异种移植用无指定病原体 医用供体猪：微生物学监测

异种移植用无指定病原体医用供体猪：微生物

学监测

1范围

本部分规定了异种移植用无指定病原体(DesignedPathogenFree,DPF)医用供体猪微生物学等

级分类、检测要求、检测程序、检测方法、检测规则、结果判定、判XX论、样本保存等。

本部分适用于异种移植用DPF医用供体猪微生物学等级监测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T14926.1实验动物沙门氏菌检验方法

GB/T14926.4实验动物皮肤病原真菌检测方法

GB/T14926.8实验动物支原体检测方法

GB/T14926.27实验动物小鼠腺病毒检验方法

GB/T14926.30实验动物兔轮状病毒检测方法

GB/T14926.46实验动物钩端螺旋体检测方法

GB/T14926.47实验动物志贺氏菌检测方法

GB/T14926.48实验动物结合分枝杆菌检测方法

GB/T14926.56实验动物狂犬病病毒检测方法

GB/T16551猪瘟诊断技术

GB/T17013包虫病诊断标准及处理原则

GB/T18090猪繁殖与呼吸综合征诊断方法

GB/T18448.1实验动物体外寄生虫检测方法

GB/T18448.2实验动物弓形虫检测方法

GB/T18448.6实验动物蠕虫检测方法

GB/T18638流行性乙型脑炎诊断技术

GB/T18641伪狂犬病诊断技术

GB/T18646动物化X氏菌病诊断技术

GB/T18647动物球虫病诊断技术

GB/T18935口蹄疫诊断技术

GB/T19200猪水泡病诊断技术

GB/T19915.1猪链球菌2型平板和试管凝集试验操作规程

GB/T19915.2猪链球菌2型分离鉴定操作规程

GB/T19915.3猪链球菌2型PCR定型检测技术

GB/T19915.7猪链球菌2型荧光PCR检测方法

GB/T2I674猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法

GB/T22333日本乙型脑炎病毒反转录聚合酶链反应试验方法

GB/T22915口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法

GB/T22917猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法

GB/T27536猪流感病毒分离与鉴定方法

GB/T2I674猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法

GB/T34757猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法

GB/T36871猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR检测方法

NY/T537猪放线杆菌胸膜肺炎诊断技术

NY/T541动物疫病实验室检验采样方法

NY/T545猪痢疾诊断技术

NY/T546猪菱缩性鼻炎诊断技术

NY/T548猪传染性胃肠炎诊断技术

NY/T550动物和动物产品沙门氏菌检测方法

NY/T564猪巴氏杆菌病诊断技术

NY/T679猪繁殖和呼吸综合征免疫陋试验方法

SN/T0420出口猪肉旋毛虫检验方法消化法

SN/T1379.1猪瘟单克隆抗体酶联免疫吸附试验

SN/T1396弓形虫病间接血凝试验

SN/T1446.1猪传染性胃肠炎阻断能联免疫吸附试验

SN/T1699猪流行性腹泻检疫技术规范

SN/T1919猪细小病毒病红细胞凝集抑制试验操作规程

SN/T2708猪圆环病毒病检疫技术规范

SN/T3499新泡子虫病检疫技术规范

SN/T4235猪戊型肝炎检疫技术规范

SN/T5124猪Delta冠状病毒检疫技术规范

DB22/T3283猪血凝性脑脊髓炎病毒检测TaqMan荧光定量PCR法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

