2026《金版教程》高考复习方案生物经典多选版-第十单元 小单元3 微专题13 PCR技术与电泳相关问题、基因编辑技术

1．PCR技术及其应用(1)PCR技术与病毒检测某些病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部分序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶分解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR检测这些病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙。(2)基因定点突变与基因改造重叠延伸PCR技术是一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。2．基因编辑技术及其应用CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(SgRNA)引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。CRISPR复合体中的SgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是可将目的基因定点插入所需位点，避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。[例1]临床上常采用RT－PCR技术(以mRNA为模板逆转录为cDNA，再进行PCR扩增)对受试者的咽拭子取样后进行某病毒核酸检测。以下是某医院发热门诊医生采用该项技术对受试者进行该病毒核酸检测的相关操作步骤：①从受试者组织样本中提取RNA；②分析PCR扩增结果；③利用PCR扩增cDNA片段；④采集受试者组织样本；⑤用RNA逆转录得到cDNA。下列说法错误的是()A．RT－PCR技术的正确操作顺序应是④①⑤③②B．RT－PCR操作过程中，所需的酶有逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶C．RT－PCR的产物经过BamHⅠ、EcoRⅠ双限制酶处理以后，再与经过同样双酶处理的小双节病毒(PBV)载体连接，该操作属于基因工程操作步骤中的构建基因表达载体D．利用RT－PCR技术获取的目的基因不能在物种间进行交流答案：D解析：RT－PCR技术正确的操作顺序应该是：④采集受试者组织样本→①从受试者组织样本中提取RNA→⑤用RNA逆转录得到cDNA→③利用PCR扩增cDNA片段→②分析PCR扩增结果，A正确；RT－PCR操作过程中，用RNA逆转录得到cDNA需要使用逆转录酶，利用PCR扩增cDNA片段需要耐高温的DNA聚合酶，B正确；RT－PCR的产物(目的基因)经过BamHⅠ、EcoRⅠ双限制酶处理以后，再与经过同样双酶处理的小双节病毒(PBV)载体连接，即将目的基因与载体相连，故该操作属于基因工程操作步骤中的构建基因表达载体，C正确；生物界共用一套遗传密码，是基因工程所依据的原理之一，而RT－PCR技术获取的目的基因通常无内含子等非编码序列，利于基因在物种间交流，D错误。[例2]巢式PCR是指先后用外内引物扩增目的基因的方法。其原理为：先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物(F1，R1)进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物(F2，R2)扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是()A．两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链核酸片段B．第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定C．由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性D．如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物答案：D解析：两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链核酸片段，以便与模板互补配对，A正确；第二轮PCR使内侧引物以第一轮PCR产物为模板进行再次扩增，第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定，B正确；由于和两套引物同时都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性，将需要的目的基因扩增出来，C正确；如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度要明显高于内引物，使外引物先进行反应，D错误。[例3]不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列叙述错误的是()A．限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计B．据图可知，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列相同C．上述过程中子链从限制性引物的5′端向3′端延伸，从非限制性引物的3′端向5′端延伸D．该不对称PCR过程中需要(26－1)a个限制性引物答案：C解析：PCR扩增时需要已知目的基因两侧的碱基序列来设计引物，因此限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计，A正确；非限制性引物是与乙链结合，所以最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致，B正确；扩增时耐高温DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸连接至引物的3′端，C错误；PCR扩增时引物是新子链的一部分，假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后产生26×a个DNA分子，其中有a个不含限制性引物，因此该不对称PCR过程中需要(26－1)a个限制性引物，D正确。[例4]2022年1月7日，马兰里医学中心成功将猪心脏移植到一名57岁的心脏病患者身上，虽然这颗心脏仅仅存活了2个月，但仍然为异种器官移植的可行性提供了可观的数据。为了降低免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9技术对移植的猪心脏进行了基因编辑。CRISPR/Cas9系统主要由向导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白两部分组成，sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割、其机制如图所示。下列说法错误的是()A．sgRNA通过与目标DNA序列互补配对引导Cas9蛋白到位B．有时sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越短，脱靶率越低C．Cas9蛋白作用于磷酸二酯键D．可以通过设计sgRNA，靶向猪心脏的某个抗原蛋白基因的碱基序列，实现基因敲除答案：B解析：由于DNA和RNA之间可进行碱基互补配对，因而sgRNA可以特异性识别目标DNA分子，进而引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割，A正确；sgRNA序列越短，DNA分子上与其互补的特定序列会越多，错误结合概率越高，脱靶率越高，B错误；Cas9蛋白作用于磷酸二酯键进而可以将目标基因剪切下来，C正确；根据CRISPR/Cas9系统的作用，可以通过设计sgRNA，靶向猪心脏的某个抗原蛋白基因的碱基序列，实现基因敲除，D正确。