第二章核酸学生

第二章

核酸CHEMISTRYOFNUCLEICACID核酸与蛋白质一样，是一切生物机体不可缺少的组成部分。核酸是生命遗传信息的携带者和传递者，它不仅对于生命的延续，生物物种遗传特性的保持，生长发育，细胞分化等起着重要的作用，而且与生物变异，如肿瘤、遗传病、代谢病等也密切相关。因此，核酸是现代生物化学、分子生物学和医学的重要基础之一。

核酸概述

（一）核酸的发展史1.1869年,瑞士年轻的医生FriedrichMiescher在废弃的外科绷带上的血细胞核中分离到一种物质，含有高比例的磷，他将其命名为“核素”（nuclein）。后来，发现有强烈的酸性，改名为“核酸”（nucleicacid）。虽然Miescher并不知道，但他发现了DNA！2.不久，Hoppe-Seyler从酵母细胞中分离了类似的物质，现在知道是RNA。3.20世纪50年代以前，“四核苷酸假说”比较流行，但缺乏结构方面的多样性，因此普遍认为核酸不大可能有重要的生理功能。4.1943年，Chargaff等证明DNA中4种碱基的比例并不相等。5.1944年，美国生化学家Avery通过肺炎双球菌转化实验，证实DNA是遗传物质。6.1953年,JamesWatsonandFrancisCrick提出了DNA的双螺旋结构模型。

（二）核酸概念和蛋白质一样，核酸是一种重要的生物高分子化合物，是由其结构单体核苷酸通过3',5'-磷酸二酯键聚合而成的长链，继而形成具有复杂三维结构的大分子化合物。核酸是动物、植物、微生物机体的重要组成成分，约占细胞干重的５％～１５％。

（四）核酸的重要性1.DNA是主要遗传物质，是遗传信息的载体。证据有：①细菌转化实验。1944年Avery第一次证明了DNA是细菌转化的因子。②噬菌体侵染细菌实验。1952年，Hershey和Chase噬菌体感染实验。2.RNA在蛋白质生物合成中起重要作用。肺炎球菌转化实验IIIS型细胞（有毒）IIR型细胞（无毒）破碎细胞DNAase降解后的DNAIIR型细胞接受IIIS型DNA只有IIR型大多数仍为IIR型少数IIR型细胞被转化产生IIIS型荚膜S（光滑）SRRR（粗糙）+DNA噬菌体侵染细菌实验

一、核酸的化学组成

核酸的元素组成:C、H、O、N、P其中P在各种核酸中的含量比较恒定：RNA平均含磷量8.9%DNA平均含磷量9.1%核酸的逐级水解过程：

①核酸酶；②核苷酸酶；③核苷酶

磷酸

核酸→核苷酸→戊糖核苷→碱基①②③（一）戊糖（pentose）RNA中的戊糖为β-D-核糖（β-D-ribose）DNA中的戊糖为β-D-2-脱氧核糖(β-D-2-deoxyribose)RiboseDeoxyribose2′1′3′4′

5′

2′

（二）含氮碱基（氮碱）

核酸中的碱基分为两类，即嘌呤碱和嘧啶碱。两类核酸中所含的主要碱基都是4种：1.嘌呤碱（purine）为嘌呤的衍生物，两种：

腺嘌呤（adenineAdeorA）

鸟嘌呤（guanineGuaorG

）嘌呤环腺嘌呤鸟嘌呤N9是成苷位置2.嘧啶碱（pyrimidine）胞嘧啶（cytosineCytorC）尿嘧啶（uracilUraorU）胸腺嘧啶（thymineThyorT）RNA中的碱基为胞嘧啶和尿嘧啶；DNA中的碱基为胞嘧啶和胸腺嘧啶。

N1是成苷位置123456pyrimidineringsystem嘧啶环胞嘧啶胸腺嘧啶尿嘧啶3.稀有碱基（修饰碱基、微量碱基）含量甚少的碱基，多数为主要碱基的修饰物。tRNA中大约有10%。4.碱基的结构特征（1）结构互变酮式

