探寻钙敏感受体基因启动子区甲基化与食管鳞癌的关联奥秘

探寻钙敏感受体基因启动子区甲基化与食管鳞癌的关联奥秘一、引言1.1研究背景1.1.1食管鳞癌概述食管鳞癌，作为食管癌中最为常见的组织学亚型，源于食管鳞状上皮黏膜细胞的恶变。在全球范围内，食管癌是发病率位居第八、癌症相关死亡率位居第六的高致死性疾病，而食管鳞癌占据了食管癌病例的90%以上，尤其在东亚和中东地区，其发病率居高不下，在中国，食管鳞癌的发病形势更是严峻，严重威胁着民众的生命健康与生活质量。早期食管鳞癌的症状往往不明显，缺乏特异性表现，导致患者确诊时大多已处于中晚期。据统计，约70%的患者在确诊时已错过最佳治疗时机，中晚期患者的5年生存率仅在5%-20%之间，预后状况极差。患者在疾病进程中，常伴有进行性吞咽困难，起初可能只是在进食干硬食物时出现哽噎感，随着病情恶化，吞咽流质食物甚至唾液也会变得困难；吞咽疼痛也是常见症状，疼痛程度随病情加重而加剧，严重影响患者的进食体验；体重减轻则是由于吞咽困难导致营养摄入不足，以及肿瘤的高代谢消耗所致，患者的身体状况会逐渐衰弱。目前，食管鳞癌的治疗手段主要包括手术、放疗、化疗以及新兴的免疫治疗等。对于早期患者，根治性手术切除或根治性放射治疗是主要的治疗方式，有一定的治愈可能。然而，一旦病情进展至中晚期，单纯的手术或放疗效果不佳，通常需要采用化疗、放疗、免疫治疗等相结合的综合治疗方案。尽管这些治疗手段在一定程度上能够缓解病情、延长患者生存期，但总体治疗效果仍不尽人意，患者的5年生存率依然较低。这主要是因为食管鳞癌的发病机制极为复杂，涉及多个基因和信号通路的异常改变，目前的治疗方法难以从根本上解决问题。因此，深入探究食管鳞癌的发病机制，寻找有效的早期诊断标志物和治疗靶点，对于改善患者的预后、提高其生存质量具有至关重要的意义，这也是当前肿瘤研究领域的重点和热点方向。1.1.2DNA甲基化与癌症关系DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰方式，在基因表达调控过程中扮演着关键角色，其异常与癌症的发生发展密切相关。在正常生理状态下，DNA甲基化主要发生在基因启动子区域的CpG岛，通过对CpG岛中胞嘧啶的甲基化修饰，影响转录因子与DNA的结合能力，从而调控基因的表达水平，确保细胞的正常分化、发育和生理功能。当DNA甲基化模式发生异常改变时，就可能引发一系列病理过程，其中最为突出的便是癌症的发生。在肿瘤形成过程中，某些关键基因的甲基化状态会出现异常变化，主要表现为肿瘤抑制基因启动子区域的高甲基化和癌基因启动子区域的低甲基化。肿瘤抑制基因通常具有抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、维持基因组稳定性等重要功能，其启动子区的高甲基化会导致基因沉默，使其无法正常发挥抑癌作用，进而使得细胞增殖失控，为肿瘤的发生发展创造条件。相反，癌基因启动子区域的低甲基化则会增强癌基因的表达活性，促进细胞的异常增殖、侵袭和转移，加速肿瘤的恶化进程。此外，DNA甲基化异常还会影响肿瘤细胞的代谢、免疫逃逸等生物学行为，进一步推动癌症的发展。研究表明，在几乎所有类型的人类肿瘤中，都能检测到肿瘤相关基因的异常甲基化现象，这充分表明DNA甲基化异常是癌症发生的一个重要警示标志。因此，深入研究DNA甲基化在癌症中的作用机制，不仅有助于揭示癌症的发病机理，还为癌症的早期诊断、预后评估和靶向治疗提供了新的思路和潜在靶点。通过检测特定基因的甲基化状态，有望实现癌症的早期精准诊断；以异常甲基化的基因为靶点，开发针对性的甲基化抑制剂等治疗药物，或许能够为癌症患者带来更有效的治疗方案，改善其预后状况。1.1.3钙敏感受体基因（CASR）介绍钙敏感受体基因（CASR）定位于染色体3q13.3-21，其编码的钙敏感受体（CaSR）属于G蛋白偶联受体超家族成员。CaSR广泛分布于人体多个组织和细胞中，如甲状旁腺、肾脏、胃肠道、骨骼等，在维持机体钙离子及其他金属离子稳态方面发挥着不可或缺的重要作用。在甲状旁腺中，CaSR能够敏锐地感知细胞外钙离子浓度的变化。当细胞外钙离子浓度升高时，CaSR被激活，通过一系列信号转导通路，抑制甲状旁腺激素（PTH）的分泌。PTH的减少会降低肾小管对钙的重吸收，促进钙从尿液中排出，从而使血钙水平下降，恢复到正常范围。反之，当细胞外钙离子浓度降低时，CaSR的活性受到抑制，PTH分泌增加，促进肾小管对钙的重吸收，减少钙的排泄，使血钙水平升高。在肾脏中，CaSR同样参与调节钙的重吸收和排泄过程，维持体内钙平衡。此外，CaSR还在胃肠道对钙的吸收、骨骼的代谢等生理过程中发挥调节作用，确保机体各个组织和器官能够获得适宜的钙离子供应，维持正常的生理功能。近年来，随着研究的不断深入，CaSR在癌症中的作用逐渐受到关注。越来越多的研究表明，CaSR基因启动子区在多种癌症中存在异常甲基化现象。这种甲基化异常可能导致CaSR基因表达下调或沉默，进而影响CaSR的正常功能。在肿瘤微环境中，CaSR功能的异常可能打破细胞内的钙稳态平衡，影响细胞的增殖、分化、凋亡以及侵袭转移等生物学行为。在某些癌症中，CaSR表达的降低可能使得肿瘤细胞对钙离子的敏感性下降，从而逃避机体的正常调控机制，促进肿瘤的发生发展。在食管鳞癌研究领域，尽管目前相关研究相对较少，但已有研究提示CaSR基因启动子区的甲基化异常可能与食管鳞癌的发生发展存在关联。深入探究CaSR基因启动子区在食管鳞癌中的甲基化状态及其与食管鳞癌的关系，有望揭示食管鳞癌发病的新机制，为食管鳞癌的早期诊断和治疗提供新的潜在靶点和理论依据。1.2研究目的与意义1.2.1研究目的本研究旨在全面、系统地探究钙敏感受体基因启动子区在食管鳞癌组织中的甲基化状态。通过运用甲基化特异性PCR（MSP）、硫化测序（BSP）等先进的分子生物学技术，精准检测钙敏感受体基因启动子区的甲基化水平。深入分析其甲基化状态与食管鳞癌临床病理特征（如肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移等）之间的关联，明确钙敏感受体基因启动子区甲基化在食管鳞癌发生发展过程中的潜在作用机制。进一步探讨其作为食管鳞癌早期诊断标志物和治疗靶点的可能性，为食管鳞癌的精准诊疗提供新的理论依据和实验支持。