异种移植用DPF医用供体猪medicalgradeDPFdonorpigforxenotransplantation

经人工饲养与培育，遗传背景明确或者来源清楚，12月龄体重宜不超过50kg,不携带世界卫生组

织(WorldHealthOrganization,WHO)指定供体动物应排除的潜在感染或条件致病和感染性人畜共患

疾病病原，必须利用生物安全屏障环境防止病原体感染，不得使用抗生素或疫苗，用于医用异种移植供

体、科学研究、教学、生产和质量控制鉴定以及其他科学实验的小型猪。

4微生物学等级

异种移植用DPF医用供体猪微生物学等级为医用供体无指定病原体级。

5检测要求

2

5.1临床观察

外观检查无异常。

5.2微生物检测项目

异种移植用DPF医用供体猪病原微生物检测项目见表1。

6检测程序

检测程序见图1。

图1异种移植用DPF医用供体猪检测程序

结合临床症状和实验室检查结果，需要进一步确证时，可取特定样本进行检测。

7检测方法

检测方法见表lo

表1异种移植用DPF医用供体猪病原微生物检测项目及检测方法（续）

类型序号检测项目检测方法

3猪痢疾蛇样螺旋体Serpulina-hyodysenteriaeNY/T545

4牛型分枝杆菌Mycobacteriumbovis附录A

5结核分枝杆菌MycobacteriumtuberculosisGB/T14926.48

细胞内鸟型结核分枝杆菌复合物

6附录R

Mycobacteriumavium-intracelluarecomplex

7猪肺炎支原体MycoplasmahyopneiunoniaeGB/T14926.8

细菌类

8沙门氏菌SalmonellatyphiGB/T14926.1；NY/T550

Bacterium

9志贺氏菌ShigellaGB/T14926.47

10支气管败血波氏杆菌BordeteUabmnchisepticaNY/T546

11多杀巴氏杆菌PasteurellamultocidaNY/T546：NY/T564

12猪胸膜肺炎放线杆菌ActinohacilluspleumpneumoniaeNY/T537

GB/T19915.1-3；

13猪链球菌2型Streptococcussuistype2

GB/T19915.7

14皮肤病原真菌PathogenicdermalfungiGB/T14926.4

真菌类

15新型隐球菌Cryptococcusneoformans附录c

Fungi

16荚膜组织胞浆菌Histoplasmacapsulation附录D

17体外寄生虫氏tozoaGB/T18448.1

18猪蛔虫AscarissuumGB/T18448.6

19棘球绦虫Echinococcussp.GB/T17013

20等抱球虫属IsosporaspGB/T18647

寄生虫类

21猪兰氏类圆线虫Slrongyloidesransomi附录E

Parasites

22弓形虫ToxoplasmagondiiGB/T18448.2；SN/T1396

23旋毛虫TrichinellaspiralisSN/T(M20

24新彳包子虫NeosporaSN/T3499

25布氏姜片吸虫Fasciolopsisbuski附录F

26猪腺病毒Adenovirus(porcine)GB/T14926.27

27猪脑心肌炎病毒Encephalomyocarditisvirus附录G

28猪流感病毒porcineInfluenzavirusGB/T27536

29人流感病毒HumanInfluenzaviruses附录H

病毒类30猪巨细胞病毒Porcinecytomegalovirus附录I

Viruses

31疱疹病毒Porcinegaina-herpesvirus附录J

猪繁殖与呼吸综合征病毒

32GB/T18090：NY/T679

Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus

33猪细小病毒ProcineparvovirusSN/T1919

34轮状病毒RotavirusGB/T14926.30

表1异种移植用DPF医用供体猪病原微生物检测项目及检测方法（续）

类型序号检测项目检测方法

35伪狂犬病病毒PseudorabiesvirusGB/T18641

36狂犬病病毒RabiesvirusGB/T14926.56

37口蹄疫病毒FootandmouthdiseasevirusGB/T18935：GB/T22915

38猪瘟病毒ClassicalswinefevervirusGB/T16551；SN/T1379.1

39日本乙型脑炎病毒JapanesesencephalitisvirusGB/T18638：GB/T22333

40猪圆环病毒

猪圆环病毒1型Porcinecircovirustype1GB/T21674：SN/T2708

猪圆环病毒2型Porcinecircovirustype2

41猪冠状病毒

猪传染性胃肠炎病毒GB/T36871；NY/T548；

PorcinetransmissiblegastroenteritisvirusSN/T1446.1

病毒类GB/T36871；GB/T34757：

猪流行性腹泻病由Porcineepidemicdiarrheavirus

VirusesSN/T1699

猪德尔塔冠状病毒PorcinedeltacoronavirusSN/T5124

猪急性腹泻综合征冠状病毒

附录K

Swineacutediarrheasyndromecoronavirus

猪呼吸道冠状病等PorcineRespirator),Coronavirus附录L

猪血凝性脑脊髓炎病毒

DB22/T3283

Porcinehemaggkitinatingencephalomyelitisvirus

42猪水泡病病毒SwinevesiculardiseasevirusGB/T19200：GB/T22917

猪内源性逆转录病毒C

43附录M

PorcineendogenousretrovirusC(PF.RV-C)

44猪淋巴性疱疹病毒Porcinelymphotropicherpesvirus(PLHV)附录N

45戊型肝炎病毒HepatitisEvirus(HEV)SN/T4235-2015

新型冠状病毒SevereAcuteRespiratorySyndromeCoronavirus

46附录0

2(SARS-CoV-2)

