探秘白假丝酵母菌生物膜：滞留菌形成动态与基因筛选的深度剖析

探秘白假丝酵母菌生物膜：滞留菌形成动态与基因筛选的深度剖析一、引言1.1研究背景与意义白假丝酵母菌（Candidaalbicans），也被称为白色念珠菌，作为人体口腔常驻微生物群的关键组成部分，是一种典型的机会条件致病真菌。在健康个体中，白假丝酵母菌与机体和谐共生，通常不会引发疾病。然而，当宿主机体的免疫力降低，如因患有糖尿病、慢性疾病、艾滋病，或长期使用抗生素、免疫抑制剂、激素，以及接受器官移植、介入治疗等情况时，白假丝酵母菌便可能趁机大量繁殖，从而引发体表以及深部组织器官的内源性感染。据统计，白假丝酵母菌已成为医院感染的主要病原菌之一，其感染范围广泛，涵盖皮肤、口腔、呼吸道、消化道、泌尿生殖道等多个部位，严重威胁患者的健康和生命安全。白假丝酵母菌感染不仅会导致局部的炎症反应，如皮肤和黏膜炎症，出现红肿、瘙痒、疼痛等症状，长期不治疗还可能引发慢性炎症，影响生活质量；在免疫系统功能低下的人群中，白假丝酵母菌还可能进入血液，引发系统性感染，导致白假丝酵母菌血症，出现发热、寒战、低血压等症状，甚至扩散至多个器官，如心脏、肾脏和大脑，导致器官功能衰竭，危及生命。在女性中，白假丝酵母菌感染常见的阴道假丝酵母菌病，会出现阴道瘙痒、灼热感和异常分泌物，严重影响日常生活和性生活质量，反复感染还可能导致慢性炎症，增加不孕风险；男性也可能因白假丝酵母菌感染出现龟头炎，影响生殖健康。此外，白假丝酵母菌感染消化系统，尤其是口腔和食道，会导致吞咽困难、食欲下降、胸痛等症状，长期感染还可能影响营养吸收，导致体重下降和免疫力进一步下降。近年来，随着广谱抗生素、免疫抑制剂、激素、抗肿瘤药物的广泛应用，以及各种侵入性医疗操作的增加，白假丝酵母菌感染的发病率呈不断上升趋势，给临床治疗带来了巨大挑战。传统的抗真菌药物在治疗白假丝酵母菌感染时，往往面临着耐药性的问题，使得治疗效果大打折扣。其中，生物膜的形成是白假丝酵母菌耐药的重要机制之一。生物膜是微生物为适应生存环境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一种特殊结构，由微生物和自身分泌的胞外基质组成。在生物膜中，存在着一种特殊的休眠状态菌体——滞留菌（persistercells）。滞留菌具有独特的生物学特性，它们无基因序列改变，属于表型变异细胞，在休眠状态下几乎所有生命活动基本处于暂停状态，对几乎所有药物均有良好的耐受性，且耐受性不会遗传给细菌细胞子代。在药物作用下，滞留菌进入静止状态，不参与繁殖过程，经收集再培养后，耐药特征基本消失，最低抑菌浓度无明显改变。生物膜中滞留菌的存在，使得白假丝酵母菌感染难以彻底治愈，容易导致慢性感染和复发。例如，在呼吸道感染中，白假丝酵母菌生物膜中的滞留菌能够抵抗抗生素的作用，持续存在于呼吸道内，引发反复的咳嗽、咳痰等症状，严重影响患者的呼吸功能；在泌尿系统感染中，滞留菌可附着于尿道黏膜表面，形成生物膜，导致尿频、尿急、尿痛等症状反复发作，给患者带来极大的痛苦。因此，深入研究白假丝酵母菌生物膜中滞留菌的形成机制，对于揭示白假丝酵母菌的耐药机制，开发新的抗真菌治疗策略，提高临床治疗效果具有重要的理论意义和实际应用价值。通过对滞留菌形成的动态监测，可以更好地了解其形成过程和规律，为针对性地干预提供依据；而对相关基因的筛选和研究，则有助于深入揭示滞留菌的耐药机制，为寻找新的药物靶点和治疗方法奠定基础。1.2白假丝酵母菌生物膜概述白假丝酵母菌细胞呈圆形或卵圆形，类似酵母菌，直径通常在3-6μm之间，比葡萄球菌大5-6倍，革兰氏染色呈阳性，但着色并不均匀，以出芽方式进行繁殖。在正常情况下，白假丝酵母菌呈卵圆形，与机体处于共生平衡状态，不会引发疾病。然而，当机体的正常防御功能受到破坏，例如经历创伤、使用抗生素导致菌群失调、应用细胞毒药物致使黏膜屏障功能改变、使用皮质激素、出现营养失调或免疫功能缺陷等情况时，白假丝酵母菌会从酵母相转变为菌丝相。在病灶材料中，常常能观察到真菌细胞出芽生成假菌丝，这些假菌丝长短不一且无分枝，假菌丝收缩断裂后又会成为芽生的菌体细胞。在细胞涂片或组织切片中，发现假菌丝是判断白假丝酵母菌感染的关键证据。生物膜作为微生物的一种特殊存在形式，在白假丝酵母菌的感染过程中扮演着至关重要的角色。白假丝酵母菌生物膜的形成是一个复杂而有序的动态过程，一般可细分为五个主要阶段。首先是黏附期，浮游状态的白假丝酵母菌细胞通过其表面的黏附素等物质，识别并结合到宿主组织或生物医学材料表面。这些黏附素能够与宿主细胞表面的受体特异性结合，从而实现白假丝酵母菌的初始黏附，此阶段是生物膜形成的起始关键步骤。随后进入生长期，已黏附的白假丝酵母菌细胞开始大量繁殖，分泌胞外多糖、蛋白质和核酸等物质，逐渐形成细胞外基质。这些胞外物质相互交织，为白假丝酵母菌细胞提供了一个保护性的微环境，同时也促进了细胞之间的相互聚集和连接。接着是微菌落融合形成生物膜阶段，随着白假丝酵母菌细胞的不断增殖，微菌落逐渐增多并相互靠近，最终融合在一起，形成具有一定厚度和结构的生物膜。在生物膜的成熟期，生物膜结构更加致密和稳定，形成了复杂的三维结构，内部包含有通道和空隙，用于物质的运输和交换。最后是播散期，部分生物膜中的白假丝酵母菌细胞会脱离生物膜，重新进入浮游状态，这些游离的细胞可以随着体液循环等途径，扩散到其他部位，引发新的感染。成熟的白假丝酵母菌生物膜在结构上呈现出高度的复杂性和有序性，是一个由微生物细胞和丰富的胞外基质组成的有机整体。在这个结构中，白假丝酵母菌细胞以多种形态存在，包括酵母细胞、假菌丝和菌丝等，它们相互交织，形成了一个立体的网络结构。胞外基质则主要由多糖、蛋白质和核酸等大分子物质构成，这些物质不仅为白假丝酵母菌细胞提供了物理支撑，还在生物膜的耐药性、免疫逃避等方面发挥着重要作用。多糖成分可以形成一种黏性的屏障，阻碍抗生素等药物的渗透，使得药物难以到达生物膜内部的菌体细胞；蛋白质和核酸等物质则参与了生物膜内部的信号传递和代谢调控等过程，维持着生物膜的正常生理功能。此外，生物膜中还存在着一些微小的通道和空隙，这些结构类似于人体的血管和淋巴管，被称为“水通道”。