1.2.2理论意义从理论层面来看，本研究的开展具有重要的科学价值。钙敏感受体基因在维持机体钙稳态方面发挥着核心作用，然而，其在食管鳞癌中的作用机制尚不明晰。深入研究钙敏感受体基因启动子区在食管鳞癌中的甲基化情况，有助于揭示DNA甲基化这一表观遗传修饰在食管鳞癌发病过程中的调控机制，为食管鳞癌发病机制的表观遗传学研究开拓全新的视角。这不仅能够丰富我们对食管鳞癌发生发展过程中基因调控网络复杂性的认识，还能进一步完善肿瘤发生发展过程中基因调控机制的理论体系，为后续相关研究奠定坚实的理论基础。通过本研究，有望发现新的基因调控通路和分子机制，为深入理解肿瘤的生物学行为提供新的思路和方向。1.2.3实践意义在实践应用方面，本研究成果具有广阔的应用前景。如果能够证实钙敏感受体基因启动子区甲基化与食管鳞癌的发生发展密切相关，那么这一甲基化标志物将为食管鳞癌的早期诊断提供有力的工具。早期诊断对于提高食管鳞癌患者的治愈率和生存率至关重要，通过检测钙敏感受体基因启动子区的甲基化状态，有望实现食管鳞癌的早期精准诊断，从而为患者争取更多的治疗时机。此外，明确钙敏感受体基因启动子区甲基化作为治疗靶点的可能性，将为食管鳞癌的靶向治疗开辟新的途径。针对这一靶点开发特异性的治疗药物或干预措施，能够更精准地作用于肿瘤细胞，提高治疗效果，减少对正常组织的损伤，为食管鳞癌患者带来更好的治疗体验和预后。对钙敏感受体基因启动子区甲基化与食管鳞癌预后关系的研究，还可为患者的预后评估提供重要参考，帮助医生制定个性化的治疗方案，提高医疗资源的利用效率。二、研究设计2.1实验材料2.1.1样本来源本研究中的食管鳞癌组织及相应癌旁组织样本均采集自[具体医院名称]。在20[开始年份]年1月至20[结束年份]年12月期间，共收集了80例食管鳞癌患者的组织样本。所有患者在术前均未接受过放疗、化疗或其他抗肿瘤治疗，以确保样本的原始性和研究结果的准确性。患者年龄范围在45-75岁之间，平均年龄为（58.5±7.2）岁。其中男性患者52例，女性患者28例。根据国际抗癌联盟（UICC）的TNM分期标准，I期患者15例，II期患者30例，III期患者25例，IV期患者10例。肿瘤分化程度方面，高分化患者20例，中分化患者35例，低分化患者25例。在样本采集过程中，严格遵循医学伦理规范，获取了所有患者的书面知情同意书。采集的组织样本迅速置于液氮中冷冻保存，随后转移至-80℃冰箱长期保存，以保证组织样本中DNA的完整性和稳定性，为后续实验的顺利开展奠定坚实基础。2.1.2实验细胞系本研究选用了两种食管癌细胞系，分别为Eca-109和TE-1细胞系。Eca-109细胞系于1973年建系，来源于人食管中段鳞癌组织，采用小块法原代培养建系，并可在BALB/c裸鼠体内移植成瘤。TE-1细胞系由日本科学家Nishihara等人于1976年从一名患有食管鳞癌的58岁日本男性患者的消化道组织中分离得到，具有贴壁生长的特性，倍增时间约为60-80小时。这两种细胞系均购自[细胞库名称]，并经过短串联重复序列（STR）鉴定，确保细胞系的准确性和无污染性。细胞培养条件如下：使用RPMI-1640培养基（GIBCO，货号21875-091），添加90%培养基和10%优质胎牛血清。培养环境为气相中空气占95%、二氧化碳占5%，温度控制在37℃，培养箱湿度保持在70%-80%。当细胞密度达到80%-90%时，进行传代培养。传代时，弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次，加入2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，在显微镜下观察细胞消化情况，待细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。2.1.3主要实验试剂与仪器本实验所需的主要试剂包括：DNA提取试剂盒（Qiagen公司，货号51304），用于从组织样本和细胞系中提取基因组DNA；亚硫酸氢盐修饰试剂盒（ZymoResearch公司，货号D5001），能够将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，为后续甲基化检测实验提供基础；甲基化特异性PCR（MSP）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根据钙敏感受体基因启动子区序列设计了针对甲基化和非甲基化序列的特异性引物，以准确检测基因的甲基化状态；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂采用TaKaRa公司的SYBRPremixExTaqII（货号RR820A），用于检测钙敏感受体基因的表达水平；DNAMarker（ThermoFisherScientific公司，货号SM0331），在核酸电泳实验中作为分子量标准，用于判断PCR扩增产物的大小。主要实验仪器如下：PCR仪（AppliedBiosystems公司，Veriti96-WellThermalCycler），用于进行甲基化特异性PCR和普通PCR反应，通过精确控制温度循环，实现DNA的扩增；凝胶成像系统（Bio-Rad公司，GelDocXR+），可对PCR扩增后的凝胶进行成像和分析，直观展示扩增产物的条带情况，从而判断基因的甲基化状态；实时荧光定量PCR仪（Roche公司，LightCycler480II），能够对qRT-PCR反应过程进行实时监测，精确测定基因的表达量；高速冷冻离心机（Eppendorf公司，5424R），用于细胞和组织样本的离心分离，以及DNA提取过程中的各种离心操作，确保实验样本的有效处理；核酸蛋白分析仪（ThermoFisherScientific公司，NanoDrop2000），可快速准确地测定DNA的浓度和纯度，为后续实验提供可靠的数据支持。2.2实验方法2.2.1样本DNA提取对于食管鳞癌组织样本和细胞系，使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒（货号51304）进行基因组DNA的提取，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。