8检测规则

8.1检测频率

每6个月至少检测一次。

8.2抽样

方式

选择6月龄以上的异种移植用DPF医用供体猪用于检测，随机抽样。

数量

根据异种移植用DPF医用供体猪群体大小，抽样数量见表2。

6

表2抽样数量

群体大小抽样数量

<50头不少于3头

50-100头不少于5头

100-500头不少于25头

>500头不少于5%

注：临床应用的猪需要进行100%抽样检查。

方法

.1按病毒、细菌、真菌、寄生虫检测要求联合采样。

.2采样方法按照NY/T541以及医学采样程序进行。

8.3样本标识要求

样本要求有明显标识，写明检品名称、品系、等级、数量、编号、栏舍及检测项目等内容，安全送

达实验室。

9结果判定

9.1合格判定

按各个微生物检测项目结果判定方法判定检测结果，抗体检测项目，血清抗体阴性为合格，抗原和

核酸检测项目，未见阳性为合格。

10判XX论

所有项目的检测结果均合格，判为符合DPF等级标准。否则，判为不符合DPF等级标准。

11样本保存

11.1样本资料、样本来源、动物编号、样本种类及编号，按医学病理资料档案管理规范保存。保存时

间为I年V

11.2检测样本应一式两份，其中一份应该保存于液氮罐中，保存器具应该标志清晰，符合病理标本保

存规范。

附录A

(规范性附录)

牛分枝杆菌PCR检测方法

A1原理

以牛分枝杆菌16SrRNA基因和IS6110基因为靶序列，建立双重PCR方法。

A2样品采集

A2.1样品类型

有明显的结节状、干酪样坏死组织的猪病变组织

A2.2样品采集用无菌剪刀剪取病料组织约0.5-lg,置无菌1.5mLEP管中；加入400pL的组织消化液

和蛋白酶K(终浓度为1mg/mL)；55℃,水浴8h,其间间隔半小时颠倒EP管几次，以使病料组织与

消化液充分反应；8000rpm,离心5min,取上清液置另一无菌1.5mLEP管中；加入等体积的苯酚：氯

仿：异戊醇(25：24：1)液体，反复颠倒几次：12000rpm,离心10min,取上层液体于•无窗1.5mLEP

管中；重复抽提I次；加入等体积的异丙醇，充分混匀后，置-20℃30min；l20()0rpm,离心lOmin,

弃上清；沉淀用70%乙醇清洗，并置37℃,至乙醇挥发完全；加入30RLTE,并加入RNA酶，37℃,

放置40min；将所得液体作为模板，并置-20C保存。

A3操作步骤

A3.1引物的设计

参照MycobacteriumbovisAF2122^97[gi:31742509]基因序列设计出16SrRNA基因和IS6110基因引物。

引物序列如下：

16SrRNAPl5-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-3'

16SrRNAP2:5,-GCCCGTATCGCCCGCACGCT-3,扩增片段大小约为584bp.>

IS6110Pl:5'-GGCTTGCCGGGTTTGA-3」S6110P2:5'-

TTTGTCACCGACGCCTACGCT-3,扩增片段大小约为309bp。

A3.2PCR反应

根据引物设计时,oligo6.0软件提供的建议Tm值，PCR反应体系为：原理模板2^L(1.75pg-l.75pg),

lOxPCRbuffer2.5gL,dNTPs2pL,IS6110引物各0.5pL(5pM),16SrRNA引物各1.5pL(15pM),蒸

储水14吐,Taq酶0.5pL(2.5U);体系总体积为25比。

PCR扩增的反应条件：95℃预变性lOmin,95℃变性30s,59.5℃退火30s,72℃延伸45s,30个循

环，最后延伸7min,4"C保存。

A3.3PCR扩增产物的鉴定

0.8%的X脂糖，电压I2OV,电泳12-I5min,在凝胶成像系统中检测。

8

A4结果判定按照设定的双重PCR反应体系和扩增条件，如果出现大小309bp的1S6110基因和约584bp

的I6SrRNA基因的目的片段说明PCR结果阳性。

附录B

(规范性附录)

