课时4突破基因工程类大题

课时4突破基因工程类大题eq\a\vs4\al\co1()考情速览热点考情RT－RCR、实时荧光定量、PCR与反向PCR①2022·全国乙卷，38；②2022·江苏卷，24；①2020·江苏卷，33；②2020·山东卷，25PCR定点诱变技术①2023·辽宁卷，25；①2021·天津卷，16单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR检测①2024·黑吉辽卷，17、25；②2024·全国甲卷，38；③2024·河北卷，24；④2024·湖南卷，15；⑤2024·江西卷，12；⑥2024·浙江6月选考，19、20；①2023·山东卷，25；①2022·福建卷，13突破1基因工程的热考题型题型一限制酶的选择技巧(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点选择限制酶①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点，如图乙)(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)[例1](2023·新课标卷，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是()A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接答案C解析酶3切割后得到的是平末端，应该用T4DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA连接酶连接，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的重组表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。[例2](2023·湖北卷，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是()A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落答案D解析若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。[例3](2024·河北卷，22)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题：(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为____________启动子。Nos为终止子，其作用为________________________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。(2)利用________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测____________________，通过________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为________。选择纯合体进行后续研究的原因是________________________________________________________________________________________________________________________。(4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是________________________________________________________________________________________(答出两点即可)。答案(1)在胚乳中特异性表达的基因使转录在所需要的地方停下来HindⅢEcoRⅠ(2)农杆菌转化是否转录出mRNA抗原—抗体杂交(3)1/4纯合体自交后代不发生性状分离(4)体液细胞(5)水稻易于种植，容易获得疫苗；水稻的产量较高，能够获得大量的疫苗(合理即可)解析(1)若使r2HN仅在水稻胚乳中表达，则GtP应为在胚乳中特异性表达的基因启动子。终止子是基因下游的一端有特殊序列结构的DNA片段，使转录在所需要的地方停下来。r2HN应插入启动子GtP和终止子Nos之间，由于GtP中有限制酶KpnⅠ的识别序列，而SacⅠ的一个识别序列位于终止子之后，因此不能选择这两种限制酶切割，应选择HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN和载体进行酶切。(2)通常采用农杆菌转化法将目的基因导入水稻的愈伤组织。检测r2HN是否表达，可以采用PCR技术检测该基因是否转录出mRNA，通过抗原—抗体杂交技术检测是否翻译出相关蛋白质。(3)设r2HN为基因N，则单一位点插入目的基因的植株的基因型为Nn，其自交后代的基因型及比例为NN∶Nn∶nn＝1∶2∶1，r2HN纯合体植株的比例为1/4。纯合体自交后代不会发生性状分离，因此选择纯合体进行后续研究。(4)抗体参与体液免疫，CD8＋T细胞为细胞毒性T细胞，参与细胞免疫。