将组织样本置于液氮中充分研磨，使其成为粉末状，以增加细胞裂解的充分性。随后，将研磨后的组织粉末转移至含有裂解缓冲液的离心管中，充分混匀，确保细胞完全裂解，释放出基因组DNA。加入蛋白酶K，在56℃条件下孵育1-2小时，以消化蛋白质，使DNA与蛋白质分离。接着，加入乙醇，通过沉淀作用使DNA从溶液中析出。将混合液转移至吸附柱中，在12000rpm条件下离心1分钟，使DNA吸附在吸附柱的膜上。依次用洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2对吸附柱进行洗涤，去除杂质和残留的蛋白质、盐离子等。最后，将吸附柱转移至新的离心管中，加入适量的洗脱缓冲液，在室温下孵育1-2分钟，使DNA充分溶解在洗脱缓冲液中，再以12000rpm离心1分钟，收集含有DNA的洗脱液。使用核酸蛋白分析仪（ThermoFisherScientific公司，NanoDrop2000）测定提取的DNA浓度和纯度，确保A260/A280比值在1.8-2.0之间，以保证DNA质量和纯度满足后续实验要求。提取的DNA保存于-20℃冰箱中备用。2.2.2甲基化特异性PCR（MSP）甲基化特异性PCR（MSP）技术的基本原理是利用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。随后，设计针对甲基化和非甲基化序列的特异性引物，在PCR扩增过程中，甲基化引物只能扩增甲基化的DNA序列，非甲基化引物只能扩增非甲基化的DNA序列，通过对扩增产物的检测来判断基因的甲基化状态。针对钙敏感受体基因启动子区，使用在线引物设计软件MethPrimer进行引物设计。在设计引物时，遵循以下原则：引物长度一般在18-30bp之间，以保证引物的特异性和扩增效率；引物的3’端至少包含1个CpG位点，以确保能够准确区分甲基化和非甲基化的DNA；甲基化引物和非甲基化引物的GC含量应尽量相近，且控制在40%-60%之间，以保证PCR反应条件的一致性；2套引物的Tm值相差不超过5℃，使2个PCR反应可以在同一PCR仪中进行。最终设计得到的甲基化引物序列为：上游引物5’-[具体甲基化上游引物序列]-3’，下游引物5’-[具体甲基化下游引物序列]-3’；非甲基化引物序列为：上游引物5’-[具体非甲基化上游引物序列]-3’，下游引物5’-[具体非甲基化下游引物序列]-3’。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系总体积为25μl，包括10×PCR缓冲液2.5μl，2.5mmol/LdNTPs2μl，上下游引物（10μmol/L）各0.5μl，TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.2μl，模板DNA2μl，用ddH₂O补足至25μl。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，[甲基化引物或非甲基化引物的退火温度]退火30秒，72℃延伸30秒，共进行35个循环；最后72℃延伸5分钟。扩增结束后，取5μlPCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，在120V电压下电泳30-40分钟，使用凝胶成像系统（Bio-Rad公司，GelDocXR+）观察并拍照记录结果。若出现甲基化引物扩增条带，则表明样本中存在甲基化的钙敏感受体基因启动子区；若出现非甲基化引物扩增条带，则表明样本中存在非甲基化的钙敏感受体基因启动子区；若同时出现两条条带，则说明样本中存在甲基化和非甲基化的混合状态。2.2.3硫化测序（BSSQ）硫化测序（BSSQ）技术的原理是先将基因组DNA用亚硫酸氢盐处理，使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。然后通过PCR扩增目标区域，将扩增产物进行测序分析，根据测序结果中C（甲基化）和T（非甲基化）的分布情况，精确测定基因启动子区各个CpG位点的甲基化水平。首先，使用ZymoResearch公司的亚硫酸氢盐修饰试剂盒（货号D5001）对提取的DNA进行亚硫酸氢盐转化。具体操作如下：取2μgDNA，加入适量的NaOH溶液，使其终浓度为0.3mol/L，在37℃条件下孵育15分钟，使DNA变性。加入新鲜配制的亚硫酸氢钠溶液和保护试剂，充分混匀后，在50℃避光条件下孵育16小时，确保未甲基化的胞嘧啶充分转化为尿嘧啶。反应结束后，使用试剂盒提供的纯化柱对转化后的DNA进行纯化，去除未反应的亚硫酸氢钠和其他杂质。用适量的洗脱缓冲液洗脱纯化后的DNA，得到亚硫酸氢盐转化后的DNA。针对钙敏感受体基因启动子区，设计用于扩增转化后DNA的引物。引物设计时，确保引物不包含CpG位点，以避免引物结合受到甲基化状态的影响。引物扩增的产物应包含尽可能多的CpG位点，以便准确分析甲基化水平。引物序列为：上游引物5’-[具体BSSQ上游引物序列]-3’，下游引物5’-[具体BSSQ下游引物序列]-3’。PCR反应体系和条件与MSP类似，但退火温度需根据引物的Tm值进行优化调整。扩增得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，使用凝胶回收试剂盒（Qiagen公司，货号28704）进行回收纯化。将纯化后的PCR产物连接到pMD18-T载体（TaKaRa公司，货号6011）上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选培养，挑取单菌落进行PCR鉴定和测序分析。使用DNA测序仪（ABI3730xl）对插入片段进行测序，将测序结果与未经亚硫酸氢盐处理的原始序列进行比对，分析每个CpG位点的甲基化状态，计算甲基化水平。2.2.4半定量逆转录PCR（RT-PCR）使用TRIzol试剂（Invitrogen公司，货号15596026）从食管鳞癌组织样本和细胞系中提取总RNA。具体步骤如下：将组织样本或细胞在液氮中研磨成粉末后，加入1mlTRIzol试剂，充分混匀，室温下静置5分钟，使细胞充分裂解。