[例5](多选)猪瘟病毒能与猪细胞膜上的LamR受体蛋白结合，进而侵入细胞引起猪瘟。利用基因编辑技术改变LamR受体蛋白基因，使LamR受体蛋白不能与猪瘟病毒正常结合，但不影响生理机能，从而培育出抗猪瘟病毒猪。基因编辑原理是由一条人为设计的单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白到特定的DNA位点进行切割，从而完成对目的基因的编辑。基因编辑过程如图所示。下列叙述错误的是()A．培育抗猪瘟病毒猪，一般选择体细胞作为基因编辑的受体细胞，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染B．Cas9蛋白的功能是准确识别DNA特定序列并进行切割C．改造后的受体细胞经培养发育到囊胚或桑葚胚时，可将其进行冷冻保存或胚胎移植D．通过基因编辑技术改造前后的两种LamR基因是等位基因答案：AB解析：培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，改造后的受精卵开始进行胚胎发育，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染，A错误；根据基因编辑的原理和如题图所示过程，单链向导RNA是通过碱基互补配对原则准确地识别并结合到DNA的特定位点，从而引导Cas9蛋白到达准确位置进行DNA的切割，B错误；改造后的受体细胞经培养发育到囊胚或桑葚胚时，可将其取出向受体进行胚胎移植或冷冻保存，C正确；通过基因编辑技术改造后的LamR基因与改造前的基因位置相同，控制的性状不同，二者是等位基因，D正确。[例6]通过体内同源重组可以进行靶向基因敲除，原理如图1所示。同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。图2是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tetr是四环素抗性基因，sacB基因是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X－gal水解成蓝色化合物。回答下列问题：(1)据图1分析，与传统转基因技术相比，体内同源重组具有的特点是____________________________________。(2)采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系中需加入引物，引物的作用是____________________________，若目的基因扩增3代，则共用引物________个。PCR完成以后，常采用________________法来鉴定PCR的产物。(3)过程①中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加________、________限制酶的识别序列；过程⑤中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加________基因两端的同源序列。(4)过程⑦中，在含有____________的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加____________。答案：(1)无需使用限制酶和DNA连接酶(2)使DNA聚合酶能够从引物3′端连接脱氧核苷酸14琼脂糖凝胶电泳(3)EcoRⅠBamHⅠLacZ(4)四环素和X－gal蔗糖和X－gal解析：(1)体内同源重组在活细胞内完成，不需要使用限制酶和DNA连接酶，就可实现靶基因的敲除或替换，而限制酶的酶切位点有限，会限制DNA重组的实现。(2)采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系中需加入引物，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，若目的基因扩增3代，产生的子代DNA有23＝8个，DNA单链有8×2＝16个，去除两条模板链，则共用引物14个。PCR完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳法来鉴定PCR的产物。(3)选择限制酶时，不能破坏目的基因、标记基因、复制原点，所以可选择BamHⅠ和EcoRⅠ对载体进行切割，由于目的基因两端没有相应的酶切位点，则设计引物时在引物5′端分别添加BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列。过程⑤中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加上LacZ基因两端的同源序列，利用同源重组技术将LacZ基因敲除。(4)由于LacZ基因表达产物能将无色化合物X－gal水解成蓝色化合物，若培养基中出现白色菌落，则说明成功导入重组质粒，LacZ基因成功敲除，由于重组质粒上有四环素标记基因，故含有四环素的培养基可用于筛选。过程⑧通过同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，由于sacB基因是蔗糖致死基因，则添加蔗糖起到选择作用，LacZ基因表达产物能将无色化合物X－gal水解成蓝色化合物，则添加X－gal能起到筛选作用，所以在培养基中添加蔗糖和X－gal可筛选LacZ基因回补菌株。[例7]某科研小组从土壤菌株A、B中分离到同源性为93%的Bt1抗虫基因和Bt2抗虫基因的编码序列，并运用交错延伸PCR技术获得了抗虫性能强的重组Bt基因，转入烟草获得成功，过程如图所示。注：①交错延伸PCR：基因Bt1和Bt2均作为模板，所需引物相同，图中仅示其中一条链的延伸情况。②启动子Prla可在烟草叶肉细胞中特异性启动基因的转录。③图中生长素合成酶基因是通过成熟mRNA逆转录获得的cDNA片段，可使植物细胞合成生长素。↓↓(1)若用EcoRⅠ(5′—GAATTC—3′)和限制酶XmaⅠ(5′—CCCGGG—3′)双酶切多个目的基因，随机连接________(填“能”或“不能”)避免两个目的基因连接成环。(2)在培养愈伤组织的培养基中添加________可以筛选含有Bt重组基因的细胞。图中生长素合成酶基因是否能促进愈伤组织生根？作出判断并解释：________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)已知交错延伸PCR中所用引物片段均为30个核苷酸，TaqDNA聚合酶在72℃下的扩增速度为1000个碱基/min，本实验的循环扩增条件为：95℃变性30s，50℃复性15s，72℃延伸15s，共80个循环。第二轮循环后所得重组型子链长度为________个核苷酸。若将复性温度调成55℃，则无法得到扩增产物，原因是____________________________________。通过交错延伸PCR获得的重组Bt基因，同时具有Bt1和Bt2基因序列的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。答案：(1)不能(2)草甘膦不能，因为生长素合成酶基因是通过成熟mRNA逆转录获得的编码区序列，自身无启动子，而启动子Prla在愈伤组织细胞中不能启动转录(3)530引物分子无法与模板DNA结合第一轮以Bt1(Bt2)为模板合成的子链片段在第二轮复制时作为引物结合到Bt2(Bt1)的模板上继续合成子链，经多轮交错循环扩增，可以使产物同时含有两种基因的序列解析：(1)限制酶EcoRⅠ和XmaⅠ的酶切位点不同，切出的黏性末端不同，目的基因两端的黏性末端不同，能避免单个目的基因连接成环，但不能避免两个目的基因中相同的黏