人间充质干细胞生产和质量控制规范团体标准

T/SDASTCXXX-XXXXICS01.020CCSA00人间充质干细胞生产和质量控制规范Specificationforproductionandqualitycontrolofhumanmesenchymalstemcell（征求意见稿）

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T/SDASTCXXX-XXXX山东科技咨询协会发布XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施人间充质干细胞生产和质量控制规范1范围本文件规定了人脐带来源的间充质干细胞的生产和质量控制规范，从场地设施与设备、专业人员及培训、原材料和辅料、生产工艺、质量控制、质量保证、标签说明和包装、贮藏与运输、废弃物处理等多个环节，对间充质干细胞的制备及质量控制进行了全面规范。本文件适用于以人脐带为来源的间充质干细胞生产和质量控制规范，为干细胞的研发和生产提供参考。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB50073-2023《洁净生产厂房设计规范》GB50346-2011《生物安全实验室建筑技术规范》GB50591-2010《洁净室施工及验收规范》T/CSCB0001-2020《干细胞通用要求》3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1人间充质干细胞humanmesenchymalstemcells干细胞是一类具有不同分化潜能，并在非分化状态下自我更新的细胞，人间充质干细胞是一种多能干细胞，具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。3.2知情同意informedconsent个人或其合法授权代表在被告知与其作出决定参与研究有关的所有信息之后，在没有不当引诱、欺诈、欺骗、暴力胁迫或其他形式的约束或强制的情况下，自由进行选择并明确作出同意的过程。3.3采集harvest从供者获得组织，细胞等生物样本的过程。3.4分离isolation从生物样本获取目的细胞的过程。3.5冻存cryopreservation使细胞暂时脱离生长状态而保存其细胞特性的超低温冷冻过程。3.6复苏revival使细胞从脱离生长状态重新获得生长活力的过程。3.7细胞存活率cellviability能够增殖、保持正常代谢活性等的细胞占全部细胞的百分比。3.8初级细胞库pre-mastercellbank又名细胞种子（cellseed）和原始细胞库(PrimaryCellBank，PCB),由一个原始细胞群体发展成为传代稳定的细胞群体，或经过克隆培养形成的均一细胞群体，通过检定证明适用于生物制品生产或检定。3.9主细胞库MasterCellBank，MCB由原始细胞库细胞传代增殖后均匀混合成一批，定量分装，保存于液氮或-130℃以下。这些细胞须按其特定的质控要求进行全面检定，全部合格后即为主细胞库，供建立工作细胞库用。3.10工作细胞库WorkingCellBank，WCB经主细胞库细胞传代增殖，达到一定代次水平的细胞，合并后制成一批均质细胞悬液，定量分装于一定数量的安瓿或适宜的细胞冻存管，保存于液氮或一130°C以下备用，即为工作细胞库。4缩略语下列缩略语适用于本文件。