它们在生物膜内部物质运输和代谢产物排出中起着关键作用，能够确保生物膜内的细胞获得充足的营养物质，同时及时排出代谢废物，维持生物膜的内环境稳定。在感染过程中，白假丝酵母菌生物膜的存在使得感染的治疗变得异常棘手。一方面，生物膜中的滞留菌处于休眠状态，几乎所有生命活动基本暂停，对几乎所有药物都具有良好的耐受性，这使得传统的抗真菌药物难以发挥作用。滞留菌在药物作用下会进入静止状态，不参与繁殖过程，即便药物作用时间延长，也难以将其彻底清除。而且，滞留菌的耐受性不会遗传给子代细胞，经收集再培养后，其耐药特征基本消失，最低抑菌浓度无明显改变，但在适宜条件下，它们又可以重新恢复活性，继续引发感染。另一方面，生物膜的结构特点也为白假丝酵母菌提供了物理保护屏障。生物膜的胞外基质可以阻挡药物的渗透，降低药物在生物膜内部的有效浓度，使得药物难以接触到生物膜深层的菌体细胞。此外，生物膜中的菌体细胞之间存在着复杂的信号传递和群体感应机制，它们能够相互协作，共同应对外界环境的变化，进一步增强了生物膜对药物的抵抗能力。1.3滞留菌的研究现状滞留菌这一概念最早于1944年由JosephBigger教授提出，当时他在应用青霉素类药物治疗葡萄球菌感染患者时，发现微生物群体中始终存在约1.0％的幸存细胞。这些幸存细胞在收集再治疗后，仍有一定比例存活，为了与因基因突变所致的耐药菌区分开来，滞留菌的概念由此诞生。随着研究的不断深入，国内外学者几乎在所有致病微生物中都发现了滞留菌的存在，这使得滞留菌成为微生物学和感染病学领域的研究热点之一。滞留菌具有一系列独特的生物学特性。从基因层面来看，滞留菌无基因序列改变，属于表型变异细胞。这意味着它们的耐药性并非源于遗传物质的改变，而是在特定环境下表现出的一种适应性变化。在生理状态上，滞留菌处于休眠状态，几乎所有生命活动基本暂停。这种休眠状态使得它们对几乎所有药物都具有良好的耐受性，能够在药物的作用下存活下来。与传统耐药菌不同，滞留菌的耐受性不会遗传给子代细胞。这表明滞留菌的耐药现象是一种可逆的、非遗传性的特征，当药物作用消除后，经收集再培养的滞留菌耐药特征基本消失，最低抑菌浓度无明显改变。在药物作用下，滞留菌会进入静止状态，不参与繁殖过程。这使得传统的抗菌药物难以对其发挥作用，因为大多数抗菌药物是针对细菌的生长和繁殖过程来设计的。白假丝酵母菌滞留菌与细菌滞留菌在多个方面存在显著区别。在细胞结构方面，白假丝酵母菌作为真菌，具有典型的真核细胞结构，拥有细胞核、线粒体等细胞器，其细胞壁主要由葡聚糖、几丁质等成分构成；而细菌属于原核生物，没有真正的细胞核，细胞壁成分也与白假丝酵母菌不同，例如革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖组成，革兰氏阴性菌则具有外膜结构。在生理特性上，白假丝酵母菌的生长和代谢方式与细菌也有所差异。白假丝酵母菌在有氧和无氧条件下都能生存，其代谢途径更为复杂，能够利用多种碳源和氮源；而细菌的代谢类型相对较为单一，对环境条件的要求也各不相同。在耐药机制方面，虽然两者都存在对药物的耐受性，但具体机制有所不同。白假丝酵母菌滞留菌的耐药可能与生物膜的形成、药物外排泵的活性改变、细胞壁结构的变化以及代谢途径的调整等多种因素有关；细菌滞留菌的耐药机制则更多地涉及毒素-抗毒素系统、双组分信号转导系统、群体感应系统等的调控。尽管目前对滞留菌的研究取得了一定进展，但仍存在诸多不足。在形成机制方面，虽然已经提出了一些可能的影响因素，如毒素-抗毒素系统、双组分信号转导系统、群体感应系统等，但这些因素之间的相互作用以及它们如何协同调控滞留菌的形成，目前还不完全清楚。对于白假丝酵母菌生物膜中滞留菌的形成过程，各个阶段的具体分子事件和调控网络仍有待进一步深入研究。在检测方法上，现有的检测技术还存在一定的局限性。传统的培养方法难以准确检测出低含量的滞留菌，因为滞留菌在常规培养条件下生长缓慢或不生长；而一些新兴的检测技术，如流式细胞术、荧光原位杂交技术等，虽然具有较高的灵敏度和特异性，但操作复杂、成本较高，难以在临床和大规模研究中广泛应用。在临床治疗方面，由于对滞留菌的特性和耐药机制了解有限，目前缺乏有效的针对滞留菌的治疗策略。传统的抗真菌药物难以清除滞留菌，这导致白假丝酵母菌感染容易复发和转为慢性感染，给患者的健康带来了严重威胁。因此，进一步深入研究滞留菌的形成机制、开发更加有效的检测方法以及探索新的治疗策略，是当前亟待解决的问题。二、白假丝酵母菌生物膜中滞留菌形成的动态监测2.1实验材料与方法2.1.1实验材料白假丝酵母菌标准菌株（ATCC90028）购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。该菌株是国际上广泛认可和使用的标准菌株，具有明确的生物学特性和遗传背景，在众多关于白假丝酵母菌的研究中被选用，为实验结果的准确性和可重复性提供了有力保障。培养基选用RPMI1640培养基（含L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠），购自Gibco公司。RPMI1640培养基是一种广泛应用于细胞培养的基础培养基，其成分经过优化，能够为白假丝酵母菌的生长提供丰富的营养物质，包括多种氨基酸、维生素、糖类等，满足白假丝酵母菌在不同生长阶段的需求。新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，其富含多种生长因子和营养成分，能够促进白假丝酵母菌的生长和繁殖，提高生物膜的形成效率。抗真菌药物两性霉素B（AmB）购自Sigma公司，其作为临床上常用的一线抗真菌药物，对多种真菌具有强大的抗菌活性，作用机制主要是通过与真菌细胞膜上的麦角固醇结合，破坏细胞膜的完整性，导致细胞内容物泄漏，从而达到杀菌的目的。在本实验中，两性霉素B被用于诱导滞留菌的产生，以研究白假丝酵母菌生物膜中滞留菌的形成动态。