细胞内鸟型分枝杆菌PCR检测方法

BI以鸟型分枝杆菌特异性插入序列IS1245,设计一对特异性引物，用于检测和鉴定皮肤组织中鸟型

分枝杆菌。

B2样品采集

B2.1样品类型

猪皮肤组织

B2.2样品采集

无菌条件下取上述组织1g左右，置入1.5mL洁净EP管。

B3操作步骤

B3.1组织处理

将皮肤组织去脂、剪碎，用组织研磨器研磨后补加适量蒸储水，制成组织匀浆2mL,低速离心后

取上清液，2倍连续稀释后装于微量离心管中。

B3.2PCR扩增和检测

扩增插入序列IS1245：

弓I物1为5<GCCGCCGAAACGATCTAC-3'

引物2为5AGGTGGCGTCGAGGAAGAC-3'

5()RLPCR反应体系含lOxPCR缓冲液5pL,25mmol/LMgCI25|.iL,dNTPs200pmol/L,引物各

Ipmol/L,模板DNAIOpL,TaqDNA聚合酶lUo循环条件:94℃预变性5min,其后按94℃30s,65℃30s,

72c45s,扩增产物于1.5%X脂糖凝胶电泳，花青素染色，用紫外检测仪观察结果并摄影。

B4结果判定。

出现427bp扩增带为阳性，未见427bp扩增带为阴性。

附录c

(规范性附录)

新型隐球菌DNA实时荧光定量PCR检测

CI以新型隐球菌的ITS基因序列中一段高度保守序列为目的序列，设计出特异引物和探针，应用实

时荧光定量PCR技术进行检测，

C2样品采集

C2.1样品类型

猪肺部分泌物

C2.2样品采集

对送检的猪解剖后用棉拭子取下肺部的分泌物，用PBS洗脱棉拭子，洗下的液体经冻融二次，离

心取上清，加入双抗保存备用。

C3操作步骤

C3.1引物的设计

根据新型隐球菌的基因序列设计引物为：

FP:5,-TTACCTGTTGGACTTGGATTTGG-3,

RP:55-CATAGGCCCAGCGAAACTTATT-3,

C3.2DNA的提取

取气管分泌物上清加入SDS和蛋白随K,50℃水浴lh,每15分钟摇一次。用酚及酚氯仿抽提，

乙醉沉淀，用20ul无菌双蒸水溶解备用。在反应体系中加入5ul模板，总量为50uL。

C3.3目的基因的扩增

以50jxLPCR反应体系进行反应:lOxPCRBuffe以含15mmR/LMgCI2)5gL,dNTPmixture(1Ogmol/L)

IpL,TaqDNA聚合酶(5U/|iL)0.4RL、DNA模板2RL,上式游引物各3pL,加ddH2O至50pL,于

扩增仪扩增，循环条件：94℃Smin,94c30s、58℃Imin共40个循环。

C4结果判定

取5HLpcR产物于1.5%X脂糖(含10%GoldView)中，5V/cm电压电泳60-75min,紫外透视仪上

检测，荧光条带在124bp处即为阳性。

附录D

（规范性附录）

抗荚膜组织胞浆菌抗体ELISA检测方法

D1用中国药品生物制品检定所研制的荚膜组织胞浆菌蛋白提取物（purifiedproteinfromHistoplasma

capsulatum,P-HTPM）为抗原，建立检测猪血清中抗真菌英膜组织胞浆菌抗体的酶联免疫吸附试验。

D2样品采集

D2.1样品类型

猪血清

D2.2样品采集

无菌条件下用一次性注射器取耳静脉血3mL-5mL,置于试管中，分离血清，待检。

D3操作步骤

D3.1用1座孔的抗原包被酶标板，50/L/孔，37℃孵育2h。

D3.2弃去孔中液体，加入洗涤液（含0.05%Tween-20的0.01mol/LpH7.4PBS、PBST）,300山孔,

洗涤3次，每次3min。

D3.3扣干。

D3.4加入封闭液（含5%犊牛血清的PBST）,100pL/孔，37c封闭30min。

D3.5弃去封闭液，加入待检血清（稀释度为1:1000）,100R孔，37℃作用30“山1。

D3.6洗涤3次（方法同前）。

D3.7扣干。

D3.8加入1:10000的酶标抗体（二抗）100山孔,37c作用45min。

D3.9洗涤3次。

D3.10扣干。

D3.ll加入底物TMB显色液，IOORL/孔，室温避光显色10-l5min。

D3.12每孔加入50nL2moi/LILSOj终止反应。

D3.13测定吸光度值，按照下列公式计算P/N值：P/N值二阳性对照孔OD均值/阴性对照孔OD均值。

D4结果判定

当被检样品的A值＞0.135时，判定为阳性；当样品的A值在0.059-0.135之间时，判定为可疑；当

样品的A值＜0.059时，判定为阴性。

12

附录E

(规范性附录)