GMP：药品生产质量管理规范(goodmanufacturingpractice)HBV：乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus)HCV：丙型肝炎病毒(hepafitisCvirus)HIV：人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus)EBV：EB病毒，也称为人类疱疹病毒4型（Epstein-Barrvirus，EBV）HTLV：人类嗜T淋巴细胞病毒(humanTlymphotropicvirus)TP：梅毒螺旋体（TreponemaPallidum）CMV：巨细胞病毒（Cytomegalovirus）QA：质量保证(qualityassurance)SOP：标准操作规程(standardoperatingprocedure)5基本要求人间充质干细胞产品的生产和质量控制应符合《药品生产质量管理规范》(GMP)的要求，生产该产品的厂房设施及设备应具有一定资质和规范，生产所用仪器设备经过验证并计量等，专业技术人员需经过系统的培训并掌握相关专业技能，并定期接受岗位操作、政策法规、药品质量管理体系等相关培训。生产所需原材料和辅料符合通用要求，采集人员具备相应资质，生产过程需有明确的操作步聚、工艺参数等。质量控制方面严格、规范，涵盖产品检测、设备校准、工艺监测等多个环节。此外，生产环境需定期监控，并开展清洁验证，产品贮藏和运输环节需有严格规定，保证产品安全性，废弃物处理环节符合规定并建立完善的销毁记录等，同时生产过程和质量控制方面都应有数据记录和管理系统，确保数据的完整性、真实性以及可追湖性。人脐带间充质干细胞的采集，因其来源的特殊性—取自新生儿分娩后的脐带组织，涉及一系列重要的伦理考量和规范。旨在确保采集活动尊重捐献者自主权、保障母婴安全、并符合社会公序良俗与法律法规。基于相关规范和实践，其伦理应做以下说明：人脐带间充质干细胞的采集必须严格遵循“自愿、无偿、知情同意”的基本原则；与捐献者签订知情同意书，把采集的目的和意义，采集过程和安全性详细告知，并承诺对捐赠者及其子女的个人信息严格保密，明确告知采集的样本及由此制备的干细胞将如何被使用、储存及最终处置，如果用于研究或商业开发，需说明由此产生的知识产权或商业利益归属（通常归研究者或开发者），且捐献者不享有相关权益。6场地设施与设备6.1场地设施6.1.1人脐带间充质干细胞制备和生产用实验室选址应远离易发生自然灾害、将要拆迁的建筑区和市政规划不明确的区域。6.1.2实验室或厂房应由专业资质的工程公司设计建造，其设计需符合《洁净生产厂房设计规范》（GB50073）、《生物安全实验室建筑技术规范》（GB50346）和《洁净室施工及验收规范》（GB50591）等国家标准。6.1.3实验室设计应符合GMP体系，整个细胞制备过程必须在《药品生产质量管理规范》要求的洁净环境下进行，其核心功能区（如制备间、培养室等）的洁净等级应整体达到C级，部分局部操作区域（如超净工作台内）需达到A级。各功能区域的洁净级别需经专业机构检测并出具合格证明。6.1.4实验室应进行明确的功能分区，通常包括样本接收室、干细胞制备室、干细胞储存室、更衣室、缓冲间、风淋室、废弃物暂存间等。质量控制区（如检验室）必须与制备区实施物理隔离，以防止交叉污染。6.1.5洁净区与非洁净区之间、不同级别洁净区之间的压差应不低于10帕斯卡，相同洁净度级别不同功能的操作间之间应保持适当的压差梯度，以防止污染和交叉污染。6.1.6实验室区域应定期进行环境和尘埃粒子的检测，其要求应符合GMP的要求。6.2设备6.2.1设备要求生产人间充质干细胞设备的设计、选型、安装、改造和维护必须符合预定用途，应尽可能降低发生污染、交叉污染、混淆和差错，便于操作、清洁、维护，以及必要时进行的消毒或灭菌。主要要求如下：6.2.1.1应优先选择符合《国家药品生产质量管理规范》（GMP）和《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》要求的设备。