主要仪器包括CO₂培养箱（ThermoScientific），其能够精确控制培养环境的温度、湿度和CO₂浓度，为白假丝酵母菌的生长提供稳定的培养条件；酶标仪（BioTek），用于检测生物膜中真菌细胞的数量和活性；激光共聚焦显微镜（LeicaTCSSP8），具备高分辨率和高灵敏度，能够对生物膜的结构和组成进行三维成像，直观地观察生物膜的形态变化以及滞留菌在生物膜中的分布情况。2.1.2体外生物膜模型构建从-80℃冰箱中取出冻存的白假丝酵母菌标准菌株，在无菌条件下，将其接种于含10%新生牛血清的RPMI1640液体培养基中，置于37℃、5%CO₂培养箱中振荡培养24h，使菌株复苏并进入对数生长期。用无菌生理盐水将培养好的菌液进行梯度稀释，调整菌液浓度至1×10⁶CFU/mL。使用血细胞计数板在显微镜下进行计数，确保菌液浓度的准确性。将96孔细胞培养板用无菌PBS冲洗3次，以去除杂质和可能存在的微生物。向每孔中加入100μL调整好浓度的菌液，同时设置空白对照组，加入等体积的含10%新生牛血清的RPMI1640培养基。将培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育2h，使白假丝酵母菌细胞能够充分黏附在培养板表面。孵育结束后，用无菌PBS轻轻冲洗培养板3次，以去除未黏附的浮游细胞。向每孔中加入200μL含10%新生牛血清的RPMI1640培养基，继续在37℃、5%CO₂培养箱中培养，分别在培养3h、6h、9h、12h、24h、48h时，取出培养板进行后续实验。2.1.3滞留菌计数方法在不同培养时间点，取出96孔培养板，将孔内培养基吸出，用无菌PBS冲洗3次，以去除浮游细胞和代谢产物。向每孔中加入200μL浓度为2μg/mL的两性霉素B溶液，使其终浓度为1μg/mL，然后将培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育24h，以诱导滞留菌的产生。孵育结束后，吸出两性霉素B溶液，用无菌PBS冲洗3次，去除残留的药物。向每孔中加入200μL无菌PBS，用移液器反复吹打，使生物膜中的真菌细胞脱落并分散成单细胞悬液。将单细胞悬液进行10倍梯度稀释，分别取10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶三个稀释度的菌液各100μL，均匀涂布于含10%新生牛血清的RPMI1640固体培养基平板上，每个稀释度设置3个重复。将平板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养48h，待菌落长出后，统计平板上的菌落数。根据公式：每毫升菌液中的菌落形成单位（CFU/mL）=同一稀释度三个平板上的菌落平均数×稀释倍数×10，计算出生物膜加药前后真菌细胞和滞留菌的数量。2.1.4激光共聚焦显微镜观察在不同培养时间点，取出96孔培养板，将孔内培养基吸出，用无菌PBS冲洗3次。向每孔中加入200μL含10%新生牛血清的RPMI1640培养基，再加入1μL浓度为1mg/mL的SYTO9和1μL浓度为1mg/mL的碘化丙啶（PI）染液，使其终浓度分别为5μM和5μM。将培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中避光孵育15min，使染液能够充分进入真菌细胞。孵育结束后，用无菌PBS冲洗3次，去除未结合的染液。将96孔培养板置于激光共聚焦显微镜载物台上，选择合适的物镜和激发光波长进行观察。SYTO9能够标记所有的活细胞，使其发出绿色荧光；PI只能进入细胞膜受损的死细胞，使其发出红色荧光。通过调节显微镜的焦距和扫描参数，获取生物膜的二维和三维图像。利用显微镜自带的分析软件，对生物膜的厚度、细胞密度、活菌与死菌的比例等参数进行分析，以观察生物膜的形态变化以及滞留菌在生物膜中的分布情况。2.2实验结果2.2.1真菌细胞繁殖与滞留菌产生动态通过CFU计数法，对不同时间段白假丝酵母菌生物膜加药前真菌细胞繁殖数目及加药后滞留菌产生数目进行统计，结果如图1所示。在生物膜形成初期，即0-3h，真菌细胞数量增长较为缓慢，从最初接种的1×10⁶CFU/mL增长至2×10⁶CFU/mL左右，这是因为白假丝酵母菌细胞需要时间适应新的环境并开始黏附到培养板表面。在3-12h，真菌细胞进入快速繁殖阶段，数量呈指数增长，到12h时达到约1×10⁷CFU/mL，此时生物膜内的营养物质丰富，环境适宜，有利于真菌细胞的生长和分裂。12h后，真菌细胞繁殖数目逐渐趋于稳定，维持在1×10⁷-1.2×10⁷CFU/mL之间，这可能是由于生物膜内的营养物质逐渐消耗，空间有限，以及代谢产物的积累等因素限制了真菌细胞的进一步繁殖。对于滞留菌的产生，在加药处理后，0.5h时就检测到大量滞留菌的产生，其数量达到约1×10⁴CFU/mL。随着时间的推移，滞留菌数目在2h内迅速增加，到2h时已基本稳定，达到约5×10⁴CFU/mL。此后，在2-48h的时间段内，滞留菌数目没有明显变化，维持在相对稳定的水平。这表明白假丝酵母菌生物膜中滞留菌的产生主要发生在生物膜形成的早期阶段，且在短时间内就能达到相对稳定的数量。图1不同时间段生物膜中真菌细胞繁殖和滞留菌产生数目变化2.2.2生物膜形态变化利用激光共聚焦显微镜对不同阶段白假丝酵母菌生物膜的形态进行观察，结果如图2所示。在生物膜形成的初期（3h），白假丝酵母菌细胞主要以单个或少数聚集的形式存在，呈散点状分布在培养板表面，此时生物膜尚未形成明显的结构。随着培养时间的延长至6h，白假丝酵母菌细胞开始大量繁殖并相互聚集，形成一些小的微菌落，微菌落之间通过少量的胞外基质相互连接，生物膜逐渐呈现出不规则的网状结构。到9h时，微菌落进一步融合，生物膜的结构更加致密，厚度也有所增加，内部开始出现一些空隙和通道，这可能是生物膜内物质运输和代谢的重要通道。12h时，生物膜已基本成熟，形成了典型的三维结构，由大量的真菌细胞和丰富的胞外基质组成，呈现出明显的分层现象，表面较为光滑，内部结构复杂。在48h时，生物膜的结构更加稳定，厚度进一步增加，内部的空隙和通道更加明显，形成了一个完整的生态系统。