涡虫再生中相关基因的研究进展

涡虫再生中相关基因的研究进展摘要：近年来，涡虫的研究已由组织器官水平深入到分子细胞水平，因此涡虫再生的分子机制成为了讨论的热点问题。越来越多的在涡虫再生过程中起调控作用的基因被发现，探究这些基因的功能以及它们在协作调控再生过程中的机制有着重要的意义。本文从涡虫再生的分子机制、再生过程中相关基因的表达和功能以及基因协作调控的信号通路三方面对其研究现状进行综述。这将有利于深入了解涡虫再生的确切机制，也有可能为人体器官再生和抗癌治疗的发展提供重要的信息。关键词：涡虫；再生；再生相关基因；1前言：涡虫因其强大的再生能力,成为了研究再生的理想材料。目前，随着RA+CE技术，原位杂交，转录组测序等分子生物学研究手段的发展，对于涡虫再生的研究已由再生实验观察、组织学观察、形态学观察、毒理研究水平深入到了机理的研究和分子细胞水平上。近年来，国内外科学家发现了许多与涡虫再生相关基因并开展了多角度的研究。研究表明，当涡虫的切断部位进行再生时，是一套完整的基因在控制再生的过程，使其能够在适当的位置上不改变肢体的大小、形状和方向的情况下再生。由此可见，基因在涡虫再生过程中起着重要的作用。此外，一些科学研究表明,涡虫和人类之间的基因同源性超过80%。在干细胞损伤的早期阶段，涡虫与人类等高等生物的反应也非常相似[2]。因此，探究涡虫再生中相关基因的表达和功能以及如何协作调控再生具有重要意义。这不仅有利于深入理解涡虫再生的确切分子机制，也将有利于为人体器官再生、抗癌治疗以及抗衰老等研究提供重要的信息。近年来，涡虫再生的研究主要集中在三大领域：1.再生相关基因的克隆、表达、功能分析以及调控。2.基因调控的信号通路。3.头部、眼点、神经再生的机理。因此本文从涡虫再生的分子机制、再生过程中相关基因的表达和功能特别是眼点和神经的再生以及基因协作调控的信号通路三方面对其研究现状进行综述。2涡虫涡虫属于扁形动物门，涡虫纲(Tubellaria)，三肠目(Tricladida)，蛭科，真涡虫属，涡虫种，分布区域广泛。它的独特之处在于它具有强大的再生能力，成为研究再生的模式生物。涡虫能够在13天内完成再生，重新长出肌肉、神经系统、大脑、皮肤等组织结构和器官。生长速度是中间部分最快,头部最慢,尾部介于二者之者，但头部对外界的反应极灵敏[1]。在海洋中,涡虫的种类和数目也是最多的，其中大部分在沿海的砂砾、淤泥和藻类中过底栖生活和浮游生活;有的则生活于淡水以及热带及亚热带潮湿的陆地上;有些种类在海洋动物体外共栖;还有的则寄生于棘皮动物、甲壳类、软体动物和其他涡虫类的体内[2]。目前,涡虫主要的模式种有地中海涡虫(Schmidteamediterranea)、日本三角涡虫(Dugesiajaponica)和Girardiatigrina三种[3]，尤其对于日本三角涡虫研究比较深入，因此本文主要阐述日本三角涡虫的再生，其相关研究在以下几个方面。3涡虫再生的分子机制涡虫被切割后（即便是成1/279小片段），经过一定的时间，其切割成的小片段也可以再生成完整的个体，这强大的再生能力引起科学家的注意。研究表明，涡虫的可塑性和再生能力是由于一种成热的、多功能的干细胞群,即众所周知的涡虫干细胞一Neoblasts[4]。涡虫的干细胞主要有三大特点：形态上看呈圆形或椭圆形,比其它细胞小,直径约为1nm，核质比较高；第二点是它们分布在全身的实质组织中,但在头部的前端及咽部没有；第三点是在涡虫体内，它是唯一具有分裂能力的细胞，而且还可以分化成涡虫体内任何一种类型的细胞,包括神经细胞和生殖细胞[5]。对于涡虫的再生过程来说，可以将其划分为伤口表皮形成、胚基形成、细胞分化、分化模式形成等阶段。在这些任何阶段中，涡虫一旦受到外界的伤害,其扩增能力就会被激发,然后在伤口表皮下方形成未分化细胞，大量的未分化细胞组成分裂球,从而可以继续完成再生过程[6]。细胞之所以能够分化成不同类型的细胞是基因组中各基因在时间和空间上选择性表达的结果[7]。由此可见，涡虫被切割后成的小片段需要通过一系列复杂的模式重建过程和重要信号通路再生，使干细胞聚集于相应再生部位，以完成再生过程。目前已经鉴定的Neoblasts的干性维持基因包括BF-1的同源体（DjFoxG）[8],和Djpum基因。其中，前者在体细胞和干细胞中都有表达。