烯醇式氨基

亚氨基

（2）嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系，在紫外区有吸收（260nm左右）

（三）核苷（nucleoside）核苷是戊糖和碱基通过糖苷键形成的糖苷。

由戊糖（核糖或脱氧核糖）的第1位C碳原子与嘌呤碱的第9位N原子或嘧啶碱的第1位N原子通过N-糖苷键相连。核苷为β-型，碱基平面与戊糖平面互相垂直。

核苷有两类，分别存在于RNA和DNA中：

核糖核苷（ribonucleoside）

脱氧核糖核苷（deoxyribonucleoside）

AdenosineGuanosineCytidineUridineTherearetwotypesnucleoside

•

ProteinsnucleosideDeoxynucleoside核酸中的稀有核苷：次黄苷（inosine,I）假尿苷(pseudouridine,)

7-甲基鸟苷（7-methylguanosine,

m7G）二氢尿嘧啶核苷（dihydrouridine,DHU）

（四）核苷酸（nucleotide）

核苷酸是核苷的磷酸酯。

在核苷酸的核糖上，有3个游离的羟基，它们磷酸化可形成2'-、3'-和5'-核苷酸。

在脱氧核苷酸核糖上，有2个游离羟基，磷酸化形成3'-和5'-脱氧核苷酸。

生物体游离核苷酸多为5'-核苷酸。

水解核酸得到5'-核苷酸和3'-核苷酸。OHH腺嘌呤核苷酸（AMP）Adenosinemonophosphate脱氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）Deoxyadenosinemonophosphate

AMPGMPUMPCMP

dAMPdGMPdTMPdCMP（五）重要的其他核苷酸衍生物1.多磷酸核苷酸各种核苷一磷酸（NMP）继续磷酸化可生成为核苷二磷酸（NDP）和核苷三磷酸（NTP）例如：

AMP（adenosinemonophosphate）

ADP（adenosinediphosphate）

ATP（adenosinetriphosphate）AMPADPATP2.环化核苷酸

环腺苷酸

（cyclicAMPcAMP）

环鸟苷酸（cyclicGMPcGMP）它们作为细胞之间传递信息的信使。NcAMPcGMP二、核酸的一级结构

指核苷酸残基沿多核苷酸链的排列次序。实验证明，DNA和RNA是没有分支的多核苷酸链。1.连接方式：3',5'-磷酸二酯键2.确定：3'-末端和5'-末端3.核酸的一级结构：各种不同的核苷酸在多核苷酸链上的排列顺序。5`-末端磷酸3`-末端羟基3`，5`-磷酸二酯键

4.核酸一级结构的表达方式：（1）化学结构式：繁琐、复杂。（2）简写式pApCpGpUpCp表示为磷酸基团，p在碱基的左侧表示与戊糖的5′-OH结合，右侧表示与戊糖的3′-OH结合。读向：左→右碱基序列：5'

→

3'

TCATGA5′PPPPPPOH3`5′pTpCpApTpGpA-OH3′5′TCATGA3′（3）竖线式

三、DNA的二级结构—双螺旋结构

（一）双螺旋结构的主要依据

1.DNA碱基组成的Chargaff规则①组成的四种碱基：A、G、C、T②腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等，A=T鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔数相等，C=G③嘌呤碱基总数=嘧啶碱基总数即：A+G=C+T④DNA的碱基组成有物种的特异性，不同物种的DNA有其独特的碱基组成。⑤同一物种不同组织、器官有相同DNA碱基组成，不受生长发育、营养状况及环境影响。DNA来源腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）（A+T）/（G+C）大肠杆菌25.424.824.125.71.01小麦27.327.122.822.71.21鼠28.628.421.421.51.33猪：肝29.429.720.520.51.43胸腺30.028.920.420.7脾29.629.220.420.8酵母31.332.918.717.51.079不同生物来源的DNA四种碱基比例关系