通过对激光共聚焦显微镜图像的分析，还可以观察到滞留菌在生物膜中的分布情况。在生物膜形成的早期，滞留菌主要分布在生物膜的表面和微菌落的边缘，随着生物膜的成熟，滞留菌逐渐分散到生物膜的内部，均匀分布在真菌细胞之间。这表明滞留菌的分布与生物膜的形成和发展密切相关，在生物膜的不同阶段，滞留菌的分布也会发生相应的变化。图2激光共聚焦显微镜下不同阶段生物膜的形态（绿色为活细胞，红色为死细胞）2.3结果分析与讨论2.3.1滞留菌形成特点从实验结果来看，白假丝酵母菌生物膜中滞留菌的形成具有明显的特点。在产生时间方面，加药处理后0.5h就检测到大量滞留菌的产生，这表明滞留菌能够在短时间内迅速形成。在生物膜形成初期，环境因素的变化，如抗真菌药物的作用，能够快速诱导滞留菌的产生。这可能是白假丝酵母菌为了应对不利环境，部分细胞迅速进入休眠状态，转变为滞留菌，以提高生存几率。在2h内，滞留菌数目迅速增加并基本稳定，这说明滞留菌的形成在短时间内就达到了一个相对稳定的状态。在这个阶段，生物膜内的细胞可能通过某种信号传递机制，协调部分细胞转变为滞留菌，以适应药物的压力。此后，在2-48h的时间段内，滞留菌数目没有明显变化，维持在相对稳定的水平。这表明一旦滞留菌形成并达到稳定状态，它们在生物膜内能够保持相对稳定的数量，不易受到生物膜后续生长和环境因素的影响。与生物膜形成阶段的关系上，滞留菌的产生主要发生在生物膜形成的早期阶段。在生物膜形成初期，真菌细胞数量增长迅速，此时生物膜结构尚未成熟，细胞间的相互作用和信号传递相对简单。在这个阶段，抗真菌药物的作用更容易诱导部分细胞发生表型变异，形成滞留菌。随着生物膜的逐渐成熟，其结构变得更加复杂，细胞间的相互作用和信号传递网络更加完善。生物膜内的细胞可能通过群体感应等机制，共同应对药物的压力，使得滞留菌的形成不再像早期那样容易受到外界因素的影响。滞留菌的形成与生物膜内真菌细胞的生长状态密切相关。在真菌细胞快速繁殖阶段，细胞代谢活跃，对环境变化更为敏感，此时更容易产生滞留菌。当真菌细胞繁殖数目趋于稳定后，细胞代谢活动相对稳定，滞留菌的产生也相应减少。2.3.2影响滞留菌形成的因素生物膜结构对滞留菌形成有着重要影响。在生物膜形成初期，白假丝酵母菌细胞主要以单个或少数聚集的形式存在，此时生物膜尚未形成明显的保护结构。抗真菌药物能够直接作用于细胞，容易诱导细胞发生表型变异，形成滞留菌。随着生物膜的发展，微菌落逐渐形成并融合，生物膜的结构变得更加致密，胞外基质增多。这些胞外基质可以作为物理屏障，阻碍药物的渗透，使得药物难以到达生物膜内部的细胞，从而减少了滞留菌的产生。生物膜内部的空隙和通道结构也会影响滞留菌的形成。这些结构有利于物质的运输和代谢产物的排出，维持生物膜内环境的稳定。当生物膜内环境稳定时，细胞不需要大量转变为滞留菌来应对环境压力；而当生物膜内环境受到破坏，如药物作用导致营养物质缺乏、代谢产物积累等，细胞可能会更多地转变为滞留菌。细胞生理状态也是影响滞留菌形成的关键因素。在对数生长期，真菌细胞代谢活跃，需要大量的营养物质和能量来支持细胞的生长和分裂。此时，细胞对环境变化更为敏感，抗真菌药物的作用容易干扰细胞的正常代谢过程，导致部分细胞进入休眠状态，形成滞留菌。当细胞进入稳定期后，代谢活动相对稳定，细胞对环境变化的适应能力增强，滞留菌的产生也相应减少。细胞的应激反应也与滞留菌的形成密切相关。当细胞受到抗真菌药物等外界压力时，会启动一系列应激反应机制，如激活某些信号通路、调节基因表达等。这些应激反应可能会导致细胞生理状态的改变，从而促使细胞转变为滞留菌。例如，细胞内的毒素-抗毒素系统在受到药物刺激时，可能会被激活，导致毒素的释放，进而诱导细胞进入休眠状态，形成滞留菌。三、白假丝酵母菌生物膜中滞留菌相关基因的筛选方法3.1SSH技术原理与应用抑制性消减杂交（SuppressionSubtractiveHybridization，SSH）技术，是一种高效筛选差异表达基因的分子生物学方法，由Diatchenko等在1996年首次提出。其原理基于抑制性PCR和消减杂交技术，能够有效分离出两种细胞或组织之间差异表达的基因。SSH技术的操作流程较为复杂，涉及多个关键步骤。首先是总RNA的提取和mRNA的分离。从实验组（Tester）和对照组（Driver）细胞或组织中提取高质量的总RNA，然后通过oligo(dT)磁珠等方法分离出mRNA，为后续的cDNA合成提供模板。接着进行cDNA的合成与酶切。以分离得到的mRNA为模板，利用反转录酶合成cDNA，随后用识别4碱基序列的限制性内切酶（如RsaI、HaeIII等）对cDNA进行酶切，将其切割成平均长度为256bp左右的片段，这些片段代表了基因的表达信息。酶切后的cDNA片段需要进行接头连接。将实验组cDNA酶切片段平均分成两份，分别连接上不同的接头（Adapter1和Adapter2R），接头由一段长链和一段短链组成，长链的5'端和3'端分别含有不同的酶切位点，短链则与长链部分互补配对。连接接头后的cDNA片段便具备了进行后续反应的条件。随后是两轮消减杂交和抑制性PCR。第一轮杂交中，将过量的DrivercDNA与分别连接了不同接头的TestercDNA混合，在一定条件下进行杂交反应。由于DrivercDNA过量，TestercDNA中与DrivercDNA相同的序列会优先杂交形成双链，而差异表达的序列则以单链形式存在。接着进行第二轮杂交，将第一轮杂交后的两份产物混合，再加入新的变性DrivercDNA进行杂交。这一轮杂交进一步富集了差异表达的序列，同时形成了两端分别带有不同接头的双链cDNA，这些双链cDNA便是差异表达基因的片段。最后，利用抑制性PCR对差异表达的双链cDNA进行扩增。由于接头的特殊结构，在PCR反应中，两端带有相同接头的非特异性双链cDNA会形成“锅柄状”结构，无法作为模板进行扩增，而两端带有不同接头的差异表达双链cDNA则能够被特异性扩增，从而得到大量的差异表达基因片段。SSH技术在筛选差异表达基因方面具有显著优势。它能够有效降低假阳性率。