AlessandraSalvetti等发现的DjPum(DrosophilaPUFgenepumiliode的同源物)[9]，不仅在Neoblasts中表达，而且通过RNAi干扰技术，Neolasts的表达量明显减少，甚至没有表达。由此可见，这些基因在维持干细胞的活性方面是必需的。淡水涡虫--日本三角涡虫的再生是由多个基因组成的基因网络协同作用的结果。而且在基因网络中,同一基因在再生过程的不同阶段可能具有不同的表达水平和不同的功能；不同的基因可能是相互独立的，也可能是相互协同的,从而精确地调控着涡虫再生过程。从形态学和功能水平上看,涡虫的再生是属于完全再生,其中必要经过胚基的形成和变形再生阶段；从分子和细胞水平上看，涡虫的再生是一个多基因，多系统协同调控的复杂过程。目前，在涡虫再生中，基因是如何调控干细胞，如何协同作用，还有待进一步探讨，因此这也需要我们对涡虫再生中的基因做更深入和全面的研究。4再生中相关基因的表达和功能的研究现状以往由于研究方法的问题，涡虫再生机制的探索成为科学家的难题。近年来，随着RNAi技术的发展，逐渐克服了以往实验的局限性,开创了生物再生研究的新局面,该技术还成为研究生物再生的分子机制的有效工具[10]。应用至如今已经解决了涡虫再生中的许多问题,如再生的极性问题、神经系统再生问题和组织动态平衡问题等[11]。关于再生，涡虫眼点再生和神经再生成为近年来国内外研究的热点。因而本文主要从眼点，神经，尾部三方面对再生中相关基因的表达和功能进行简要概述。4.1眼点再生相关基因眼点的形态发生过程在头部再生过程中处于重要地位。研究显示，眼点在动物体内具有生物信号转换作用,其作用机制备受关注。已发现了许多与涡虫眼点再生相关的基因，例如pax6、Pnos、Peya、Potx、eyc53、Djsix-1、Djeya、DjotxA、Djpax6、Djnetrin、Djslit、1020HH、Djopsin、Gtops等。同时，在它们功能方面取得了一定的突破，Djsix-1和Djeya的主要功能是有利于感光细胞的正确分化与视觉系统功能维持；DjotxA参与光传导；Djpax6在视觉轴突的投射中起着重要作用[12]；Djnctrin引导视觉神经元到适当的大脑区域以及维持视觉神经元与目标神经元的连接[12][13]；Djslit的功能是保证视觉轴突向适当的方向延伸和中线穿越[13]；eyc53和1020HH参与避光反应功能恢复；Djopsin参与视觉系统功能恢复和维持；Gtops用于感光。目前，有两种类型的眼点:双目和多目。日本三角涡虫属淡水涡虫，具有双目结构。4.2.1Djsix-1和Djeya基因Djsix-1是Sineoculis/Six基因家族成员之一，Djeya则属于Eya基因家族,而两者的功能均与涡虫眼点前体的细胞分化密切关系，且均属于非常保守的基因。在眼点形成的早期，Djsix-1和Djeya都有表达并且两者在涡虫眼点形态发生过程中表现为协同性,共同调控眼点的再生过程[14]。董自梅等人通过RNA干扰技术(RNAinterference,RNAi)分别沉默这两个基因,导致再生过程中均出现无眼类型；若把Djeya和Djsix-1两者同时沉默,将发育成大量的无眼类型[15]。随之，又通过RT-PCR技术(quantitativereal-timePCR,Real-timePCR)发现,这两种基因不仅在涡虫眼点形成的早期高表达，而且在再生中的整个过程表达量都相当高,因此认为两者不仅参与了眼点前体细胞的分化,而且还参与了视觉系统的功能恢复和正常功能的维持[12]。现如今Djsix-1和Djeya成为研究涡虫眼点形态发生早期的标记基因。因而，需要进一步对此两类家族基因做更深入和全面的研究，以便了解涡虫眼点发育的机制。4.2.2Otx和Djnetrin基因研究发现，Otx、Djpax6、Djnetrin、Djslit是参与视神经纤维生长的主要基因。其中Otx基因的基因家族非常庞大,在视神经发育过程中发挥重要作用。在日本三角涡虫(D.japonica)中又发现了Otx基因的两个同源基因DjotxA和DjotxB,其中,DjotxB与Gtotx同源性比较高[16]。通过原位杂交技术，发现两者在视神经细胞和视神经纤维中高表达,功能则与视神经纤维的生长及光传导作用关系密切[17]。