2.X-光衍射数据

①1938年，Astbury等用小牛胸腺DNA纤维做X-射线衍射分析，发现有0.34nm的周期变化。②以后Franklin和Wilkins对DNA的X-衍射进行了更多的研究，获得清晰的衍射图谱。说明DNA是由2条或2条以上的多核苷酸链组成，沿长轴有0.34nm和3.4nm两个重要的周期性变化。DNA的Na盐纤维和DNA晶体的X光衍射图谱Franklin（3）DNA的滴定曲线DNA分子中的磷酸基可被滴定，碱基的可解离基团不能被滴定。1953年，J.Watson和F.Crick在前人研究工作基础上，根据DNA结晶X-衍射图谱，提出了著名的DNA双螺旋结构模型（ThedoublehelicalmodelofDNAstructure），并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测，这是20世纪生物科学最伟大的成就。因此而获得了诺贝尔奖。

（二）双螺旋结构模型（B-DNA）要点1.DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链（一条链5′→3′,另一条链3′→5′）沿同一中心轴右手盘绕而成。磷酸与脱氧核糖通过3′,5′-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的主链骨架。两条主链是由磷酸-脱氧核糖交替而成，位于双螺旋外侧，侧链（碱基）位于双螺旋内侧。碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行.2.两条链之间存在碱基互补的关系。即：A和T配对，中间形成两个氢键；C和G配对，中间形成三个氢键。5′3′

3.螺旋直径2nm，相邻碱基平面垂直距离0.34nm,螺旋结构每隔10个碱基对（basepair,bp）重复一次，间隔为3.4nm。4.双螺旋的表面含有明显的大沟和小沟，其宽度分别为2.2nm和1.2nm，其碱基对暴露在外，与其他调节分子相互作用。5.双螺旋结构的稳定因素

（1）互补碱基之间氢键

主要决定碱基配对的特异性，而对双螺旋稳定的贡献不是最重要的。

（2）碱基堆积力

包括疏水作用和范德华力。为螺旋稳定的主要作用力。（3）溶液中的阳离子或带正电荷的化合物对DNA表面磷酸基团的中和，消除了静电斥力。

（三）DNA二级结构的构象类型DNA在不同盐溶液及不同相对湿度下可以各种不同状态存在：（1）B-DNA相对湿度92%的钠盐，典型的Watson-Crick双螺旋DNA，右手双螺旋，每圈螺旋10.4个bp，螺距：3.32nm。（2）A-DNA相对湿度75%钠盐，右手双螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。（3）Z-DNA1979年Rich等发现。

GC交替的寡聚体，左手螺旋，外形细长。天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。A-DNAB-DNAZ-DNA

（四）DNA双螺旋结构模型的意义该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，这是是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。该模型的提出是本世纪生命科学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石。四、DNA的高级结构

DNA在双螺旋结构基础上通过扭曲和折叠所形成构象。超螺旋是三级结构主要形式。

（一）双链环状DNA分子（dcDNA）

存在于某些细菌的染色体、质粒、病毒、真核生物的线粒体和叶绿体中。在共价闭环双螺旋基础上进一步扭转盘曲,形成超螺旋(supercoil)体积进一步压缩。

①拓扑连环数（linkingnumber）L：一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数。②扭转数（twistingnumber）T：B-DNA模型双螺旋数。③超螺旋数（writhingnumber）WL=T+WW=0松弛环W<0负超螺旋（右手扭曲）W>0正超螺旋（左手扭曲）

（二）双链线性DNA（dsDNA）分子存在于真核生物的染色质和一些病毒中。五、DNA和基因组

本部分为自学内容。六、RNA的结构和功能①组成RNA的戊糖是核糖，主要碱基：A、U、G、C，U替代DNA中的T，还常有一些稀有碱基。②RNA的结构单位主要是四种核苷酸：AMP、GMP、CMP、UMP。③核苷酸连接方式：3′,5′-磷酸二酯键。④天然RNA分子都是单链线形分子（有些病毒是双链），可自身回折，形成局部双螺旋（A-型，A＝U、G≡C），RNA中约40%-70%的核苷酸参与螺旋的形成。⑤稳定性较差，易水解。