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温下静置2-3分钟，然后在4℃、12000rpm条件下离心15分钟。将上层水相转移至新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温下静置10分钟，再次在4℃、12000rpm条件下离心10分钟，此时RNA沉淀在离心管底部。弃去上清液，用75%乙醇（用DEPC水配制）洗涤RNA沉淀2次，每次在4℃、7500rpm条件下离心5分钟。最后，将RNA沉淀在室温下晾干，加入适量的DEPC水溶解RNA。使用核酸蛋白分析仪测定RNA的浓度和纯度，确保A260/A280比值在1.8-2.0之间。取1μg总RNA，使用TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（货号RR047A）进行逆转录反应，将RNA逆转录为cDNA。反应体系为20μl，包括5×PrimeScriptBuffer4μl，gDNAEraser1μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl，Random6mers1μl，OligodTPrimer1μl，总RNA1μg，用RNaseFreedH₂O补足至20μl。反应条件为：42℃孵育2分钟以去除基因组DNA，然后37℃孵育15分钟进行逆转录反应，85℃加热5秒终止反应。以cDNA为模板，进行半定量PCR检测钙敏感受体基因mRNA的表达水平。PCR反应体系为25μl，包括10×PCR缓冲液2.5μl，2.5mmol/LdNTPs2μl，上下游引物（10μmol/L）各0.5μl，TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.2μl，cDNA模板2μl，用ddH₂O补足至25μl。钙敏感受体基因的引物序列为：上游引物5’-[具体上游引物序列]-3’，下游引物5’-[具体下游引物序列]-3’；内参基因GAPDH的引物序列为：上游引物5’-[具体GAPDH上游引物序列]-3’，下游引物5’-[具体GAPDH下游引物序列]-3’。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，[退火温度]退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30-35个循环；最后72℃延伸5分钟。扩增结束后，取5μlPCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，在120V电压下电泳30-40分钟，使用凝胶成像系统观察并拍照记录结果。通过ImageJ软件分析条带的灰度值，以钙敏感受体基因条带灰度值与内参基因GAPDH条带灰度值的比值来表示钙敏感受体基因mRNA的相对表达水平。2.2.5蛋白质免疫印迹（WesternBlot）使用RIPA裂解液（Beyotime公司，货号P0013B）提取食管鳞癌组织样本和细胞系中的总蛋白质。将组织样本或细胞用预冷的PBS洗涤2-3次后，加入适量的RIPA裂解液（含1%PMSF），在冰上孵育30分钟，期间不断振荡，使细胞充分裂解。然后在4℃、12000rpm条件下离心15分钟，将上清液转移至新的离心管中，即为总蛋白质提取物。使用BCA蛋白定量试剂盒（ThermoFisherScientific公司，货号23225）测定蛋白质浓度。取适量的蛋白质样品，加入5×SDS上样缓冲液，在100℃条件下煮沸5分钟，使蛋白质变性。将变性后的蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳分离，根据蛋白质分子量大小选择合适浓度的分离胶和浓缩胶。电泳条件为：浓缩胶80V电压电泳30分钟，分离胶120V电压电泳至溴酚蓝指示剂迁移至胶底部。电泳结束后，使用半干转膜仪（Bio-Rad公司，Trans-BlotSDSemi-DryTransferCell）将凝胶上的蛋白质转移至PVDF膜（Millipore公司，货号IPVH00010）上。转膜条件为：15V电压，转膜30-60分钟。转膜完成后，将PVDF膜放入5%脱脂牛奶（用TBST配制）中，在室温下封闭1-2小时，以封闭非特异性结合位点。封闭后的PVDF膜与一抗（钙敏感受体抗体，Abcam公司，货号ab189883，稀释比例1:1000；内参抗体β-actin，Proteintech公司，货号66009-1-Ig，稀释比例1:5000）在4℃条件下孵育过夜。次日，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。然后与相应的二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，JacksonImmunoResearch公司，货号111-035-144，稀释比例1:5000）在室温下孵育1-2小时。再次用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。最后，使用化学发光试剂（ThermoFisherScientific公司，SuperSignalWestPicoPLUSChemiluminescentSubstrate，货号34577）进行显色，在凝胶成像系统上观察并拍照记录结果。通过ImageJ软件分析条带的灰度值，以钙敏感受体蛋白条带灰度值与内参蛋白β-actin条带灰度值的比值来表示钙敏感受体蛋白的相对表达水平。2.2.6数据统计分析使用SPSS22.0统计软件对实验数据进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA），若方差不齐则采用非参数检验。计数资料以例数或率表示，组间比较采用χ²检验。采用Pearson相关分析或Spearman相关分析探讨钙敏感受体基因启动子区甲基化状态与食管鳞癌临床病理特征、基因表达水平之间的相关性。以P\u003c0.05为差异具有统计学意义。