猪兰氏类圆线虫病镜检法诊断

EI消化道蠕虫粪学检查。

E2样品采集

E2.I样品类型

猪粪便

E2.2样品采集

从猪舍地面及猪直肠分别采集猪的粪样。

E3操作步骤

E3.I饱和食盐水漂浮法检查

取粪样10g溶于饱和食盐水中，用玻璃棒搅拌均匀后用40目的金属筛反复过滤，除去大的粪渣，

将滤液置于大试管中，让液面突出于试管口，静止30min后蘸取液面制压片，在40倍显微镜下检查。

E3.2尼龙箍淘洗法检查

取粪样25g置于大烧杯中，用常水溶解并用玻璃棒充分搅拌均匀后，经金属筛反复过滤，除去大的

美渣，将滤液置入260目的尼龙筛内，用清水反复淘洗，直至淘洗液澄清透明位置，吸取尼龙筛内沉积

物制压片，在10倍和40倍显微镜下检查。

E4结果判定

E4.I饱和食盐水漂浮法

经饱和食盐水飘浮法对猪的粪便进行检查，从直肠采取的粪样中查到虫卵，椭圆形，无色透明，卵

克薄，大小为(42-53)pmx(24-32)gm,内有幼虫。鉴定为兰氏类圆线虫卵。

E4.2经尼龙筛淘洗法

对猪的粪便进行检查，从地面采集的粪样中查到虫体，虫体细小，呈乳白色，毛发状，镜下透明，

食道短，呈柱状，有两个食道球，虫体大小为(3.1-4.6)mmx(0.055-0.080)mm。鉴定为兰氏类圆线

旦的杆型幼虫。

附录F

（规范性附录）

布氏姜片吸虫镜检法诊断

FI消化道蠕虫粪学检查。

F2样品采集

F2.1样品类型

猪新鲜粪便

F2.2样品采集

从猪舍地面及猪直肠分别采集猪的粪样。

F3操作步骤

F3.1直接涂片法

先取2-3滴蒸偏水（或50%的甘油水）于载玻片上，再用火柴棒取新鲜的粪便混合均匀，去除污秽

后，用低倍镜检查。

F3.2沉淀法

取5J0g的粪便于烧杯中加20mL水，用筛过滤后，装入嘲心器然后倒上清液，再进行离心，反复

数次，取沉淀渣滴于玻片上，用低倍镜检查。

F4结果判定

采用以上两种方法对猪的粪便进行检查，从地面采集的粪样中查到虫体或虫卵，虫体肥厚、背腹扁

工、前端狭窄、后端钝圆，形似鲜姜之切片；虫卵长椭圆形、淡黄色、卵壳薄均匀、前端卵盖扁小不易

看出，长宽比约为130-145Nmx85-97pm,鉴定为布氏姜片吸虫阳性。

14

附录G

（规范性附录）

猪脑心肌炎病毒间接ELISA检测

G1由于2c蛋白为猪脑心肌炎病毒的非结构蛋白，参与病毒的复制，因此在病毒复制时才会产生该蛋

白并刺激机体产生抗体，通过重组2C蛋白为包被抗原建立检测猪脑心肌炎病毒抗体间接ELISA方法。

G2样品采集

G2.1样品类型

猪血清

G2.2样品采集

无菌条件下用一次性注射器取耳静脉血3mL-5mL,置「试管中，分离血清，待检。

G3操作步骤

G3.1将重组蛋白2C用包被液（0.05mol/L＞pH9.6的碳酸盐缓冲液）稀释为适当浓度按IOOJIL/孔包被

解标板，37c孵育lh后4c过夜。

G3.2弃去孔中液体，加入洗涤液（含0.05%Tween-20的O.Qlmol/LpH7.4PBS、PBST）,300匹/孔，

洗涤3次，每次3min.

G3.3扣干。

G3.4力口入封闭液（含5%犊牛血清的PBST）,IOORL/孔，37c封闭lh。

G3.5弃去封闭液，加入待检血清（一抗），lOOpL/孔，37℃作用45min。

G3.6洗涤3次（方法同前）。

G3.7扣干。

G3.8加入适当稀糅的酶标抗体（二抗）lOOpL/孔，37℃作用45min.