Djnetrin是Netrin基因家族的一员。在日本三角涡虫中,发现Djnetrin在脑背侧中部的视交叉中表达,因此认为它在视神经纤维向脑部延伸过程中具有诱导作用[17]。另外,通过Real-timePCR测定显示,在涡虫头部再生过程中，Djnetrin的表达量逐渐升高,特别是在再生中的第4天有一个明显的提高[12],而切割后的第4天,也正是视神经纤维生长的时期[18]。4.2.3Eye53和1020HH基因研究发现，Eye53、1020HH和Opsin基因是参与眼点形态发生后期的基因。在日本三角涡虫切割后的第5天，Eye53和1020HH基因开始表达,通过RNAi技术使Eye53和1020HH基因沉默,涡虫的视觉神经并没有出现缺陷,但涡虫的避光反应没有恢复,因此Eye53和1020HH可能在视觉系统功能的恢复和维持方面起了重要作用[18]。研究还表明，Eye53和1020HH基因编码的分泌蛋白,可能还与视神经纤维的正确连接有关。同时RT-PCR结果显示,在涡虫头部切割后Djopsin的表达量呈逐渐增加的趋势,特别是再生第5天有明显的升高,第14天达到最高值[12]。因此认为在日本三角涡虫的眼点形态发生中，Djopsin基因的作用是恢复和维持视功能[15]。4.2神经再生相关基因神经普遍分布于涡虫全身，例如头部，眼点，尾部，肌下组织等。因此，神经再生在涡虫再生过程中处于重要地位。涡虫的神经系统都是由中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(peripheralnervoussystem,PNS)两部分组成。已发现许多与神经再生相关基因，并在它们功能上也取得一定成果，例如DjotxA和DjotxB主要表达于脑中部，Djotp则主要表达于脑前侧枝，功能都是建立并维持大脑离散区域。944-HH、4307HH、DjCAM、DjPc2、DjPsa、DjRock2、GtPax6A、Gtwnt-5、GsK3这些基因都主要表达于脑神经节和腹神经索部位；它们的功能有所不同，DjCAM参与轴突的形成，DjPsa参与脑原基分化和脑的形成，GsK3维持脑部神经系统的正常分化和形态发生，DjRock2控制多功能成体干细胞增值于分化，并且还表达于伤口处；其他基因的功能还有待进一步研究。在咽部有表达的基因是GsK3和Djrfc2，其中后者基因的功能是与细胞过度增殖有关。1008-HH、Gtsix3、Djnlg都表达于脑侧枝，只知Djnlg参与背腹轴形成。1020-HH、721-HH、Eye53、DjDSCAM、DjFoxG都主要表达于脑神经节；DjDSCAM参与神经元细胞迁移,轴突生长、成束状和投射，其他基因功能还不清楚。Djxnp表达于脑神经节周边区域。DjCHC在神经突起组成的海绵状区域,参与头部再生与维持。DjwntA在脑后部、腹神经索及其近端,参与脑的前后构型；DjFoxD表达于头前部正中线部分。还有的基因不仅参与神经的再生，还表达于眼点发生过程，例如Djsix-1、Djeya等。3.2.1DjCHC基因DjCHC的功能是有利于中枢神经系统的再生。RNAi技术沉默DjCHC基因，结果显示神经元存活、神经突起生长受到抑制,同时相关实验结果显示DjCHC沉默引起的中枢神经系统萎缩是由于对分化神经元细胞的作用而不是对干细胞的影响[19]。可见，基因并不是只能作用于干细胞，还会调节干细胞分化的细胞。这进一步证明基因可以在不同阶段对不同的细胞进行调控，从而使再生顺利有序的完成。3.2.2DjRock2基因Dj-Rho激酶2基因(Dj-Rhoassociatedproteinkinase2,DjRock2)存在于CNS中且特异表达,尤其是头部神经节处[20]。通过DjRock2干扰试验和涡虫形态观察，显示dsRNA介导的DjRock2下调导致涡虫神经细胞增殖分化受到抑制,视觉神经退化[20]。因此，DjRock2基因在视神经的形成及维持中具有重要作用。3.3尾部再生相关基因在涡虫再生研究中，尾部再生的研究相对较少，因此发现的再生相关基因较少。目前，在日本三角涡虫内已发现热休克蛋白70家族的4个成员，分别是Djhsp70、Djmot、Djgrp78[21]。