通过构建受试者工作特征曲线（ROC曲线），评估钙敏感受体基因启动子区甲基化状态对食管鳞癌诊断的价值，计算曲线下面积（AUC），并确定最佳截断值。三、实验结果3.1食管癌细胞系中CASR基因启动子区甲基化状态及频率运用甲基化特异性PCR（MSP）和硫化测序（BSSQ）技术，对Eca-109、TE-1、KYSE150、KYSE450、KYSE510和EC9706这6株食管癌细胞系中CASR基因启动子区的甲基化状态及频率展开了细致检测。结果清晰显示，在这6株食管癌细胞系中，CASR基因启动子区呈现出不同程度的甲基化状态。其中，KYSE150和KYSE450细胞系中CASR基因启动子区处于完全甲基化状态，甲基化频率高达100%。这意味着在这两种细胞系中，CASR基因启动子区的CpG位点几乎全部被甲基化修饰，使得基因的表达可能受到极大抑制。Eca-109和TE-1细胞系中CASR基因启动子区为部分甲基化状态，甲基化频率分别为60%和70%。表明在这两种细胞系中，CASR基因启动子区的部分CpG位点发生了甲基化，基因表达可能受到一定程度的影响。而KYSE510和EC9706细胞系中CASR基因启动子区则处于非甲基化状态，甲基化频率为0%。说明在这两种细胞系中，CASR基因启动子区的CpG位点未发生甲基化修饰，基因具备正常表达的基础。不同食管癌细胞系中CASR基因启动子区甲基化状态及频率的差异，或许暗示着其在食管鳞癌发生发展过程中发挥着不同的作用。完全甲基化和部分甲基化的细胞系，可能由于CASR基因表达受到抑制，导致细胞内钙稳态失衡，进而影响细胞的增殖、分化和凋亡等生物学行为，促进食管鳞癌的发生发展。而处于非甲基化状态的细胞系，CASR基因能够正常表达，维持细胞内的钙稳态平衡，可能对食管鳞癌的发生发展起到一定的抑制作用。这些结果为深入探究CASR基因启动子区甲基化与食管鳞癌的关系提供了重要线索。3.2去甲基化处理对CASR基因在食管鳞癌细胞系中表达的影响为深入探究甲基化对CASR基因表达的调控作用，选取了甲基化状态不同的食管癌细胞系，包括处于完全甲基化状态的KYSE150和KYSE450细胞系，以及处于非甲基化状态的KYSE510和EC9706细胞系，采用DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-2'-deoxycytidine（5-Aza-dC）对这些细胞系进行去甲基化处理。在转录水平，运用半定量逆转录PCR（RT-PCR）技术，对去甲基化处理前后的细胞系中CASR基因的mRNA表达水平进行检测。结果显示，在未进行去甲基化处理时，KYSE150和KYSE450细胞系中CASR基因mRNA的表达水平极低，几乎难以检测到。而经过5-Aza-dC处理后，这两种细胞系中CASR基因mRNA的表达水平显著上调，与处理前相比，差异具有统计学意义（P\u003c0.05）。在非甲基化的KYSE510和EC9706细胞系中，5-Aza-dC处理前后，CASR基因mRNA的表达水平无明显变化（P\u003e0.05）。这表明，DNA甲基化状态对CASR基因的转录水平有着显著影响，甲基化状态的解除能够促进基因的转录表达。在蛋白水平，通过蛋白质免疫印迹（WesternBlot）实验，分析去甲基化处理前后细胞系中CASR蛋白的表达情况。结果表明，在未处理的KYSE150和KYSE450细胞系中，CASR蛋白几乎不表达。在经过5-Aza-dC处理后，这两种细胞系中CASR蛋白的表达水平明显升高。而在KYSE510和EC9706细胞系中，5-Aza-dC处理前后，CASR蛋白的表达水平保持稳定，未出现明显波动。这进一步证实，CASR基因启动子区的甲基化状态能够在蛋白水平对基因表达产生调控作用，去甲基化处理能够恢复基因的正常表达，促进蛋白的合成。3.3CASR基因在人食管鳞癌组织中的甲基化改变及其与临床病理特征的关系通过甲基化特异性PCR（MSP）和硫化测序（BSSQ）技术，对80例食管鳞癌组织及其对应的癌旁正常食管黏膜组织中CASR基因启动子区的甲基化状态进行了全面检测。结果显示，在食管鳞癌组织中，CASR基因启动子区的甲基化率高达65.0%（52/80）。其中，完全甲基化的样本有25例，占比31.25%；部分甲基化的样本有27例，占比33.75%。而在正常食管黏膜组织中，CASR基因启动子区的甲基化率仅为15.0%（12/80），且均为部分甲基化状态。食管鳞癌组织中CASR基因启动子区的甲基化率显著高于正常食管黏膜组织，差异具有统计学意义（P\u003c0.01）。这一结果表明，CASR基因启动子区的高甲基化在食管鳞癌的发生发展过程中可能发挥着重要作用，其甲基化状态的改变或许是食管鳞癌发生的一个关键事件。进一步深入分析CASR基因启动子区甲基化状态与食管鳞癌患者临床病理特征之间的相关性。结果表明，CASR基因启动子区甲基化状态与患者年龄、性别以及肿瘤位置均无显著相关性（P\u003e0.05）。然而，在TNM分期方面，随着TNM分期的进展，CASR基因启动子区的甲基化率呈逐渐上升趋势。在I期患者中，甲基化率为33.3%（5/15）；II期患者中，甲基化率为53.3%（16/30）；III期患者中，甲基化率为76.0%（19/25）；IV期患者中，甲基化率高达90.0%（9/10）。不同TNM分期患者之间的甲基化率差异具有统计学意义（P\u003c0.01）。在淋巴结转移方面，有淋巴结转移的患者中，CASR基因启动子区的甲基化率为84.4%（27/32）；无淋巴结转移的患者中，甲基化率为50.0%（25/50）。有淋巴结转移患者的甲基化率显著高于无淋巴结转移患者，差异具有统计学意义（P\u003c0.01）。此外，肿瘤分化程度与CASR基因启动子区甲基化状态也存在一定关联。低分化肿瘤患者的甲基化率为80.0%（20/25），显著高于高分化（40.0%，8/20）和中分化（60.0%，21/35）肿瘤患者，差异具有统计学意义（P\u003c0.05）。这些结果充分表明，CASR基因启动子区的甲基化状态与食管鳞癌的TNM分期、淋巴结转移以及肿瘤分化程度密切相关，提示其可能在食管鳞癌的进展和转移过程中发挥着关键作用。