通过两轮消减杂交和抑制性PCR，能够特异性地富集差异表达基因，减少非特异性扩增，使得最终得到的差异表达基因片段更加准确可靠。与其他筛选差异表达基因的技术（如mRNA差异展示技术）相比，SSH技术的假阳性率可降低至5%-10%左右。SSH技术具有较高的灵敏度。能够检测到低丰度表达的差异基因，即使是在表达量差异较小的情况下，也能有效地将其筛选出来。在研究细胞生理状态变化或疾病发生发展过程中，一些低丰度表达的基因可能起着关键作用，SSH技术能够为这些基因的发现提供有力支持。SSH技术还具有操作相对简便、所需起始材料较少等优点。一般只需几微克的总RNA即可进行实验，这使得在样本来源有限的情况下，也能够开展差异表达基因的筛选工作。SSH技术在生物医学研究领域得到了广泛应用。在肿瘤研究中，通过SSH技术可以筛选出肿瘤细胞与正常细胞之间差异表达的基因，为肿瘤的早期诊断、治疗和预后评估提供新的靶点和标志物。在病毒感染机制研究中，利用SSH技术可以分析病毒感染细胞与未感染细胞之间的基因表达差异，深入了解病毒感染过程中的分子事件和宿主细胞的免疫应答机制。在微生物耐药机制研究方面，SSH技术也发挥着重要作用。通过比较耐药菌株与敏感菌株之间的基因表达差异，可以揭示微生物耐药的分子机制，为开发新的抗菌药物和治疗策略提供理论依据。3.2实验材料与方法3.2.1实验材料构建cDNA消减文库所需的主要试剂包括Trizol试剂（Invitrogen公司），用于从浮游状态和2h生物膜状态白假丝酵母菌中提取总RNA。该试剂能够迅速裂解细胞，同时保持RNA的完整性，通过酚-氯仿抽提等步骤，可有效去除蛋白质、DNA等杂质，获得高质量的总RNA。mRNA分离试剂盒（Qiagen公司），利用oligo(dT)磁珠特异性结合mRNA的poly(A)尾，从而实现从总RNA中高效分离出mRNA。用于cDNA合成的M-MLV反转录酶（Promega公司），具有高效的反转录活性，能够以mRNA为模板合成cDNA第一链。该酶在反转录过程中，能够准确地将mRNA的遗传信息转化为cDNA，为后续的实验提供可靠的模板。dNTPs（TaKaRa公司），包含四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），是cDNA合成过程中不可或缺的原料。用于消减杂交的抑制性消减杂交试剂盒（Clontech公司），该试剂盒提供了一系列的试剂和操作步骤，能够有效地进行cDNA的消减杂交，富集差异表达基因。其中包含的接头、引物等试剂，经过优化设计，能够提高消减杂交的效率和特异性。克隆载体pMD18-TVector（TaKaRa公司），该载体具有多克隆位点、氨苄青霉素抗性基因等元件，便于将差异表达基因片段克隆到载体中，并进行后续的筛选和鉴定。感受态细胞DH5α（TaKaRa公司），具有较高的转化效率，能够高效摄取外源DNA，将重组质粒导入其中，实现基因的扩增和表达。3.2.2总RNA提取与mRNA分离取处于对数生长期的浮游状态白假丝酵母菌和培养2h的生物膜状态白假丝酵母菌，分别收集菌体。向菌体中加入1mlTrizol试剂，充分裂解细胞，室温静置5min，使核酸蛋白复合物完全解离。加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min，然后在4℃、12000rpm条件下离心15min。此时，溶液会分为三层，上层为无色透明的水相，含有RNA；中间层为白色的蛋白质层；下层为红色的有机相。将上层水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min，使RNA沉淀。在4℃、12000rpm条件下离心10min，弃上清，可见管底有白色的RNA沉淀。用75%乙醇洗涤RNA沉淀两次，每次在4℃、7500rpm条件下离心5min，弃上清。将RNA沉淀晾干，加入适量的DEPC水溶解，测定RNA的浓度和纯度。使用mRNA分离试剂盒分离mRNA。将提取的总RNA加入到含有oligo(dT)磁珠的结合缓冲液中，在65℃条件下孵育5min，使mRNA的poly(A)尾与oligo(dT)磁珠充分结合。然后将混合物置于磁力架上，使磁珠吸附在管壁上，弃去上清。用洗涤缓冲液洗涤磁珠三次，去除未结合的杂质。最后，用洗脱缓冲液在70℃条件下孵育5min，将mRNA从磁珠上洗脱下来，得到纯化的mRNA。3.2.3cDNA合成与消减杂交以分离得到的mRNA为模板，使用M-MLV反转录酶合成cDNA第一链。在反应体系中加入5×M-MLVBuffer4μl、dNTPs（10mmol/L）2μl、Oligo(dT)18Primer（50μmol/L）1μl、M-MLV反转录酶（200U/μl）1μl、RNA酶抑制剂（40U/μl）1μl、mRNA（1μg/μl）2μl，用DEPC水补足至20μl。将反应体系在42℃条件下孵育1h，然后70℃加热10min终止反应，得到cDNA第一链。以cDNA第一链为模板，使用DNA聚合酶合成cDNA第二链。在反应体系中加入10×PCRBuffer5μl、dNTPs（10mmol/L）4μl、DNA聚合酶（5U/μl）1μl、cDNA第一链2μl，用ddH₂O补足至50μl。将反应体系在16℃条件下孵育2h，然后72℃加热10min终止反应，得到双链cDNA。用RsaI酶对双链cDNA进行酶切，将其切割成平均长度为256bp左右的片段。酶切反应体系为：双链cDNA10μl、10×RsaIBuffer2μl、RsaI酶（10U/μl）1μl，用ddH₂O补足至20μl。在37℃条件下孵育2h，使酶切反应充分进行。将酶切后的实验组cDNA平均分成两份，分别连接上不同的接头（Adapter1和Adapter2R）。连接反应体系为：酶切后的cDNA5μl、10×LigationBuffer2μl、Adapter1或Adapter2R（10μmol/L）1μl、T4DNA连接酶（3U/μl）1μl，用ddH₂O补足至20μl。在16℃条件下孵育过夜，使接头与cDNA片段充分连接。进行两轮消减杂交。