分析题图，实验组的抗体水平及CD8＋T细胞水平的相对值都高于对照组，说明获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。(5)水稻属于常见的农作物，易于种植，其作为生物反应器容易获得疫苗；水稻的产量高，作为生物反应器容易从胚乳中获得大量疫苗。题型二PCR中引物的设计与选择利用PCR扩增目的基因(如干扰素基因)时，设计引物序列的主要依据是有一段已知目的基因(干扰素基因)的核苷酸序列。所以引物是一小段单链核酸。(1)引物的作用：TaqDNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，TaqDNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链。不同引物可结合不同的目的基因并进行扩增。(2)设计引物应遵循的主要原则①引物长度应大于16个核苷酸，可防止随机结合。②引物与靶序列间的Tm(指当50%的引物和靶序列表现为双链DNA分子时的温度)不应过低。G＋C含量越高，Tm越高。③引物不应有发夹结构，即不能有4bp以上的回文序列。④2个引物间不应有4bp以上的互补序列或同源序列。⑤两条引物的复性温度相差不能大于5℃。操作时一般选择较低的那个复性温度，如果相差太大，另一条引物的非特异性结合就会增加。(3)引物的处理由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，引物5′端对扩增特异性影响不大，因此，可给予修饰而不影响扩增特异性。①加酶切位点，便于形成重组DNA分子。需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列。其目的是保证目的基因定向插入载体并避免目的基因自身环化。②标记荧光，如病毒含量的测定(4)PCR循环时与引物相关的计算PCR经过n次循环产生的DNA数为2n，一共有2n＋1条链，其中有2条链是DNA母链，不含引物，其他的每1条链均含1个引物，并且2种引物的数量相等，故PCR过程经过n次循环，需要的引物总个数是2n＋1－2，需要某一种引物的总个数是(2n＋1－2)×(1/2)＝2n－1。一个DNA由1条母链和第1种引物延伸的子链组成，另一个DNA由另1条母链和第2种引物延伸的子链组成，其他的DNA均由2种引物延伸的2条子链组成。[例4](2023·山东卷，25)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。(1)与图甲中启动子结合的酶是________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________________________________________(答出2个结构即可)。(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。答案(1)RNA聚合酶复制原点、标记基因、限制酶切割位点等(2)F1和R2或者F2和R1a链(3)J－V5融合蛋白不是解析(1)与图甲中启动子结合的酶是RNA聚合酶。图甲中有启动子和终止子等，作为载体，质粒还需具备的结构有限制酶切割位点、标记基因、复制原点等。(2)据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1和R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知，图上转录方向是从左向右，对应的模板链方向应该是3′→5′，非模板链(也就是a链)是5′→3′；考虑到DNA复制的方向是子链的5′→3′，引物基础上延伸的方向肯定是5′→3′，所以引物结合的单链其方向是3′→5′；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′→5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。(3)据图乙可知，只有抗V5抗体时，出现条带1，抗V5抗体能与V5编码序列表达标签短肽V5特异性结合，只有抗J蛋白抗体时，出现条带1和条带2，且条带1较宽，说明该物质能与抗J蛋白抗体特异性结合，因此出现条带1证明细胞内表达了J－V5融合蛋白，而条带2可能是杂质。突破2PCR定点突变技术题型一重叠延伸PCR技术重叠延伸PCR技术其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图：题型二大引物PCR技术大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如图。题型三反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理是：用限制酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如图。[例](2024·山东聊城高三模拟)α－环糊精是食品、医药等常用原料。α－环糊精葡萄糖基转移酶(cgt)生产α－、β－和γ－环糊精的混合物，分离纯化十分不便。cgt在芽孢杆菌中的产量较低，诱变效果不佳。cgt的372位天冬氨酸和89位酪氨酸是酶与底物作用的关键位点，江南大学一实验室将它们分别替换为赖氨酸和精氨酸后，形成的重组cgt催化特异性提高了27倍。