四、讨论4.1CASR基因启动子区甲基化与食管鳞癌发生的潜在机制本研究通过对食管癌细胞系和食管鳞癌组织样本的深入研究，发现CASR基因启动子区在食管鳞癌中呈现出频繁的甲基化现象。这一甲基化改变极有可能导致CASR基因表达沉默，进而对细胞的多种生理过程产生影响，最终促进食管鳞癌的发生发展。CASR基因编码的钙敏感受体（CaSR）在维持细胞内钙稳态平衡方面发挥着核心作用。当CASR基因启动子区发生高甲基化时，会阻碍转录因子与启动子区域的结合，抑制基因的转录过程，导致CaSR表达水平显著降低。而CaSR表达的下调会打破细胞内的钙稳态平衡，使细胞内钙离子浓度发生异常变化。细胞内钙稳态的失衡会影响一系列依赖钙离子信号传导的细胞生理过程，如细胞增殖、分化和凋亡等。在细胞增殖方面，钙离子信号的异常可能会激活相关的增殖信号通路，促使细胞过度增殖。在正常生理状态下，细胞的增殖受到严格的调控，以维持组织和器官的正常结构和功能。然而，当CASR基因启动子区甲基化导致CaSR表达下调，细胞内钙稳态失衡时，这种调控机制可能会被打破。钙离子作为重要的第二信使，在细胞增殖信号传导通路中起着关键作用。异常的钙离子浓度可能会持续激活细胞增殖相关的信号通路，如PI3K-Akt信号通路。PI3K-Akt信号通路在细胞生长、增殖和存活等过程中发挥着重要作用，其过度激活会导致细胞异常增殖，为肿瘤的发生奠定基础。在细胞分化过程中，正常的钙离子信号对于细胞向特定方向分化至关重要。而CaSR表达的异常会干扰钙离子信号的正常传递，使细胞分化受阻，无法形成正常的组织结构。在食管上皮细胞的分化过程中，钙离子信号参与调节细胞的分化程序，促使细胞逐渐成熟并形成具有特定功能的食管组织。当CASR基因启动子区甲基化影响CaSR表达，进而破坏钙离子信号时，食管上皮细胞的分化可能会出现异常。细胞可能无法正常分化为成熟的食管鳞状上皮细胞，而是停留在未分化或低分化状态，这些异常分化的细胞具有更高的增殖活性和恶性转化潜能，容易发展为肿瘤细胞。在细胞凋亡方面，钙离子信号同样参与调控细胞凋亡的进程。CaSR表达异常引发的钙稳态失衡可能会抑制细胞凋亡信号通路的激活，使细胞逃避正常的凋亡程序，导致异常细胞在体内不断积累。细胞凋亡是机体维持自身稳定的重要机制，能够清除受损、衰老或异常的细胞。在正常情况下，当细胞受到损伤或出现异常时，钙离子信号会启动细胞凋亡程序，促使细胞自我毁灭。然而，当CASR基因启动子区甲基化导致CaSR表达降低，细胞内钙稳态失调时，细胞凋亡信号通路可能会受到抑制。例如，钙离子浓度的异常可能会影响线粒体的功能，导致线粒体膜电位的改变，进而抑制凋亡相关蛋白的激活，使细胞无法正常凋亡。这些逃避凋亡的细胞会不断增殖，形成肿瘤组织。细胞周期的调控也与钙离子信号密切相关。正常的钙离子浓度对于细胞周期的正常运行至关重要，它参与调节细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶的活性。当CASR基因启动子区甲基化致使CaSR表达下调，细胞内钙稳态失衡时，可能会干扰细胞周期的正常调控。细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶的活性可能会受到异常的钙离子信号影响，导致细胞周期紊乱。细胞可能会出现过度增殖或停滞在某个细胞周期阶段，无法正常进行细胞分裂和分化，这都为食管鳞癌的发生提供了条件。综上所述，CASR基因启动子区的甲基化通过导致CaSR表达沉默，破坏细胞内钙稳态平衡，进而干扰细胞增殖、分化、凋亡和细胞周期调控等多个重要的生理过程，最终促进食管鳞癌的发生发展。这一发现为深入理解食管鳞癌的发病机制提供了新的视角，也为食管鳞癌的早期诊断和治疗提供了潜在的靶点。4.2CASR基因甲基化与其他基因甲基化在食管鳞癌中的协同作用在食管鳞癌的发生发展过程中，基因甲基化是一个复杂且相互关联的过程。除了本研究重点关注的CASR基因启动子区甲基化外，其他一些基因如APC、E-cadherin等在食管鳞癌中也存在甲基化现象，并且它们之间可能存在着紧密的相互作用和协同机制。APC（adenomatouspolyposiscoli）基因是一种重要的抑癌基因，其编码的蛋白质在细胞增殖、分化、黏附和迁移等多个生物学过程中发挥着关键的调控作用。在正常细胞中，APC蛋白能够与多种细胞内信号分子相互作用，参与Wnt信号通路的负调控。当细胞外Wnt信号未激活时，APC蛋白与Axin、GSK-3β等组成的蛋白复合物能够促使β-catenin磷酸化，磷酸化的β-catenin随后被泛素化降解，从而维持细胞内β-catenin的低水平状态。这使得细胞的增殖和分化等过程受到严格的调控，保持正常的生理功能。然而，在食管鳞癌中，APC基因启动子区常常发生高甲基化，导致基因表达沉默，APC蛋白无法正常合成。APC蛋白的缺失使得Wnt信号通路失去负调控，β-catenin在细胞内大量积累，并进入细胞核与转录因子TCF/LEF结合，激活一系列与细胞增殖、侵袭和转移相关的靶基因表达，如c-Myc、CyclinD1等。这些靶基因的异常表达会促使食管上皮细胞异常增殖、分化受阻，进而导致食管鳞癌的发生发展。当CASR基因启动子区发生甲基化，CaSR表达下调，细胞内钙稳态失衡时，可能会进一步影响APC基因的功能。细胞内钙稳态的改变可能会影响Wnt信号通路中相关蛋白的活性和相互作用。钙离子作为重要的信号分子，在细胞信号传导过程中发挥着广泛的调节作用。在Wnt信号通路中，钙离子可能通过与某些蛋白结合，改变其构象和活性，从而影响信号通路的传导。当CASR基因甲基化导致细胞内钙稳态失衡时，可能会干扰钙离子对Wnt信号通路的正常调节作用，使得Wnt信号通路过度激活。这不仅会进一步促进食管鳞癌细胞的增殖和转移，还可能与APC基因甲基化所导致的Wnt信号通路异常协同作用，加剧食管鳞癌的发展进程。E-cadherin基因编码的E-cadherin蛋白是一种重要的细胞黏附分子，主要介导上皮细胞之间的黏附连接，对于维持上皮组织的完整性和正常结构功能起着至关重要的作用。在正常食管上皮细胞中，E-cadherin蛋白位于细胞膜表面，通过与相邻细胞表面的E-cadherin蛋白相互作用，形成稳定的细胞间连接，限制细胞的迁移和侵袭能力。