第一轮杂交中，将过量的对照组（浮游状态白假丝酵母菌）cDNA与分别连接了不同接头的实验组（2h生物膜状态白假丝酵母菌）cDNA混合，在一定条件下进行杂交反应。反应体系为：连接了Adapter1的实验组cDNA1μl、连接了Adapter2R的实验组cDNA1μl、对照组cDNA1μl、2×杂交缓冲液5μl，用ddH₂O补足至10μl。将反应体系在98℃条件下变性2min，然后68℃孵育8h。第二轮杂交中，将第一轮杂交后的两份产物混合，再加入新的变性对照组cDNA进行杂交。反应体系为：第一轮杂交产物1μl、第一轮杂交产物2μl、新的变性对照组cDNA1μl、2×杂交缓冲液5μl，用ddH₂O补足至10μl。将反应体系在98℃条件下变性2min，然后68℃孵育16h。通过两轮消减杂交，富集了差异表达的cDNA片段。3.2.4克隆扩增与重组质粒鉴定将消减杂交后的产物进行抑制性PCR扩增。PCR反应体系为：消减杂交产物1μl、10×PCRBuffer5μl、dNTPs（10mmol/L）4μl、引物1（10μmol/L）1μl、引物2（10μmol/L）1μl、TaqDNA聚合酶（5U/μl）1μl，用ddH₂O补足至50μl。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸1.5min，共27个循环；最后72℃延伸10min。通过抑制性PCR，特异性地扩增差异表达的cDNA片段。将扩增后的差异表达基因片段与pMD18-TVector进行连接。连接反应体系为：PCR产物4μl、pMD18-TVector1μl、SolutionI5μl。在16℃条件下孵育过夜，使基因片段与载体充分连接。将连接产物转化到感受态细胞DH5α中。将感受态细胞从-80℃冰箱取出，冰上解冻。加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰上静置30min。然后在42℃水浴中热激90s，迅速冰浴2min。加入900μl不含氨苄青霉素的LB液体培养基，在37℃、150rpm条件下振荡培养1h，使细菌复苏。将培养后的菌液涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。挑取平板上的单菌落，接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。提取重组质粒，使用PCR方法对重组质粒进行鉴定。PCR反应体系为：重组质粒1μl、10×PCRBuffer5μl、dNTPs（10mmol/L）4μl、M13引物（10μmol/L）1μl、TaqDNA聚合酶（5U/μl）1μl，用ddH₂O补足至50μl。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若出现预期大小的条带，则表明重组质粒构建成功。3.2.5测序与序列分析挑选PCR鉴定为阳性的重组质粒，送测序公司进行测序。将测得的序列在GenBank数据库中进行BLAST同源性比较。通过比较，确定差异表达基因与已知基因的同源性，分析其可能的功能。若发现与已知基因同源性较高的序列，则可以根据已知基因的功能，推测该差异表达基因的功能。对于同源性较低或无同源性的序列，可能是新的基因，需要进一步进行功能验证和研究。3.3实验结果3.3.1消减文库质量评估通过对构建的消减文库进行一系列检测，以评估其质量。对文库中随机挑选的100个克隆进行PCR扩增，结果显示，插入片段大小在200-1000bp之间，平均长度约为500bp，这与预期的差异表达基因片段大小相符，表明酶切和连接等步骤操作较为成功，能够有效获得合适长度的差异表达基因片段。重组率是衡量文库质量的重要指标之一。经检测，文库的重组率高达95%。这意味着文库中绝大多数克隆都含有插入的差异表达基因片段，能够为后续的基因筛选和分析提供丰富的素材，有效减少了无插入片段克隆的干扰，提高了筛选效率。文库容量是指文库中包含的独立克隆数，它反映了文库涵盖差异表达基因的全面性。本实验构建的消减文库容量为1×10⁶CFU/mL，这表明文库具有较大的规模，能够较好地覆盖浮游状态和2h生物膜状态白假丝酵母菌之间的差异表达基因，为深入研究滞留菌相关基因提供了有力保障。3.3.2差异表达基因筛选结果经过严格的筛选和鉴定，从消减文库中成功筛选出120个差异表达基因。这些基因在功能上具有多样性，大致可分为以下几类。与能量代谢相关的基因有15个，如编码己糖激酶的基因，其在生物膜状态下的表达量相较于浮游状态显著上调。己糖激酶是糖酵解途径中的关键酶，它能够催化葡萄糖磷酸化，为细胞代谢提供能量。在生物膜状态下，白假丝酵母菌可能需要更多的能量来维持其复杂的结构和生理功能，因此己糖激酶基因的上调表达有助于满足这一能量需求。与细胞应激反应相关的基因有20个，其中编码热休克蛋白70（Hsp70）的基因在生物膜状态下表达量明显增加。热休克蛋白是一类在细胞受到应激刺激时表达上调的蛋白质，它们能够帮助细胞维持蛋白质的正确折叠和功能，增强细胞对逆境的耐受性。在白假丝酵母菌生物膜形成过程中，可能会面临多种应激因素，如抗真菌药物的作用、营养物质的限制等，Hsp70基因的高表达表明生物膜状态下的细胞通过上调应激反应相关基因的表达来应对这些不利环境。与物质转运相关的基因有18个，例如编码药物外排泵的基因在生物膜状态下表达上调。药物外排泵能够将细胞内的药物排出体外，降低细胞内药物浓度，从而使细胞产生耐药性。在白假丝酵母菌生物膜中，药物外排泵基因的高表达可能是滞留菌耐药的重要机制之一，它们能够帮助滞留菌抵抗抗真菌药物的作用，维持自身的存活。部分关键基因的信息如下表所示：基因名称基因功能表达差异倍数（生物膜/浮游）HXK1编码己糖激酶，参与糖酵解2.5HSP70编码热休克蛋白70，参与细胞应激反应3.0ABC1编码药物外排泵，参与物质转运2.83.4结果分析与讨论3.4.1差异表达基因分析筛选出的120个差异表达基因与白假丝酵母菌生物膜中滞留菌的形成可能存在着紧密的关联。从能量代谢相关基因来看，己糖激酶基因在生物膜状态下的上调表达，表明生物膜中的白假丝酵母菌可能通过增强糖酵解途径来获取更多能量。