6.2.1.2采购时应选用合格供应商的设备，并要求其提供产品的质量报告和不同批次检验报告等。6.2.1.3生产设备安装与运行符合GMP的要求，摆放正确，不形成死角。6.2.2设备维护和维修6.2.2.1对于关键设备（如培养箱、离心机等），必须定期进行由第三方机构执行的校准和保养，以确保其测量的准确性和可靠性。6.2.2.3设备的维护和维修应有相应的记录，经改造或重大维修的设备应进行重新确认或验证，符合要求后方可用于生产。7专业人员及培训7.1人员7.1.1人间充质干细胞生产机构应设立企业负责人、生产管理负责人、质量管理负责人和质量受权人并应接受过与所生产产品相关的专业知识培训，具备一定的专业基础知识，并在该领域具备一定的实践经验和管理经验。7.1.2关键岗位操作人员应具备相关的专业知识，一般要求具有生物化学、微生物学、免疫学、细胞生物学、生物学等专业背景。7.2培训7.2.1从事干细胞生产和质控相关技术人员上岗前必须经过专业培训，培训的内容应与每个岗位的要求相适应，培训内容包括但不限于：药品生产质量管理规范（GMP）、脐带间充质干细胞理论与实践、干细胞法律法规、岗位职责及操作规范等。7.2.2应建立严格完善的培训记录及档案，定期进行培训和记录。8原材料和辅料8.1通用要求所有用于人间充质干细胞生产的原材料和辅料，其选用的核心原则是质量可控、来源清晰、安全无污染。应优先选用符合国家相关标准的产品，并对供应商进行严格审核，要求提供合格的质量报告和不同批次的检验报告等。8.2原材料脐带作为最核心的“原材料”，其供体的筛选是质量控制的第一道关口，直接决定了细胞来源的安全性。8.2.1供体健康筛查必须对捐献脐带的产妇（供者）进行全面的健康评估和病原体筛查，这包括采集其一般信息、既往病史、家族史等。要求供者无家族遗传病、无恶性肿瘤疾病史、无感染性疾病、无自身免疫性疾病。8.2.2病原体检测必须对供者或脐带样本进行特定病毒的检测，结果应为阴性。需筛查的病原体至少包括：HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV和TP，这些检测是防止病原体通过细胞制剂传播给受者的关键措施。8.3关键辅料8.3.1质量标准培养基应具有足够的纯度，并符合无菌、无致病微生物及内毒素的质量标准，内毒素含量通常有严格上限（例如≤10EU/mL）。8.3.2成分趋势在传统的间充质干细胞培养过程会用到动物血清（如胎牛血清），这种培养液成分复杂、可能引起免疫反应和携带外源因子风险。当前趋势是使用化学成分明确的无血清培养基，另外一些新型培养基可以通过添加特定生长因子（如EGF、bFGF）、胰岛素、透明质酸等成分，来替代血清功能，支持细胞贴壁、增殖并维持干性。8.3.2其他关键辅料在细胞制备的全过程中，所使用的其他关键物料（如消化酶、冻存液、培养耗材等）都必须记录其名称、生产商、批号、有效期限等信息，并进行物料抽检，确保在培养过程中的安全性。9生产工艺9.1生产工艺9.1.1细胞分离与培养9.1.1.1起始原材料的采集按照8.2原材料的要求，采集起始原材料：脐带。应对采集条件、采集体系、保存与运输条件等进行工艺设计和优化。9.1.1.2组织准备和处理现在主流方法是采取组织块贴壁法，在尽量短时间内处理，将采集到的脐带在无菌条件下用含抗生素的生理盐水进行清洗，并去除血液或其他杂质，用灭菌过的剪刀、镊子等处理组织，分离出华通氏胶。9.1.1.3初步分离和培养通过组织剥离方法去除其他组织，保留华通胶，剪碎至约1mm2的小块，铺瓶培养，细胞代次可设为P0代，第一天可将培养瓶倒置在37℃，5%二氧化碳浓度的培养箱，第二天加入适量的完全培养基进行正置放置培养，同时做好脐带分离过程中的留样检测等。