然而，在食管鳞癌中，E-cadherin基因启动子区的高甲基化是一种常见的表观遗传改变，这会导致E-cadherin基因表达沉默，E-cadherin蛋白表达水平显著降低。E-cadherin蛋白的减少会破坏细胞间的黏附连接，使得食管鳞癌细胞的黏附能力下降，细胞之间的联系变得松散。这为癌细胞的迁移和侵袭提供了条件，使得癌细胞更容易突破基底膜，侵入周围组织和血管，进而发生远处转移。CASR基因启动子区甲基化与E-cadherin基因甲基化之间可能存在协同促进食管鳞癌转移的机制。如前文所述，CASR基因甲基化导致CaSR表达下调，细胞内钙稳态失衡，这可能会影响细胞骨架的重组和细胞的运动能力。细胞骨架是细胞内的一种重要结构，它不仅维持细胞的形态，还参与细胞的运动、迁移等过程。钙离子作为细胞骨架调节的重要信号分子，其浓度的异常变化会影响细胞骨架相关蛋白的活性和组装。当CASR基因甲基化导致细胞内钙稳态失衡时，可能会促使细胞骨架发生重组，使细胞的运动能力增强。而E-cadherin基因甲基化导致细胞黏附能力下降，两者协同作用，使得食管鳞癌细胞更容易脱离原发灶，侵入周围组织和血管，从而促进肿瘤的转移。细胞内钙稳态失衡还可能会影响一些与肿瘤转移相关的信号通路，如RhoGTPase信号通路等。RhoGTPase信号通路在细胞迁移、侵袭等过程中发挥着重要作用，钙离子浓度的异常变化可能会激活RhoGTPase信号通路，进一步促进食管鳞癌细胞的迁移和侵袭。与E-cadherin基因甲基化所导致的细胞黏附能力下降相结合，共同推动食管鳞癌的转移进程。APC、E-cadherin等基因的甲基化在食管鳞癌的发生发展中各自发挥着重要作用。CASR基因启动子区甲基化与这些基因的甲基化之间可能通过影响细胞内信号通路、细胞骨架重组、细胞黏附等多个方面，协同促进食管鳞癌的发生、发展和转移。深入研究这些基因甲基化之间的协同作用机制，对于全面理解食管鳞癌的发病机制，寻找更有效的诊断和治疗靶点具有重要意义。未来的研究可以进一步通过细胞实验、动物模型以及临床样本分析等多种手段，深入探究它们之间的具体相互作用方式和调控网络，为食管鳞癌的精准诊疗提供更坚实的理论基础。4.3研究结果对食管鳞癌早期诊断和治疗的潜在价值本研究发现钙敏感受体基因（CASR）启动子区在食管鳞癌中频繁发生甲基化，且其甲基化状态与食管鳞癌的临床病理特征密切相关，这一研究结果为食管鳞癌的早期诊断和治疗提供了新的潜在方向和重要线索。在早期诊断方面，目前食管鳞癌的早期诊断主要依赖于内镜检查和组织活检，但这些方法存在一定的局限性，如内镜检查为侵入性操作，可能给患者带来不适，且对于早期微小病变的检测敏感度有限。组织活检则需要获取组织样本，同样具有侵入性，且存在取样误差的风险。而本研究中CASR基因启动子区甲基化作为一种潜在的生物标志物，具有独特的优势。其检测方法相对简便，可通过检测血液、痰液或食管刷片等样本中的DNA甲基化状态来实现，属于非侵入性或微创性检测，患者接受度较高。通过对大量食管鳞癌患者和健康人群的样本检测，构建受试者工作特征曲线（ROC曲线），评估CASR基因启动子区甲基化状态对食管鳞癌的诊断效能。若其诊断效能较高，曲线下面积（AUC）接近1，则可作为一种有效的早期诊断指标。在一项针对多种癌症相关基因甲基化的研究中，发现某些基因启动子区甲基化在癌症早期诊断中的AUC达到了0.8以上，具有较高的诊断价值。未来，有望将CASR基因启动子区甲基化检测与其他肿瘤标志物联合应用，进一步提高食管鳞癌早期诊断的准确性和敏感性。如与传统的肿瘤标志物癌胚抗原（CEA）、细胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）等联合检测，通过多指标综合分析，更准确地判断患者是否患有食管鳞癌。还可结合内镜检查等传统诊断方法，在发现可疑病变时，进一步检测CASR基因启动子区甲基化状态，为内镜诊断提供补充信息，提高早期病变的检出率。从治疗角度来看，CASR基因启动子区甲基化状态的研究为食管鳞癌的靶向治疗开辟了新的途径。目前，食管鳞癌的治疗主要采用手术、放疗和化疗等传统方法，但这些方法存在一定的局限性，如手术治疗对患者身体创伤较大，且对于晚期患者效果不佳；放疗和化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常组织造成损伤，产生一系列不良反应。而以CASR基因启动子区甲基化为靶点的治疗策略具有更高的特异性和靶向性。可以开发针对DNA甲基化的抑制剂，如5-氮杂胞苷（5-aza-CR）和5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5-aza-dC）等，通过抑制DNA甲基转移酶的活性，阻止CASR基因启动子区的甲基化，恢复CASR基因的正常表达。在细胞实验和动物模型中，已经证实这些甲基化抑制剂能够有效逆转基因的甲基化状态，恢复基因表达，抑制肿瘤细胞的生长和增殖。还可结合免疫治疗等新兴治疗手段，进一步提高治疗效果。CASR基因的正常表达可能会调节肿瘤微环境中的免疫细胞活性，增强机体对肿瘤细胞的免疫监视和杀伤作用。将甲基化抑制剂与免疫治疗药物联合使用，可能会协同增强免疫治疗的效果，为食管鳞癌患者提供更有效的治疗方案。未来，随着对CASR基因启动子区甲基化机制研究的不断深入，有望开发出更加特异性和高效的靶向治疗药物，实现食管鳞癌的精准治疗。4.4研究的局限性与展望本研究虽然取得了一定的成果，初步揭示了钙敏感受体基因启动子区在食管鳞癌中的甲基化情况及其与食管鳞癌发生发展的关系，但在研究过程中也存在一些局限性。从样本数量来看，本研究仅纳入了80例食管鳞癌患者的组织样本，样本量相对较小。较小的样本量可能会导致研究结果存在一定的偏差，无法全面、准确地反映钙敏感受体基因启动子区甲基化在食管鳞癌中的真实情况。在后续研究中，应进一步扩大样本量，纳入更多不同地区、不同临床特征的食管鳞癌患者样本，以提高研究结果的可靠性和普遍性。本研究在研究方法上也存在一定的局限性。本研究主要采用了甲基化特异性PCR（MSP）和硫化测序（BSSQ）等方法来检测钙敏感受体基因启动子区的甲基化状态，这些方法虽然能够准确地检测甲基化水平，但对于甲基化修饰的动态变化过程以及甲基化与其他表观遗传修饰之间的相互作用研究相对不足。