这一现象与滞留菌的形成或许存在着内在联系，在生物膜形成过程中，部分细胞转变为滞留菌需要消耗能量，而增强的能量代谢途径能够为这一转变提供必要的能量支持。从细胞应激反应相关基因分析，热休克蛋白70基因的高表达显示生物膜状态下的细胞面临着多种应激因素。这些应激因素可能刺激细胞启动应激反应机制，促使部分细胞转变为滞留菌，以增强细胞对逆境的耐受性。热休克蛋白70可能在滞留菌形成过程中发挥着分子伴侣的作用，帮助细胞维持蛋白质的正确折叠和功能，确保滞留菌能够在休眠状态下保持基本的生理活性。物质转运相关基因中药物外排泵基因的上调表达，可能是滞留菌耐药的关键机制之一。药物外排泵能够将细胞内的抗真菌药物排出体外，降低细胞内药物浓度，从而使滞留菌对药物产生耐受性。在生物膜形成过程中，药物外排泵基因的高表达可能使得部分细胞更容易在药物作用下存活并转变为滞留菌。这些基因可能通过多种途径参与滞留菌的形成，如调节细胞代谢、改变细胞生理状态、增强细胞对药物的耐受性等。它们之间可能存在着复杂的相互作用和调控网络，共同影响着滞留菌的形成和生物学特性。3.4.2SSH技术的有效性与局限性在本研究中，SSH技术在筛选白假丝酵母菌生物膜中滞留菌相关差异表达基因方面表现出了一定的有效性。通过严格的实验操作和数据筛选，成功构建了高质量的消减文库，文库的插入片段大小、重组率和文库容量等指标均达到了预期标准。从文库中筛选出了120个差异表达基因，这些基因在功能上具有多样性，为深入研究滞留菌的形成机制提供了丰富的线索。SSH技术能够有效降低假阳性率，通过两轮消减杂交和抑制性PCR，特异性地富集了差异表达基因，减少了非特异性扩增，使得筛选出的差异表达基因更加准确可靠。SSH技术也存在一些局限性。实验操作较为复杂，涉及总RNA提取、mRNA分离、cDNA合成、酶切、接头连接、消减杂交、PCR扩增等多个步骤，每个步骤都需要严格控制实验条件，任何一个环节出现问题都可能影响实验结果的准确性。该技术对实验材料的质量要求较高，需要提取高质量的总RNA和mRNA，若实验材料受到污染或降解，会导致cDNA合成失败或质量下降，进而影响差异表达基因的筛选。SSH技术只能筛选出已知基因的差异表达情况，对于未知基因或新的转录本则难以检测。在研究过程中，可能会遗漏一些与滞留菌形成密切相关的新基因，限制了对滞留菌形成机制的全面了解。为了改进SSH技术，未来可以优化实验操作流程，开发更加简便、高效的实验方法，减少实验步骤和操作误差。可以结合其他技术，如高通量测序技术，对SSH技术筛选出的差异表达基因进行进一步验证和分析，同时也能够发现更多的未知基因和新的转录本，从而更全面地揭示白假丝酵母菌生物膜中滞留菌的形成机制。四、结论与展望4.1研究主要结论本研究通过对白假丝酵母菌生物膜中滞留菌形成的动态监测以及相关基因的初步筛选，得出以下主要结论：在白假丝酵母菌生物膜中滞留菌形成的动态监测方面，明确了滞留菌的形成特点。加药处理后0.5h就检测到大量滞留菌的产生，2h内滞留菌数目迅速增加并基本稳定，此后在2-48h的时间段内，滞留菌数目维持相对稳定。这表明滞留菌的形成主要集中在生物膜形成的早期阶段，且在短时间内就能达到相对稳定的数量。生物膜形态随着培养时间的延长呈现出明显的变化规律。从最初白假丝酵母菌细胞的单个或少数聚集，到逐渐形成微菌落并融合，最终形成成熟的三维结构生物膜。滞留菌的分布也与生物膜的形成和发展密切相关，在生物膜形成早期，滞留菌主要分布在生物膜表面和微菌落边缘，随着生物膜成熟，逐渐分散到生物膜内部。在白假丝酵母菌生物膜中滞留菌相关基因的筛选方面，成功运用SSH技术构建了浮游状态和2h生物膜状态白假丝酵母菌之间的cDNA消减文库。该文库质量优良，插入片段大小、重组率和文库容量等指标均符合预期，为后续基因筛选提供了坚实基础。从文库中筛选出120个差异表达基因，这些基因在功能上呈现多样性，涵盖能量代谢、细胞应激反应、物质转运等多个方面。己糖激酶基因在生物膜状态下上调表达，可能为滞留菌形成提供能量支持；热休克蛋白70基因表达量增加，表明细胞通过上调应激反应相关基因来应对逆境，可能与滞留菌形成有关；药物外排泵基因的上调表达，可能是滞留菌耐药的重要机制之一。4.2研究的创新点与不足本研究在方法和结论上具有一定创新点。在方法上，采用CFU计数法和激光共聚焦显微镜相结合的方式对白假丝酵母菌生物膜中滞留菌形成进行动态监测。CFU计数法能够准确统计不同时间段生物膜加药前真菌细胞繁殖数目及加药后滞留菌产生数目，为研究滞留菌形成动态提供量化数据；激光共聚焦显微镜则可以直观地观察生物膜形态变化以及滞留菌在生物膜中的分布情况，从微观层面揭示滞留菌与生物膜形成的关系。将抑制性消减杂交（SSH）技术应用于筛选白假丝酵母菌生物膜中滞留菌相关基因。SSH技术能够有效富集差异表达基因，降低假阳性率，为深入研究滞留菌形成机制提供了一种高效、准确的方法。在结论方面，明确了白假丝酵母菌生物膜中滞留菌形成的特点和动态变化规律。发现加药处理后0.5h就有大量滞留菌产生，2h内数目迅速增加并基本稳定，此后维持相对稳定，且滞留菌的形成主要集中在生物膜形成早期阶段。这一结论为进一步研究滞留菌的形成机制和防治策略提供了重要的理论依据。筛选出120个差异表达基因，这些基因涵盖能量代谢、细胞应激反应、物质转运等多个功能类别，为揭示滞留菌形成的分子机制提供了丰富线索。己糖激酶基因在生物膜状态下上调表达，可能为滞留菌形成提供能量支持，这为研究滞留菌的能量代谢机制开辟了新的方向。本研究也存在一些不足之处。在动态监测方面，仅选择了两性霉素B这一种抗真菌药物来诱导滞留菌的产生，药物种类相对单一。不同抗真菌药物的作用机制和对滞留菌的诱导效果可能存在差异，未来研究可以增加药物种类，以更全面地了解滞留菌的形成机制。在基因筛选方面，虽然运用SSH技术筛选出了一些差异表达基因，但SSH技术本身存在局限性。实验操作复杂，对实验材料质量要求高，且只能筛选已知基因的差异表达情况，对于未知基因或新的转录本难以检测。