9.1.1.4培养与换液人脐带间充质干细胞通过贴壁方式培养，组织块接种后，应尽量减少移动培养瓶。通常在培养7天后进行首次换液，此后每2-4天换液一次，换液时需动作轻柔，倾斜培养瓶，避免扰动或吹起组织块。9.1.1.5传代操作当原代细胞从组织块周围爬出，并生长至汇合度达80%～90%时，可进行传代。传代一般采用酶消化法（如使用胰蛋白酶或替代物），消化时间需严格控制，在显微镜下观察细胞变圆后立即用含血清的培养基或专用终止液终止消化，离心后，用新鲜培养基重悬细胞，并按适宜密度（如6000个细胞/cm²）接种进行扩增。9.1.1.6培养观察在细胞培养过程中需定期在显微镜下观察细胞形态，典型的人间充质干细胞贴壁生长时，应呈均匀的纺锤形或梭形的成纤维细胞样形态。9.1.2细胞冻存与复苏9.1.2.1细胞冻存冻存过程应遵循程序降温原则，以保护细胞免受冰晶损伤，通常使用含冷冻保护剂（如DMSO）的冻存液，也可以用专门的细胞冻存液去冻存，细胞密度建议在1×10⁶至1×10⁷个/mL。冻存后的细胞应置于-196℃液氮中长期保存。9.1.2.2细胞复苏复苏时需快速操作。将冻存管置于37℃水浴中快速晃动融化，直至只剩少量冰晶。解冻后应立即用预热的培养基稀释，以降低冻存液中DMSO浓度，离心洗涤后重悬，并接种到预处理的培养器皿中。9.1.3细胞库的建立细胞库的建立应选用质量相同、能持续稳定传代的细胞，细胞建库应在符合中国现行药品生产质量管理规范的条件下制备。9.1.3.1初级细胞库人脐带间充质干细胞属于原代培养，来源于原代分离培养的早期代次细胞（如P2代），经过全面质量检定后冻存，可作为是细胞最原始的“种子”。其细胞数量规模通常较小（例如1×10⁶个/管），供建立主细胞库用。9.1.3.2主细胞库(MCB)取细胞种子通过规定的方式进行传代、增殖后，在特定倍增水平或传代水平同次均匀地混合成一批，定量分装于一定数量的安甑或适宜的细胞冻存管，保存于液氮或-130℃以下，即可作为主细胞库，其用于工作细胞库的制备，生产企业的主细胞库应限定代次（如P4代）并检定合格。9.1.3.3工作细胞库(WCB)工作细胞库的细胞由MCB细胞传代扩增制成。由MCB的细胞经传代增殖，达到一定代次水平的细胞，合并后制成一批均质细胞悬液，定量分装于一定数量的安甑或适宜的细胞冻存管中，保存于液氮或-130℃以下，即为工作细胞库。生产企业的工作细胞库必须限定代次（如P4代）。冻存时细胞的传代水平须确保细胞复苏后传代增殖的细胞数量能满足生产一批制品。复苏后细胞的传代水平应不超过批准用于生产的最高限定代次。所制备的WCB必须经检定合格后，方可用于生产。9.1.4细胞库的检定9.1.4.1细胞基本生物学信息显微镜下观察细胞呈均匀的纺锤形或梭形的成纤维细胞样形态，贴壁生长；未冻存细胞的存活率应≥90%，冻存复苏后细胞存活率应≥80%。；采用流式细胞术(FCM)进行细胞表面标志物的检定：CD73、CD90、CD105等阳性率应不低于95%,CD11b或CD14、CD19或CD79a、CD34、CD45和HLA-DR等阳性率应不高于2%。9.1.4.1微生物学安全性对需要入库细胞进行细菌和真菌检测，结果应为阴性；支原体检查结果应为阴性；内毒素检查，结果应为阴性。9.1.5细胞库的管理9.1.5.1主细胞库和工作细胞库应分别存放，即每一个库应在至少2个不同的地点或区域存放，可选择在生产设施内和(或)与生产设施有一定距离的地点。当存放地点较远时，应使用有质量保障的容器运输，并监测运输温度。应监测并维护细胞库冻存容器，以保证细胞库贮存在一个高度稳定的环境中。非生产用细胞应与生产用细胞严格分开存放。9.1.5.2每种细胞库均应分别建立台账，详细记录放置位置、容器编号。