DB51-T 2906-2022 猪盖塔病毒分离与鉴定技术规范

CCSB41DB51Technicalspecificationforisolationandidentificationofswinegaetavirus四川省市场监督管理局发布IDB51/T2906—2022前言 12规范性引用文件 13术语和定义 14缩略语 15试剂与设备 15.1主要试剂 15.2主要仪器设备 26样品的采集、保存与运输 26.1猪只临床发病特征 26.2临床样品的采集 26.3保存与运输 27病毒的细胞分离培养 27.1生物安全措施 27.2样品的处理 27.3单层细胞制备 27.4接种细胞 27.5病毒收获 38病毒核酸RT-PCR鉴定 38.1核酸提取和反转录 38.2RT-PCR扩增 39结果判定 49.1RT-PCR 49.2病毒分离鉴定 4附录A（规范性）试剂配制 5附录B（资料性）猪源盖塔病毒CAP基因扩增序列 6DB51/T2906—2022本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。本文件主要起草单位：四川省动物疫病预防控制中心、四川农业大学。本文件主要起草人：陈斌、朱玲、钟攀、陈弟诗、周明忠、徐志文、邓飞、邵靓、李丽、周莉媛、张睿、谢嘉宾、王英、文豪、徐凯、黄先奇、陈亮、张国华、李莎莎、吉色曲伍、孙贤刚、江朝源。本文件首次发布。DB51/T2906—20221猪盖塔病毒分离与鉴定技术规范本文件规定了猪源盖塔病毒分离与鉴定方法。本文件适用于猪及其产品中盖塔病毒病原分离和鉴定、实验室诊断、监测和流行病学调查。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。BHK-21：乳仓鼠肾源细胞CPE：细胞病变DMEM：细胞营养液DNAmarker：DNA相对分子质量标记FBS：胎牛血清GETV：盖塔病毒HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸PBS：磷酸缓冲液RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应5试剂与设备5.1主要试剂5.1.1所用生化试剂均为分析纯。5.1.2实验用水应符合GB/T6682一级水要求或采用超纯水，并经高温灭菌。5.1.3BHK-21、DMEM培养基、FBS、HEPES缓冲液(1mol/L储存液)、0.01mol/LpH7.0~7.4PBS(参见附录A)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR反应混合液（2×)。DB51/T2906—202225.2主要仪器设备微量可调移液器、二氧化碳恒温箱、组织破碎仪、高速离心机、PCR仪、稳压稳流电泳仪和水平电泳槽、凝胶成像仪、倒置生物显微镜。6样品的采集、保存与运输6.1猪只临床发病特征新生仔猪出现腹泻、厌食、皮肤红变、舌颤、肢体不协调，10日龄以上小猪出现精神颓废、发热、食欲减退、日增重显著下降和妊娠母猪出现繁殖障碍综合征等临床症状时，均可认为疑似猪盖塔病毒感染。6.2临床样品的采集采取疑似猪盖塔病毒感染的淋巴结、胎盘、羊水、死胎、肺、肝、肾、小脑等靶组织约2g~5g或血液样品1mL~2mL，组织装入无菌自封样品袋或离心管，血液装入抗凝血管中待检。6.3保存与运输采集的样品应按照NY/T541（所有部分）要求包装和运输，尽快运送到实验室。样品在2℃~8℃条件下保存不超过24h；若超过24h，放置低于-20℃冰箱，不宜反复冻融。7病毒的细胞分离培养7.1生物安全措施GETV分离鉴定时，应在高等级生物安全实验室操作，按照GB19489（所有部分）的规定执行。7.2样品的处理7.2.1组织样品取0.5g~1g待检组织样品，加入1mL~1.5mLPBS，用组织破碎仪充分破碎，用含青、链霉素的DMEM作3:1（V/W）稀释。反复冻融3次后，4℃3000r/min离心10min，取上清液，以0.22μm无菌滤膜过滤除菌后，转入1.5mL离心管中，-70℃保存备用。7.2.2血液样品用含青、链霉素的DMEM作3:1（V/W）稀释。反复冻融3次后，3000r/min离心10min，取上清液，以0.22μm无菌滤膜过滤除菌后，转入1.5mL离心管中，-70℃保存备用。