G3.9洗涤3次。

G3.10扣干。

G3.ll加入底物TMB显色液，lOOpL/孔，室温避光显色1045min。

G3.12每孔加入5（）gL2mol/LH2SO4终止反应。

G3.13测定OD450nm光吸收值，按照下列公式计算P/N值：P/N值=阳性对照孔OD均值/阴性对照

孔OD均值。

G4结果判定当被检样品的OD俏＞0.27时，判定为阳性；当样品的OD值＜0.27时，判定为阴性。

附录H

(规范性附录)

人流感病毒多重PCR检测

HI根据流感病毒HA基因和M基因设计引物，进行RT-PCR方法检测。

H2样品采集

H2.1样品类型

鼻咽拭子

H2.2样品采集标本采集后，冷冻12h内运送至实验室，24h内进行流感病毒分离培养和快速检测试验。

H3操作步骤

H3.1多重PCR引物设计分别设计扩增引物扩增

HA全基因片段：

H1F-5^agcaaaagcaggggaaaata-S'

HIR-5'-aacaagggtgtttttcctca-S'

H3F-5^agcaaaagcaggggataaltc-S'

H3R-5'-ctcaaaigcaaatgligcacc-3'

BF-5'-gggacatgaacaacaaagatgc-3'

BR-5,-tgtcagctattatggagctg-3,

Hl、H3和乙型扩增产物分别431bp、210bp和390bp。

H3.2病毒RNA提取

提取病毒RNA作为RT-PCR模板，用于反转录试验或置-20℃保存备用。

H3.3病毒逆转录

用试剂盒进行病毒RNA逆转录。

、

H3.4多重PCR反应体系25卜也，各反应物浓度lOxBuffcr2.'iL、MgCl2(25mM)2RLdNTP2pL、

Taq(5U/pL)0.4gL>H对引物(lOmM)各I.25RL、逆转录生成的cDNA4pL、力口水至lj25匹。反应程

序：94"C3min,30s、51℃lmin、68℃Imin共35个循环，68℃10min.

H3.5PCR产物的鉴定

取PCR产物5gL,加入上样孔后进行1%X脂糖凝胶电泳。

H4结果判断出现431bp、210bp或390bp条带，判定为阳性。

附录I

（规范性附录）

猪巨细胞病毒FQ-PCR检测

II原理

TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，是利用Taq睡的外切核酸酶活性，切断探针，

产生荧光信号。由于探斜与模板是特异性结合，囚此从荧光佶号的强弱就可以判断模板数量。

12样品采集

12.1样品类型

病变组织

12.2样品采集

无菌条件下取上述组织1g左右，置入1.5mL洁净EP管。

13操作步骤

13.1总RNA提取1.5mL样品离心管中，加入ImLTrizol试剂，静置5min或马上-70C保存，12000rpm

离心15min,分相为三层，取上清液至新1.5mL管,加入200ul氯仿,振荡混匀30s,室温静置3・5min

分层，l2000rpm离心I5min,取上清液至新1.5mL管，中间层和红色下层4c保存，便于提取DNA和

蛋白，上清液加入约0.5mL的异丙醇（预冷），振荡混匀30s,室温下静置I5min,12000rpm离心lOmin,

弃上清，RNA沉淀管底，如沉淀不明显，则再离心数秒吸出上清，加入1mL75%乙醇（预冷），温和震

荡悬浮沉淀，8000rpm离心5min,弃上清，短暂快速离心（5s）,弃上清，室温放置2min晾干，沉淀

加入15卜iLDEPC处理水，轻弹管壁溶解，少量样品55-60℃水浴孵育10J5min,测量OD260/280值后，

样品放置-70C保存。

13.2反转录

0.2mL离心管加入1匹总RNA,1迎随机引物oligo（dt）,lOpiLDEPC处理水,混匀，瞬时离心

5s,7（TC水浴5min,迅速冰浴2min,瞬时离心，加入4匹5xBuffer,2pL0.1MDTT,2pLlOMmdNTPs,

混匀，温浴2min,加入IpL反转录酶，42c温育50min,70℃孵育lOmin灭活，-70℃冰箱保存。

13.3引物与TapMan探针的设计与合成

设计一对特异引物P1/P2和TapMan探针：

PI:5,-TGGCACTGATACTTGACAAGC-3,

P2:5,-CTCCCGTGAAGCCGTAAA-3,

TapMan探针：FAM-5'・CAGCTTGCCCTCAAGGTGACGTG-3'-TAMRA.