分装及冻存数量、取用情况等。细胞库中的每支细胞均应可追溯其细胞系/株名、代次、批号，编号、冻存日期等信息。9.1.5.3为保证细胞冻存后仍具有良好的活率，冻存后应取一定量的可代表冻存全过程的冻存管复苏细胞，复苏细胞的活率一般应不低于80%，若复苏细胞活率低于80%,应进行充分评估并有验证数据支持。细胞冻存后，可通过定期复苏细胞及复苏细胞的活力数据确认细胞在冻存及贮存条件下的稳定性。9.1.6细胞制剂灌装9.1.6.1在生产的最后环节-制剂灌装，其工艺开发内容包括了辅料的组成和比例开发，制剂的装量范围的制定，加入辅料后的放置条件和放置时间范围制定等，一般要求制剂液中含有2%～5%的人血白蛋白，制剂装量在10^7，新鲜制剂放置于2℃～8℃条件下不超过8小时。9.1.6.2用于配制干细胞制剂的中间细胞产品，代数应不少于四代，不超过六代。9.1.6.3干细胞制剂重悬液应按照经批准的配方进行配制和灌装，其中白蛋白含量不得低于2%。9.1.6.4干细胞成品如需长期保存，可使用含有DMSO的冷冻保存液保存，细胞密度建议在1×10⁶至1×10⁷个/mL。冻存后的细胞应置于-196℃液氮中长期保存。10质量控制10.1供者和原材料质量控制10.1.1捐献脐带的产妇（供者）进行全面的健康评估和病原体筛查。这包括采集其一般信息、既往病史、家族史等。要求供者无家族遗传病、无恶性肿瘤疾病史、无感染性疾病、无自身免疫性疾病。10.1.2对供者或脐带样本进行特定病毒的检测，结果应为阴性。根据标准，需筛查的病原体至少包括：HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV和TP等。10.2细胞产品关键质量属性表1人间充质干细胞关键质量属性项目要求细胞形态细胞形态均一，贴壁生长，细胞透亮呈均匀的纺锤形或梭形的成纤维细胞样形态细胞存活率人间充质干细胞存活率，冻存前存活率≥90%；细胞复苏后存活率≥80%无菌检测“无菌检查法”细菌、真菌检测应为阴性内毒素内毒素检测应为阴性支原体支原体检测应为阴性PH7.0-7.2可见异物检查应在规定条件下目视无可见异物干性分析细胞标志物检测：采用流式细胞术(FCM)进行细胞表面标志物的质控。质控标准：CD73、CD90、CD105等阳性率应不低于95%,CD11b或CD14、CD19或CD79a、CD34、CD45和HLA-DR等阳性率应不高于2%多向分化潜能（成骨、成软骨和成脂诱导分化检测）：成骨检测诱导培养14d~21d,细胞间可见有矿化钙盐沉积，茜素红-S染色为红色；成软骨检测诱导培养14d~21d,可见细胞微球处于悬浮状态，表面光滑、质地较硬、白色软骨状、且细胞微球周围无贴壁细胞，经阿尔新蓝染色后被染成蓝色的细胞微球；成脂检测诱导培养14d~21d,倒置显微镜下即可见胞浆内脂滴形成，油红-O染色可见细胞中脂滴被染成红色核心干性基因：如ssea-4、oct-4、sox-2和nanog基因均为多能性基因)，可采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）等方法检测干性基因的mRNA表达水平成瘤性检测通过免疫缺陷动物体内成瘤试验等方法，证明细胞无致瘤风险，质控标准为不具有成瘤性细胞鉴别通过短串联重复序列（STR）检测等方法，确认细胞与供体来源一致，无其他细胞的交叉污染10.3其他质量控制定期进行环境检测，尘埃粒子，悬浮菌的检测，应符合GMP的要求，对于采集原材料所用的保存液、培养基、消化液、冻存液以及关键耗材都应进行取样抽检，以保证干细胞产品的安全性。