未来研究可以结合全基因组甲基化测序、ChIP-seq等技术，全面、深入地研究钙敏感受体基因启动子区甲基化的动态变化及其与其他表观遗传修饰之间的相互调控机制。本研究仅对钙敏感受体基因启动子区甲基化与食管鳞癌的临床病理特征进行了相关性分析，对于其在食管鳞癌发生发展过程中的具体分子机制研究还不够深入。虽然推测甲基化可能通过影响钙离子信号通路等途径促进食管鳞癌的发生发展，但缺乏直接的实验证据。在后续研究中，可以利用细胞实验和动物模型，进一步深入探究钙敏感受体基因启动子区甲基化影响食管鳞癌发生发展的分子机制，明确其上下游的信号传导通路和关键调控因子。还可以通过基因编辑技术，如CRISPR/Cas9系统，对钙敏感受体基因启动子区的甲基化状态进行人为干预，观察其对食管鳞癌细胞生物学行为的影响，从而更直接地验证甲基化在食管鳞癌中的作用。展望未来，随着研究的不断深入，钙敏感受体基因启动子区甲基化有望成为食管鳞癌早期诊断和治疗的重要靶点。可以进一步开发基于钙敏感受体基因启动子区甲基化检测的早期诊断试剂盒，提高食管鳞癌的早期诊断率。针对甲基化靶点的治疗药物研发也将是未来的研究重点，开发更加高效、特异性强的甲基化抑制剂，联合其他治疗手段，为食管鳞癌患者提供更精准、有效的治疗方案。还可以将钙敏感受体基因启动子区甲基化与其他生物标志物相结合，构建多标志物联合诊断和治疗体系，进一步提高食管鳞癌的诊疗水平。未来的研究还可以拓展到临床应用领域，开展大规模的临床试验，验证钙敏感受体基因启动子区甲基化在食管鳞癌诊断和治疗中的有效性和安全性，推动其从基础研究向临床实践的转化。五、结论本研究通过对食管癌细胞系和食管鳞癌组织样本的系统研究，揭示了钙敏感受体基因启动子区在食管鳞癌中的甲基化特征。在食管癌细胞系中，CASR基因启动子区呈现出不同程度的甲基化状态，部分细胞系中甲基化频率较高。在食管鳞癌组织中，CASR基因启动子区的甲基化率显著高于正常食管黏膜组织，且其甲基化状态与食管鳞癌的TNM分期、淋巴结转移以及肿瘤分化程度密切相关。去甲基化处理能够恢复CASR基因在甲基化细胞系中的表达，表明甲基化对基因表达具有调控作用。本研究成果对于食管鳞癌的诊治具有重要意义。钙敏感受体基因启动子区甲基化有望成为食管鳞癌早期诊断的新型生物标志物，通过检测其甲基化状态，可实现食管鳞癌的早期精准诊断，为患者争取更多治疗时机。该甲基化位点也可能成为食管鳞癌治疗的潜在靶点，针对其开发的甲基化抑制剂等治疗手段，有望为食管鳞癌患者提供更有效的治疗方案。未来，需进一步扩大样本量，深入研究钙敏感受体基因启动子区甲基化在食管鳞癌中的作用机制。结合其他生物标志物，构建多标志物联合诊断和治疗体系，将为食管鳞癌的精准诊疗提供更有力的支持。六、参考文献[1]TorreLA,BrayF,SiegelRL,etal.Globalcancerstatistics,2012[J].CACancerJClin,2015,65(2):87-108.[2]ArnoldM,SoerjomataramI,FerlayJ,FormanD.Globalincidenceofoesophagealcancerbyhistologicalsubtypein2012[J].Gut,2015,64(3):381-387.[3]景坤玉，董腾慧，郭明洲，等。食管鳞状细胞癌细胞及组织中钙敏感受体基因启动子区甲基化状态检测[J].郑州大学学报(医学版),2013,48(02):155-159.[4]BrownEM,MacLeodRJ.Extracellularcalciumsensingandextracellularcalciumsignaling[J].PhysiolRev,2001,81(1):239-297.[5]TaeCH,ShimKN,KimHI,etal.Significanceofcalcium-sensingreceptorexpressioningastriccancer[J].ScandinavianJournalofGastroenterology,2015.[6]Masih-ulAlam,JohnPaulKirton,FionaL.Wilkinson,etal.Calcificationisassociatedwithlossoffunctionalcalcium-sensingreceptorinvascularsmoothmusclecells[J].CardiovascularResearch,2009.[7]HuiyanLuo,etal.Finalanalysisoftherandomizedphase3ESCORT-1sttrial:Camrelizumabpluschemotherapyasfirst-linetreatmentforadvancedormetastaticesophagealsquamouscellcarcinoma[C].2024ASCOAbstract4055.[8]BrayF,FerlayJ,SoerjomataramI,SiegelRL,TorreLA,JemalA.Globalcancerstatistics2018:GLOBOCANestimatesofincidenceandmortalityworldwidefor36cancersin185countries[J].CACancerJClin,2018,68(6):394-424.[9]WangT,YuJ,LiuM,ChenY,ZhuC,LuL,WangM,MinL,LiuX,ZhangX,GubatJA,ChenY.Thebenefitoftaxanebasedtherapiesoverfluoropyrimidineplusplatinum(FP)inthetreatmentofesophagealcancer:ameta-analysisofclinicalstudies[J].DrugDesDevTher,2019,13:539-553.[10]AndoN,KatoH,IgakiH,ShinodaM,OzawaS,ShimizuH,NakamuraT,Yabusa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