研究发现其中的Djmot基因与涡虫的再生有着密切的关系，Djmot基因被干扰后，涡虫的再生出现停止现象[22,21]。日本三角涡虫体内的热休克蛋白90家族的Djhsp90基因，在涡虫的再生早期其表达量呈上调趋势[23]。在2020年司马应许利用整体原位杂交、RNA干扰和RT-PCR等分子生物学技术研究了热休克蛋白70和90家族的Djhsp70e、Djhsp90a、Djhsp90b和Djhsp90c四个基因，发现在涡虫尾部再生中发挥重要的作用。Djhsp70e基因在身体各部分广泛表达，身体两侧和肠支处杂交信号较强，但脑及咽部没有出现表达。Djhsp90a基因在主要分布在大部分的实质组织中，但脑及咽部没有出现表达。Djhsp90b基因在整体涡虫实质组织中广泛表达且身体两侧和芽基部位有较强的杂交信号。Djhsp90c基因在主要分布在身体两侧及尾部。它们再生个体的芽基部位均有较强的杂交信号。RNA干扰这四个基因后，均出现头再生尾和尾再生头片段再生速度缓慢的现象[24]。研究证实Djpi3k基因在涡虫早期再生及组织的维持中起到了十分重要的调控作用，抑制其活性降低了细胞增殖和细胞凋亡的水平，进而影响涡虫组织再生[25]。综上所述，随着分子技术，原位杂交，转录组测序等技术的发展，对于涡虫再生的研究已由以前对再生实验观察、组织结构，毒理研究水平深入到了机理的研究和分子细胞水平上。现如今在涡虫再生相关基因的克隆、表达、功能分析以及调控方面虽然取得了一定进展，但涡虫再生中相关基因的探索还不够全面，基因库有待进一步完善。另外，与其他高等无脊椎动物相比，涡虫的神经元与脊椎动物相似性更高,因而研究其再生的分子机制还可以为脊椎动物神经系统的研究提供依据。4基因协作调控的信号通路4.1BMP信号通路BMP信号传导作为一种典型信号通路,参与了众多发育事件，研究显示,缺乏左右对称的受伤涡虫,在早期再生中会通过调节BMP活性来形成新的中线[26]。另外，DjSparc-like基因中Follistatin区,能阻断BMP4信号转导通路,抑制BMP的腹化作用,从而促进背轴形成[23]。Molinaetal(2007)发现:BMP信号通路中两个重要分子Smed-BMP和Smed-Smadl,与涡虫背腹(D.V)轴建立有关，表明涡虫的BMP信号通路在再生中的背腹轴重建和维持起着重要作用。Reddien(2007)发现BMP信号通路中三个和再生过程中两侧对称形成有关的基因，分别是smedolloid-I,smedsmad4-1和smedbmp4-1。由此可见，BMP信号通路在涡虫身体极性构建过程中发挥着重要作用[5]。4.2Wnt信号通路Wnt信号通路包括经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路。经典Wnt信号通路也就是Wnt/β-catenin信号通路。在涡虫再生过程中,涡虫的Wnt/β-catenin信号通路对再生极性的决定起着重要的作用，wnt基因对涡虫的前后轴和中侧轴的建立、脑部以及神经系统的形成等有关,其中,wnt5和wnt11-6与神经系统发育有关[3]。另外，涡虫DjSparc-like基因调节TGF-β的表达，而TGF-β能诱导β-catenin的酪氨酸磷酸化，降低β-catenin与钙粘蛋白的亲和力，游离的β-catenin可与APC蛋白、GSK-3β形成三联体，利于Wnt信号通路上调，使与胚胎发育相关的基因表达，进而推动前后轴的出现，促进头尾的形成[11]。而非经典Wnt信号通路主要包括Wnt-Ca2+信号通路、平面极细胞通路及调节纺锤体的方向和非对称细胞分裂的胞内通路[27]。4.3Hedgehog信号通路在脊椎动物中,Hedgehog(HH)信号介导的许多发育事件,除了在脊髓腹侧模式中作为形态发生因子的作用,还包括少突胶质细胞的产生及其在控制神经祖细胞增殖中的促分裂作用[28]。在涡虫再生过程中,HH信号通过调节Wnt家族基因的转录,来建立的前后(anterior-posterior,AP)极性从而进一步指导头部或者尾部再生[29]。综上所述，在涡虫再生中基因调控相关信号通路，通过信号通路又激活相关基因，构成复杂的调控过程。可见信号通路在涡虫再生中居于重要地位。如今还有许多信号通路尚未被报道，通过搜集在其他物种的再生发生中的