图1(1)蛋白质工程的第一步通常是________。重叠PCR是常用的DNA定点突变技术，其原理如图1所示。与细胞内的DNA复制相比，PCR不需要用到________酶。要完成两处位点的突变，至少要设计________种引物。(2)如图2是该酶编码链的部分序列，请你设计替换372位天冬氨酸(密码子：GAU、GAC)为赖氨酸(密码子：AAA、AAG)的引物FP2和RP1：________(只写372位对应的3个碱基)。FP2：5′－TAGACCGGCGATGGC________CCCAACAACCGG－3′RP1：5′－CCGGTTGTTGGG________GCCATCGCCGGTCTA－3′图2(3)用大肠杆菌大量生产重组cgt需要解决酶的分泌问题。重组cgt基因位于双突变载体(简称T载体)上，研究人员将重组cgt基因与pET－20b(＋)载体(简称p载体)上的pelB信号肽序列连接，构成重组载体cgt－p，该过程如图3所示。应选用________对T载体酶切处理，用________对p载体进行酶切处理，并用________酶构建重组载体cgt－p，导入目的工程菌。培养基中除基本营养外，还需加入________完成筛选。图3答案(1)确定预期的蛋白质功能解旋6(2)AAA和TTT(或AAG和CTT)(不能颠倒顺序)(3)XmaⅠ、BamHⅠXmaⅠ、BclⅠDNA连接氨苄青霉素解析(1)蛋白质工程的第一步通常是确定预期的蛋白质功能。与细胞内的DNA复制相比，PCR不需要用到解旋酶。由图1可知，完成一处突变需要2种通用引物和2种突变引物，如果要完成两种突变，则需要2种通用引物和4种突变引物，至少要设计6种引物。(2)根据碱基互补配对原则，替换372位天冬氨酸为赖氨酸的引物FP2和RP1的372位对应的3个碱基为AAA和TTT(或AAG和CTT)(不能颠倒顺序)。(3)应选用XmaⅠ、BamHⅠ对T载体酶切处理，这两种限制酶不会破坏重组cgt的完整性，由重组载体cgt－p上的顺序可知，需要保持pelB的完整性，所以只能选用BclⅠ切一端，XmaⅠ和SmaⅠ的识别序列相同，为了保证重组cgt的反向连接，用XmaⅠ、BclⅠ对p载体进行酶切处理，并用DNA连接酶构建重组载体cgt－p，导入目的工程菌。培养基中除基本营养外，还需加入氨苄青霉素完成筛选。限时练26突破基因工程类大题(时间：40分钟分值：50分)【综合提升】1.(2024·厦门外国语学校调研)转录因子FOXO1与DNA结合可提高某些促凋亡基因的转录水平，促进神经元凋亡。让FOXO1基因发生定点突变，使其表达的蛋白第249位点的丝氨酸替换为天冬氨酸，用来模拟FOXO1被蛋白激酶Cdk5磷酸化后的状态。(1)定点突变是利用PCR等方法，在引物中引入突变序列，从而实现目的基因的定向改造。以已有的质粒a0为模板(如图1，★代表突变位点)，将质粒a0定点突变成质粒a1。①为了将突变序列准确地定位在目标序列上，引物部分序列应与FOXO1基因拟突变位点两端的序列________。将FOXO1基因与GFP(绿色荧光蛋白)基因进行融合的目的是_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。②天冬氨酸的密码子为GAC，丝氨酸的密码子为UCU，正向引物★处的碱基序列为____________________________________________________________。③至少经过________轮PCR，可以得到发生定点突变的质粒a1。④探究引物组合1与引物组合2扩增目的基因的效果，根据图2的实验结果分析，哪对引物更适合作为定点突变的引物？____________(填“引物组合1”或“引物组合2”)，另一引物组合没有扩增产物的原因可能是_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。图2两组实验的扩增产物DNA电泳结果，M为DNA标准参照物，对照组不加模板(2)在过氧化物诱导下，Cdk5会磷酸化FOXO1249位点的丝氨酸，科研人员试图探究其在细胞内的分布是否会发生改变。将构建好的质粒a1转染进体外培养的原代神经元中，对照组的神经元需要转染质粒a0。一段时间后，发现对照组的绿色荧光主要集中在细胞核中，而实验组的绿色荧光滞留在细胞质中。推测FOXO1被Cdk5磷酸化后，对凋亡起到抑制作用的原理是_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)为了使课题研究更加完善，现有以下两种实验思路，请补充完整。思路1：还可对比(2)中对照组与实验组的__________________________________________________________________________________________________。思路2：利用某种药物抑制________________________，检测受过氧化物诱导后的FOXO1在细胞中的分布情况。答案(1)①能够进行碱基互补配对根据绿色荧光的分布，定位FOXO1被磷酸化后在细胞中的分布②GAC③2④引物组合2引物组合1的两个引物碱基互补配对的部分占比较高，降低了与模板链结合的概率(2)FOXO1被Cdk5磷酸化后，无法进入细胞核，无法提高细胞核内某些促凋亡基因的转录水平(使促凋亡基因转录受阻)(3)某些促凋亡基因的转录水平/神经元的凋亡程度蛋白激酶Cdk5活性解析(1)①若要将突变序列准确地定位在目标序列上，引物部分序列应该与FOXO1基因拟突变位点两端的序列能够进行碱基互补配对。