（一）tRNA（transferRNA）1.tRNA概况：（1）含量：占细胞内RNA总量的15%。（2）种类：50-60种，真核可达100多种（同工tRNA：运载同一氨基酸的几种tRNA）。（3）分子量：23-28kD，4S。（4）功能：专一携带氨基酸，是氨基酸运载工具。有些tRNA可作为反转录酶的引物，参与DNA的合成。2.tRNA一级结构（1）组成：70-90个核苷酸（标准：76nt）。（2）不变和半不变的核苷酸：约有20多种。半不变的核苷酸主要是嘌呤或嘧啶间的互换的核苷酸。（3）TψCG序列：54-57位，与5SrRNA结合并与tRNA空间结构有关。（4）修饰碱基（修饰核苷酸）：转录后加工而形成，2-19个，70多种，占10%。3.tRNA的二级结构tRNA的二级结构都呈“三叶草”形状，一般可将其分为四臂四环：四环二氢尿嘧啶环：8-12nt反密码环：7ntTψC环:7nt额外环4-5nt可变四臂氨基酸臂：7bp3´-CCA二氢尿嘧啶臂：D臂3bp反密码臂：5bpTψC臂：5bp酵母tRNAAla的二级结构DHU环IGC反密码子反密码环氨基酸臂可变环CCAAla3´5´TψC环4.tRNA的三级结构

倒“L”形，是所有tRNA折叠后形成大小相似及三维构象相似三级结构，这有利于携带的氨基酸的tRNA进入核糖体的特定部位。（二）mRNA（messengerRNA）概念：1961年Jacob和Monod提出用信使RNA命名。是带有从DNA上的到信息并指导蛋白质合成的一类RNA分子，称信使RNA。

含量：3-5%平均分子量50万，8S。功能：蛋白质合成模板（遗传密码）。hnRNA：真核生物RNA前体，需剪接、加工后为成熟的mRNA。（三）rRNA（ribosomalRNA）占RNA总量的80％，与蛋白质结合组成核糖体，是生物体内蛋白质合成的场所。种类：细菌有16S、5S、23S三种，组成30S的转录单位。真核生物有18S、5.8S、28S和5S四种，前3种组成45S的转录单位，5SrRNA单独转录。rRNA的二级结构：茎环结构大肠杆菌5SrRNA结构七、核酸的理化性质核酸的结构特点：分子大，有一些可解离的基团，具有共轭双键等。（一）一般理化性质1.两性电解质。含有磷酸基和碱基，但表现为酸性。2.RNA纯品是白色的粉末，DNA为疏松的石棉一样的纤维状固体。3.线性大分子，极不对称，具有粘度高，抗剪切力差等特点。3.溶解性：RNA和DNA都是极性的化合物，一般都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂，但其钠盐易溶于水。4.RNA的磷酸二酯键对碱敏感，室温下，被稀碱水解为2′-或3′-核苷酸。DNA在碱中虽变性，但不被水解，所以DNA更稳定。

5.鉴别DNA和RNA的反应：RNA：D-核糖+浓盐酸+苔黑酚→绿色DNA：D-2-脱氧核糖+酸+二苯胺→蓝紫色

（二）核酸的紫外吸收1.核酸中的碱基有共轭双键体系，有独特的紫外线吸收光谱，其吸收峰240-290nm，最大吸收峰260nm。2.天然核酸比其各核苷酸成分的光吸收值之和少30-40%（如图）。1.天然DNA2.变性DNA3.核苷酸总吸收值（三）核酸的变性、复性与分子杂交1.核酸的变性（1）变性（denaturation）的概念某些理化因素使核酸分子互补双链之间的氢键断裂，使双螺旋变成松散单链的过程。（2）变性因素热变性：80℃几分钟，螺旋→线团酸碱变性（pH小于4或大于11）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）

（3）变性表征①黏度下降、比旋光度下降、沉降系数增加、浮力密度增大、酸碱滴定曲线改变、生物活性丧失。②增色效应（hyperchromiceffect）：变性后的核酸紫外吸收值增加的现象。（4）热变性和Tm①DNA的热变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。②Tm：即解链温度或熔解温度（meltingtemperature），指核酸加热变性过程中，A260紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度。在Tm时，DNA内50%的双链结构被解开。DNA的Tm一般在82-95℃之间。DNA的热变性曲线③影响Tm值大小因素核酸均一性：均一性高，变性温度范围越窄。

G-C含量与Tm值成正比。经验公式：

Tm=6