11质量保证11.1生产质量管理体系生产质量管理体系应包括以下内容：a)质量管理手册：描述人间充质干细胞生产全过程的质量控制要点；b)程序文件和操作规程：详细規定细胞培养、收获、冷冻和解冻的具体操作；c)记录表格：记录细胞生长数据、污染检测结果和质量检验数据；d)质量标准：设定细胞活性、纯度和安全性等的检验标准；11.2文件与记录11.2.1保存所有人间充质干细胞生产活动的详细记录，包括细胞培养条件、批次信息和质量检验结果，以实现全程追溯。这些文件包括但不限于：生产工艺文件，质量控制文件。11.2.2文档的更新是一个持续的过程，随着法规的变化、生产工艺的改进，或者产品质量控制经验的积累，相关的文件都需要被及时更新，同时也要保证旧文件被适当归档和保留。11.2.3根据《细胞治疗产品生产质量管理指南(试行)》中规定细胞产品的批记录应当至少保存至产品有效期后五年。供者材料、关键物料的追溯以及供者与患者关联识别等关键追踪记录或资料，至少保存三十年。11.3留样管理参照《细胞治疗产品生产质量管理指南(试行)》中“质量管理”中的留样管理。细胞产品的供者材料、关键物料和成品应该按规定留样。特殊情况下，如因供者材料或物料稀缺，产品批量小、有效期短和满足临床必需等，供者材料、物料和细胞产品的留样量、留样包装、保存条件和留样时间可进行如下适当的调整。11.3.1供者材料的留样脐带原材料采集后应当保存留样，可以剪取一小块脐带组织长约2cm进行留样保存。11.3.2关键物料的留样关键物料（如培养基、细胞因子、生长因子、胰蛋白酶或替代物、血清或替代物等）对调查产品可能出现的质量问题至关重要，企业应当对有效期或货架期内的关键物料保存留样。11.3.3成品的留样a)成品留样量可以根据不同细胞产品的批量适当减少。b)需要缩短留样保存时间的，应当进行评价并有相应报告。c)因产品有效期较短，而需要延长其留样保存时间的，应当采取适当的方法（如低温冻存）以满足留样的预定目的。d)无法使用成品留样的，可选择与成品相同成分的中间产品留样，留样的包装、保存条件及期限应当满足留样的目的和要求。留样的包装方式和包装材质应当与上市产品相同或相仿。11.4文档更新与持续改进a)SOP更新：根据需要更新或修订相关的SOP和培训材科；b)持续改进：可以将偏差管理纳入质量管理体系，促进持续优化和质量提升：c)整个偏差管理过程应该是文档化的，并且所有的步骤和决策都应该有记录。12标签说明与包装12.1产品基本信息人间充质干细胞产品标签主要包括的产品信息有：产品名称（如人间充质干细胞）、细胞原材料来源（脐带）、代次（如P6代）、规格（如10ml)、细胞数量(如1×10⁶个细胞/管）等。12.2质量安全信息12.2.1质量控制信息应简要说明产品已通过的关键质量检定，例如“本产品经过了无菌、支原体、内毒素检测”等，此外还有产品应满足特定的细胞存活率、表面标志物表达率等。12.2.2保存条件明确标注“液氮保存”或“-130℃及以下”长期保存。12.2.3警告与用途限制应包含安全警告，例如“警告：产品冻存液中含有DMSO，具有潜在的生物公害，操作者请谨慎处理”。12.3包装要求新鲜细胞制剂和冻存细胞通常采用不同的容器分装，运输条件：根据运输时间，有明确要求：2小时内可常温运输；2小时以上需在2℃～8℃冷藏运输；最长运输时间不得超过24小时。运输容器：需要使用防漏、抗震、抗压力变化的专业转运容器（如干冰运输箱或液氮罐）。运输和转运容器应定期进行验证，确保其性能可以用于有效运行。13贮藏和运输13.1短期保存对于暂时不使用的细胞或运输途中的临时保存，通常建议在-80℃的低温冰箱中保存。例如，有供应商明确说明，干冰运输收到的冻存细胞，若无法立即复苏，可在-80℃的条件下保存1个月。13.2长期保存干细胞长期保存通常采用-196℃液氮中储存。13.3运输要求13.3.1冻存细胞运输冻存细胞运输通常采用干冰运输方式，如1mL冻