13.4标准曲线的建立

用含pGEMT/PCMV重组质粒的溶液作标准品，10倍稀释成1.0x101（）-1.0x100拷贝/回，共II个

稀释度，以不同浓度的重组质粒为模板进行FQ-PCR敏感性试验。以起始模板数的对数为X轴，以

FQ-PCR循环次数Ct值为Y轴作回归曲线，建立PCMV检测的标准曲线。

13.5FQ-PCR反应条件

采用5pmol/L的引物浓度和2.5pmol/L的探针浓度对质粒标准品进行检测，双温循环及60c的退火

温度为最佳的循环条件。FQ-PCR反应总体积为25pL,其中lOxExTaqBuffer2.5gL(Mg2+浓度为

2.0mmol/L),dNTPs2pLExlaq0.25gL,上下游引物各0.5ul(lOpmol/L),探针0.25pL(lOpmol/L),

模板IRL,ddlhOI8.00PL,混合均匀，置荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。反应程序为：94℃

预变性4min,94℃变性15s,60℃退火延伸40s,40个循环。荧光模式设为FAM/TAMRA双标记模式。

13.6根据所得曲线作数据分析。

13.7取部分PCR产物进行X脂糖凝胶电泳，检测产物的特异性。

14结果判定

以电泳阴性对照为标准，根据电泳结果判断是否有阳性产物。

附录J

（规范性附录）

疱疹病毒核酸检测

J1原理

选取一对猪疱疹病毒I型（PHV）将异性引物，通过减裂解法提取猪疱疹病毒DNA,后名在耐热DNA

聚合酶（Taq酶）作用下，配以SD-Buffer（内含Mg2+、Tris-HQ等）、四种核甘酸单体（dNTPs）等成

分，通过聚合酶链式反应体外扩增法对猪疱疹病毒进行体外扩增，产物经凝胶电泳，EB染色，紫外灯

观察，从而达到快速检测之目的。

J2标本采集

J2.1样本类型

血消或病毒液

J2.2样本采集

发病猪脑、淋巴结、扁桃体、肾和脾等组织标本：无菌条件下取上述组织1g左右，置入1.5mL洁

挣EP管，立即送检。血清：用一次性无菌注射器抽取受检猪耳静脉或者前腔静脉静脉血2-5mL,静置

斜放待血清析出，lOOOOrpm离心3min,可取上清立即用于测试;或吸取上部血清（约200pL）转入无

茵1.5mLEP管，保存待检。

J3操作步骤

J3.1引物设计

设计引物序列

PHV-F:5,-GGGACGCTCTGATTAAGGAAT-3,

PHV-R:5,-CTTGGTGATCAGCAGCAGCTTG-3,

J3.2DNA提取

血清或病毒液，常规市售DNA提取试剂盒提取DNA,取提取液进行PCR扩增。

J3.3PCR扩增

反应总体积为25pL,其中IOxBuffer2.5NL（Mg?+浓度为2.0mmol/L）,dNTPs2pLExTaqO.25pL,

上下游引物各0.5/L（lOpmol/L）,DNA模板IpL,ddH2O19.00gL,混合均匀,置荧光定量PCR仪上

进行自动化扩增反应。按照下列条件扩增：循环条件：95℃预变性3min,53c退火45s,72c延伸3min,

共35个循环。

J3.4电泳检测

（1）2%X脂糠凝胶配制：稀释50xTAE至IxTAE.称4gx脂糖放于500mL锥形瓶中，IxTAE200mL.

置入微波炉中加热溶解-再加入20RLEB充分混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入X脂

糖凝胶，待凝固后使用。

(2)电泳检测：直接取PCR扩增产物15回，用加样枪点样于X脂凝胶孔中，以5V/cm电压，IxTAE

中电泳，紫外灯下观察结果。

K4检测结果判定：

阴性无带出现(引物带除外)，阳性出现242bp扩增带。若被检样品出现242bp扩增带，即为猪疱

疹病毒阳性，否则为阴性。

23

附录K

(规范性附录)

猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)RT-PCR检测

K1原理

依据该病毒的保守N基因设计特异性引物，优化反应条件，建立RT-PCR检测方法。

K2样品采集

K2.1样品类型

粪便

K2.2样品采集

标本采集后，在-80C下保存，运送至实验室，进行猪急性腹泻综合征冠状病毒核酸提取。

K3.操作步骤

K3.1在样品中加入磷酸盐缓冲液(PBS)(20%w/v),冷冻并解冻三次，然后在10,000g下离心10分

钟。按照病毒核酸试剂盒说明书进行病毒核酸提取。-80C保存备用。

K3.2根据猪急性腹泻综合征冠状病毒N基因序列设计引物：F：-GGTCCCTGTGACCGAAGTTTTAG：

R：-GCGTTCTGCGATAAAGCTTAAAACTATTA<)

K3.3参照一步法RT-PCR试剂盒说明书进行RT-PCR检测,扩增条件：50℃30分钟，94c3分钟，

%℃变性3()秒，35个循环，5£℃退火30秒，72℃延伸30秒，最后72℃5分钟。

K3.4根据所得曲线作数据分析。取部分PCR产物进行X脂糖凝胶电泳，检测产物的特异性。

K4结果判定

以电泳阴性对照为标准，根据电泳结果判断是否有阳性产物。

附录L

（规范性附录）

猪呼吸道冠状病毒（PRCV）巢式PCR检测

L1原理

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR）,使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。

第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物，结合在第一次PCR产物内部，

使得第二次PCR扩增片断短于第一次犷增。巢式PCR的优点在于，如果第一次扩增产生了错误片断，

则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。

L2样品采集

L2.1样品类型

粪便或鼻拭子

L2.2样品采集/处理

粪便样本保存于-80C,鼻拭子样本进行冷冻处理后，快速转运至实验室，进行相关检冽。

L3.操作步骤

L3.1样本RNA提取：根据RNA提取试剂盒说明书对粪便或鼻拭子样本进行RNA提取。

L3.2引物的设计与合成：根据己报道的PERV核甘酸序列，引物FI：

-GGGTAAGTTGCTCATTAGAATAATGG,RI：-CTTCTTCAAAGCTAGGGACTG；巢式PCR弓I物F2：

-TTGTGGTYTTGGTYGTAATKCC,R2：-GGCTGTTTGGTAACTAATTTRCCAo

L3.3对照设计：阳性对照：菌株ISU-1（PRCV）用作；阴性对照:MEM-E或PRCV阴性粪便或鼻拭

N、°

L3.4第一次反应体系：将检测样品、阳性和阴性对照的5pLRNA、5^L10xPCR缓冲液、5pL25mM

MgCb、IpL10mMdNTPsx20URnasin.5UAMV逆转录酶、2.5UTaqDNA聚合酶和各0.5pL50Pm

的引物Fl和RI混合均匀。在42℃孵育90分钟，95c5分钟。

L3.5第一次反应条件：94℃,1分钟;60℃,1.5分钟；72℃.2.5分钟，30个循环,72℃,10分钟。

L3.6第二次反应体系:将PCR产物以1:10稀释并用作巢式PCR的模板。取1g稀稀产物与5也10xPCR

缓冲液、5pL25mMMgCk、IpL10mMdNTPs>2.5UTaqDNA聚合酶（美国威斯康星州普罗米加市

麦迪逊）和各0.5pL50Pm引物F2和R2混合。

L3.7第二次反应条件:94C,1分钟：62℃,1.5分钟；72℃,2.5分钟，30个循环，72℃,10分钟。

L3.8在用澳化乙锭染色的l.5%X脂糖凝胶上分析PCR产物。PRCV扩增产物的预测大小为193-253bp

22

K4.结果判定

以电泳阴性对照为标准，根据电泳结果判断是否有阳性产物。

附录M

(规范性附录)

猪内源性逆转录病毒C(PERV-C)PCR检测

Ml原理

依据已公布的猪内源性逆转录病毒env基因差异，分另ij设计PERV-A、PERV-B、PERV-C3种特异

性引物，优化反应条件，建立PCR检测方法。

M2样品采集

M2.1样品类型

血液样本

M2.2样品采集/处理

无菌条件卜.取上述样本2-3mL左右，置入洁净抗凝聚血管中，等量加入PBS液混匀，梯度离心分

离猪PBMC,-8()℃保存备用。

M3操作步骤

M3.1样本DNA提取和总RNA提取：去200ulPBMC悬液加入等体积细胞裂解液及20mg/mL蛋白酹

KIOul,消化，按照DNA/RNA提取试剂盒说明书进行DNA、RNA提取.

M3.2引物的设计与合成：根据已报道的PERV核甘酸序列，分别合成3对引物用于检测PERV-A、

PERV-B、PERV-C3种分型；(PERV-A：