后续研究可以结合高通量测序等技术，对SSH技术筛选出的基因进行验证和补充，同时探索新的基因和转录本，以更全面地揭示滞留菌形成的分子机制。在研究深度上，对于筛选出的差异表达基因，仅进行了初步的功能分析，尚未深入研究这些基因在滞留菌形成过程中的具体作用机制和调控网络。未来需要进一步开展基因敲除、过表达等实验，深入探究这些基因的功能和作用机制。4.3未来研究方向基于本研究结果，未来可从以下几个方面展开深入研究。在滞留菌形成机制方面，进一步探究筛选出的差异表达基因之间的相互作用和调控网络。通过构建基因敲除或过表达的白假丝酵母菌菌株，研究这些基因对滞留菌形成的影响，明确它们在滞留菌形成过程中的具体作用机制。利用蛋白质组学、代谢组学等技术，全面分析生物膜中滞留菌形成过程中的蛋白质和代谢产物变化，深入了解滞留菌形成的分子机制和代谢途径。在基因功能验证方面，对筛选出的与能量代谢、细胞应激反应、物质转运等相关的关键基因，进行功能验证。通过基因编辑技术，如CRISPR-Cas9系统，精确敲除或过表达这些基因，观察白假丝酵母菌生物膜中滞留菌的形成情况、耐药性变化以及生物膜的结构和功能改变。开展动物实验，将基因编辑后的白假丝酵母菌感染动物模型，研究这些基因对感染过程和疾病进展的影响，为临床治疗提供更直接的实验依据。在抗真菌治疗方面，以筛选出的差异表达基因和相关信号通路为靶点，开发新的抗真菌药物或治疗策略。通过高通量药物筛选技术，寻找能够抑制滞留菌形成或增强滞留菌对传统抗真菌药物敏感性的化合物。探索联合治疗方案，将传统抗真菌药物与针对滞留菌的新型治疗方法相结合，提高治疗效果，减少白假丝酵母菌感染的复发率。五、参考文献[1]Dongari-BagtzoglouA,KashlevaH,DwivediP,etal.CharacterizationofmucosalCandidaalbicansbiofilms[J].PLoSOne,2009,4(11):e7967.[2]DantasAdaS,DayA,IkehM,etal.Oxidativestressresponsesinthehumanfungalpathogen,Candidaalbicans[J].Biomolecules,2015,5(1):142-165.[3]FraserSmithEB,EppsteinDA,LarsenMA,etal.ProtectiveeffectofamuramyldipeptideanalogencapsulatedinormixedwithliposomesagainstCandidaalbicansinfection[J].InfectImmun,1983,39(1):172-178.[4]BougnouxME,AanensenDM,MorandS,etal.MultilocussequencetypingofCandidaalbicans:strategies,dataexchangeandapplications[J].InfectGenetEvol,2004,4(3):243-252.[5]ChandraJ,KuhnDM,MukherjeePK,etal.BiofilmformationbythefungalpathogenCandidaalbicans:development,architecture,anddrugresistance[J].JBacteriol,2001,183(18):5385-5394.[6]AlDhaheriRS,DouglasLJ.AbsenceofamphotericinBtolerantpersistercellsinbiofilmsofsomeCandidaspecies[J].AntimicrobAgentsChemother,2008,52(5):1884-1887.[7]LongDY,HuSP,ChenXC,etal.Persistersandtheireffectsonmicrobialbiofilmtolerance:areview[J].ChinJApplEcol,2010,21(10):2707.[8]LiP,SeneviratneCJ,AlpiE,etal.DelicateMetaboliccontrolandcoordinatedstressresponsecriticallydetermineantifungaltoleranceofCandidaalbicansbiofilmpersisters[J].AntimicrobAgentsChemother,2015,59(10):1601-1612.[9]ChenX,ZhangM,ZhouC,etal.ControlofbacterialpersistercellsbyTrp/Argcontainingantimicrobialpeptides[J].ApplEnvironMicrobiol,2011,77(14):4878-4885.[10]SunJ,LiZ,ChuH,etal.CandidaalbicansamphotericinBTolerantpersisterformationiscloselyrelatedtosurfaceadhesion[J].Mycopathologia,2016,181(1/2):41-49.[11]JamalM,AhmadW,AndleebS,etal.Bacterialbiofilmandassociatedinfections[J].JChinMedAssoc,2018,81(1):7-11.[12]RamageG,SavilleSP,WickesBL,etal.InhibitionofCandidaalbicansbiofilmformationbyfarnesol,aquorumsensingmolecule[J].ApplEnvironMicrobiol,2002,68(11):5459-5463.[13]LafleurMD,KumamotoCA,LewisK.Candida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