP+ddGTP+dd1TTP

-电

-泳

-二

方

一

-向

二-

者

对

照

S-

A.上述PCR反应体系中只加入i种引物

B.电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢

C.5,一CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列

D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G

【解析】利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA,故只需加入一种引

物，A正确。电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，B错谡。依据题中双脱氧测序法的原理，可以确

定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'

终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定

DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上一下，即M应的DNA片段为长短，则对应的DNA

测序结果为3'-5',如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段

5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3',患者的测序结果为5'

-CTACCTGTGAT-3/,C正确。对比可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T,D错误。

三、非选择题

12.（2024・重庆卷节选）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究

人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品

种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。

①表达载体

限制醉识别位点

②启动子D+基因S

5rC.......TAGAATTCCA.......3'

3'-ATCTTAAGGT.......5'

③四种限制酶识别序列及切割位点

HindIII：SpeI：EcoRI：XbaI：

5'JAGCTT3'54TAGT3,5dAA1TC3,5，TI?TAGA3，

3TTCGAA5r3'TGATCA5'3'CTTAAG5'3'AGATCT5'

tftf

注：箭头表示酶的切割位置,

（1）基因S启动子的基本组成单位是脱氧核糖核昔酸（脱核核核酸）。

（2）通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ中。

根据题图所示信息（不考虑未标明序列）判断，构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用

的限制酶是反述1。此外，不宜同时选用酶SpeI和X5。I,原因是酶切后形成的片段黏性末端相同，易

自我环化；不能保证目标片段与裁体定向连接。

（3）为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酷对重组表达载体酶切后进行电泳。

电冰时，对照样品除指示分子大个的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段。

（4）用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ—1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T

+基因S”序列成功导入YZ,所得再生植株YZ—2的种子也变大，但小于YZ—1。综合分析，大豆品种

DN较TL种子大的原因是品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大。

【解析】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其

基本组成单位是四种脱氧核糖核昔酸。（2）根据图示信息可知，“启动子D+基因S”的DNA序列上存在

EcoRI的识别序列，若使用限制髀EcoRI,会使目的基因序列被破坏。根据图中限制的的识别序列可知，

酶SpeI和XbaI切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载

体时容易出现自我环化，也无法保证目的基因片段与载体片段定向连接，影响目的基因在受体细胞中的表

达,（3）DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酹对重组表达载体酹切，晦切后的产物不仅有“启

动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物

外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段。（4）根据题目信息可知，再生植株YZ—1

导人的目的基因为取自品种DN的“启动子D+基因S”序列，再生植株YZ—2导入的目的基因为取自品

种TL的“启动子T+基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测，品种DN的基

因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T,启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。

13.（2025.南通如东期初）铝毒是酸性土壤中限制作物生长的主要因素之%某科研团队研究发现，铝

胁迫可诱导铝耐受型大豆根尖SGF14〃基因（简称S基因）的表达。为了验讦SGF14a基因在植物应答铝胁迫

中的作用，研究人员构建含SGFI4a基因的表达载体，将其转亿到烟草细胞，进而获得转基因烟草，并对

转基因烟草进行铝耐受性的研究，具体操作流程如图1所示。请回答下列问题:

图1

(1)提取铝耐受型大豆根总RNA,在逆转录酶的催化下合成cDNA,最终获得S基因。根据S基因的

核甘酸序列设计相应的引物进行PCR扩增，两条引物设计时常加入不同的限制性内切核酸酶切割位点，主

要目的是使S基因能定向插入表达载体，防止反向连接和自身环化。已知图中大豆S基因的A位点和B

位点分别是起始密码子和终止密玛子对应的基因位置，选用的引物组合应为引物1和引物4。

(2)PCR扩增的产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，出现该现象的原因可能

是包(2分)。

A.引物特异性不高

B.热变性时间过长

C.延伸时间过长

D.复性温度过低

(3)将农杆菌转化后的烟草细胞诱导形成的愈伤组织先放在含玉那霉素(填抗生素)的生芽培养基中，待

生芽后，将芽移到生根培养基中培养，以获得烟草植株，生芽培养基和生根培养基中相关植物激素含量的

区别是生芽培养基中细胞分裂素与生长素比值较高。

(4)为了探究转基因烟草对铝协迫的耐受性，用50pmo卜175103处理含有SGFi4a基因的两个转基因

烟草株系⑶和S2)和野生型烟草(WT)的无菌苗的根，24h后分析烟草根相对生长量，结果显示转基因烟

草根的相对生长量比野生型烟草的高，请结合图2分析，其原的可能是烟草细胞中S基因的表达能增加可

溶性蛋白含量，增强烟草对铝胁迫的耐C受性(2分)。

•

岂

矗

代

二

期

邙

笑

一！！

二

辿

百

尊

芟

图2

（5）为确定转S基因的烟草植株的抗铝毒能力较野生型烟草植株是否增强，实验小组设计实验进行个体

生物学水平的鉴定，将等量的转S基因的烟草植株和野基型的烟草植株（2分）栽培到酸性土壤中,其他条

件均适宜，培养适宜时间后，观察植株的生长情况。

【解析】（1）提取铝耐受型大豆根总RNA,在逆转录酶的催化下合成cDNA,最终获得S基因。根据S

基因的核甘酸序列设计相应的引物进行PCR扩增,两条引物设计时常加入不同的限制性内切核酸酶切割位

点，主要目的是使S基因能定向插入表达载体，防止反向连接和自身环化。已知图中大豆S基因的A位点

和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置，PCR扩增时要扩增A位点和B位点之间的片

段，DNA聚合酶从引物的3'端开始沿着模板链合成新的DNA链，因此选用的引物组合应为引物1和引

物4。（2）PCR中产生非特异性产物的原因可能是引物特异性不高、复性温度过低。（3）将农杆菌转化后的烟

草细胞诱导形成的愈伤组织先放在含代那霉素的生芽培养基中，待生芽后，将芽移到生根培养基中培养，

以获得烟草植株。生芽培养基和生根培养基中相关植物激素含量的区别是生芽培养基中细胞分裂素与生长

素比值较高。（4）转基因烟草根的相对生长量比野生型烟草的高，原因可能是烟草细胞中S基因的表达能增

加可溶性蛋白含量，增强烟草对铝胁迫的耐受性。（5）个体生物学水平鉴定转S基因的烟草植株的抗铝毒能

力，可以将等量的转S基因的烟草植株和野生型的烟草植株栽培到酸性土壤中，其他条件均适宜，培养适

宜时间后，观察植株的生长情况，

14.（2025・海安期初”1日1是一种蛋白激酶，高脂饮食会持续激活Ms/1基因导致心肌损伤。为探究上述

机制，科研人员利用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠的Mvl基因，过程如图1所示，请回答下列问题：

图1

（1）科研人员分别设计sgR/VA基因的正向序列与反向序列，使二者退火形成sgRNA基因，其中sgRNA\

基因正向序列为5，-ACCGCACCGGCC—3'.其设计依据有载体上•端的黏性末端和基因的

部分序列（2分）,sgRMl］基因反向序列为5'AAACGGCC……GGTG3'。

（2）与sgRNA基因相比，sgRNA特有的化学成分有核糖和尿喀咤。应将sgRNA基因序列插入载体启动

子和终止子之间,有利于其表达,

（3）过程①需要DNA