7.3单层细胞制备按常规法将BHK-21细胞分装在25cm2细胞培养瓶中，每瓶分装含8%FBS的DMEM培养基5mL，细胞浓度应为2×105个/mL~3×105个/mL，培养48h。7.4接种细胞DB51/T2906—20223取制备后的组织样品或血液样品上清液0.2mL接种到生长状况良好的单层BHK-21细胞上（5mL工作体积）。每份样品接种2瓶~4瓶细胞，另设细胞对照2瓶~4瓶。37。C吸附1h，弃上清，加入2ml含2%FBS的DMEM培养基，37℃、5%CO2条件下培养48h。7.5病毒收获每天观察记录CPE，通常在接种12h~48h内可出现CPE，感染BHK-21细胞后约12h，细胞出现空洞；24h后细胞明显变圆，部分开始脱落；36h后大量脱离，贴壁细胞大部分变圆。对照细胞单层应完好，细胞形态基本正常或稍有衰老。若出现CPE，将接毒细胞反复冻融三次，4℃3000r/min离心10min，收获病毒上清液，置-70℃保存，进行病毒核酸鉴定。若接种细胞第1代72h后未出现CPE，按上述收毒方法收获细胞/病毒液再接种生长良好的单层细胞进行盲传，即1mL第一代细胞/病毒液加4mL细胞维持液，37℃培养12h~48h。盲传3代，再进行鉴定。8病毒核酸RT-PCR鉴定8.1核酸提取和反转录采用RNA提取试剂盒提取处理后的临床样品或收集到的细胞/病毒液核酸，或用自动化核酸提取仪提取，并使用反转录试剂盒将提取核酸反转录成cDNA，于-20℃保存备用。8.2RT-PCR扩增引物针对GETVCAP基因保守区域。上游引物（10μmol/L）：5,-ACCGAAGAAGCCGAAGAA-3,；下游引物（10μmol/L）：5,-GCACTCRAGGTCATACTTG-3,，扩增产物大小为316bp。8.2.2反应体系反应体系见表1，反应体系可根据表中各组分比例适当调整。表1RT-PCR反应体系5138.2.3反应程序反应程序见表2。表2RT-PCR反应程序11DB51/T2906—202248.2.4琼脂糖凝胶电泳成像取适量扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像仪中观察结果。9结果判定9.1RT-PCR示例1：阳性对照出现大小为316bp的特异性扩增条带，阴性对照无条带，说明对照成立。若样品电泳结果出现与阳性对照大小一致的特异性扩增条带，则判定为GETV核酸阳性；若样品电泳结果未出现特异性扩增条带，则判定为GETV核酸阴性。9.2病毒分离鉴定9.2.1对核酸阳性扩增产物进行测序，其结果与附录B.1序列比对，进行确认。9.2.2细胞发生CPE、GETVRT-PCR结果为阳性，且测序比对结果正确，则判定为GETV分离鉴定阳性。9.2.3若盲传3代后，细胞并未发生CPE，但核酸鉴定结果为阳性，则继续盲传至5代后，再进行核酸检测，若核酸鉴定结果仍为阳性，且测序比对结果正确，则判定为GETV分离阳性；若核酸鉴定结果为阴性，则判定为GETV分离鉴定阴性。9.2.4若盲传3代后，细胞并未发生CPE，核酸鉴定结果为阴性，则判定为GETV分离鉴定阴性。DB51/T2906—20225试剂配制A.10.01mol/LpH7.0-7.4PBSNaClNa2HPO4.12H2ONaOH或者HCl调pH值7.0至7.4，灭菌双蒸水定容至1000mL,121℃、15min高压锅灭菌冷却，置常温或4℃备用。A.2电泳缓冲液TAE（50倍）待上述混合物完全溶解后，加蒸馏水至1000mL，置4℃冰箱中备用，如配制1%的琼脂糖凝胶和用作电泳缓冲液，则用蒸馏水稀释50倍，成TAE电泳缓冲液。A.31.0%琼脂糖凝胶板制备微波炉充分溶解后，加入溴化乙锭，倒入凝胶板中，在距离底板0.5mm的位置上放置梳子，凝胶的厚度为4mm，待凝胶完全凝固后，小心移去梳子，将凝胶板放入电泳槽中，电泳缓冲液没过胶面。DB51/T2906—20226猪源盖塔病毒CAP基因扩增序列B.1猪源盖塔病毒CAP基因扩增序列ACCGAAGAAGCCGAAGAAAAAGCCGCAAAAAGCGAAGGCTAAGAAAAACGAACAGCAAAAGAAGAACGAGAACAAGAAACCACCACCTAAGCAGAAGAACCCGGCTAA