GFP(绿色荧光蛋白)可以发出绿色荧光，将FOXO1基因与GFP(绿色荧光蛋白)基因进行融合，以根据绿色荧光的分布，定位FOXO1被磷酸化后在细胞中的分布。②丝氨酸的密码子为UCU，图中该位点为AGA∥TCT，AGA对应的密码子为UCU，要想该密码子变为GAC，则AGA∥TCT要变为CTG∥GAC，正向引物★处与CTG互补配对，应为GAC。③至少经过2轮PCR可得到发生定点突变的质粒a1，第一轮PCR只改变了一条链上的碱基，第二轮PCR才会得到质粒a1。④分析图2可知，对照组(不加模板)和引物组合1组没有条带，引物组合2组有条带，说明引物组合2更适合作为定点突变的引物。引物组合1没有扩增产物的原因可能是引物组合1的两个引物碱基互补配对的部分占比较高，降低了与模板链结合的概率。(2)将构建好的质粒a1转染进体外培养的原代神经元中，对照组的神经元转染质粒a0，一段时间后，发现对照组的绿色荧光主要集中在细胞核中，而实验组的绿色荧光滞留在细胞质中。再结合题干信息“转录因子FOXO1与DNA结合可提高某些促凋亡基因的转录水平，促进神经元凋亡”，推测FOXO1被Cdk5磷酸化后，对凋亡起到抑制作用的原理是FOXO1被Cdk5磷酸化后，无法进入细胞核，无法提高细胞核内某些促凋亡基因的转录水平。2.(2024·山东聊城二模)人绒毛膜促性腺激素(hCGβ)是胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，近年研究发现，结肠癌等多种恶性肿瘤细胞的hCGβ基因也有表达，hCGβ与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图为其制备的基本方案。回答下列问题：注：甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔；AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达；各种限制酶对应的线条所指为其识别序列。(1)图示hCGβ基因是人工合成的目的基因，在设计引物对其扩增时，为防止目的基因与质粒的自身环化并保证连接的方向性，可在其两端添加________限制酶的识别序列。经实验得知该基因扩增引物长度为10个核苷酸时特异性强、效率高，已知目的基因①处的碱基序列为—CCTTTCAGCTCA—，则设计该端对应引物的序列是5′________________3′。(2)图示hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是____________________________________________________________________________________________________________________________________。从生产控制的角度分析，选用AOX1作为hCGβ基因启动子的优点是________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)阶段Ⅱ大肠杆菌作为受体菌是利用了大肠杆菌____________________________________________________________________的特点，从而实现重组DNA的扩增，然后在含有________的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进一步进行扩增。(4)阶段Ⅳ需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分________(a.氨苄青霉素b.组氨酸c.无机盐d.琼脂)，可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ基因表达载体的目的菌株。将此菌株扩大培养后，离心取上清液，依据________________原理进行检测。若上清液中能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ基因得以表达。答案(1)XhoⅠ、MumⅠCTCGAGCCTTTCAGCT(2)有利于hCGβ进入内质网加工可以通过控制培养液中甲醇作为唯一碳源，来控制hCGβ基因表达(3)繁殖快，易培养、遗传物质少氨苄青霉素(4)a、b抗原和抗体特异性结合解析(1)SmaⅠ会破坏目的基因，不能添加SmaⅠ识别序列；EcoRⅠ会破坏质粒上的氨苄青霉素抗性基因(标记基因)，不能添加EcoRⅠ识别序列；SalⅠ会破坏质粒上的组氨酸合成酶基因，不能添加SalⅠ识别序列；XmaⅠ识别序列与SmaⅠ识别序列相同，会破坏目的基因，不能添加XmaⅠ识别序列。因此，在hCGβ基因两端应添加XhoⅠ、MumⅠ限制酶识别序列。根据转录方向和质粒AOX1启动子位置确定，在①处插入了XhoⅠ的识别序列CTCGAG，则①处的碱基序列为5′－CTCGAGCCTTTCAGCTCA－3′，互补链中，碱基序列为3′－GAGCTCGGAAAGTCGAGT－5′，对其设计引物序列为5′－CTCGAGCCTTTCAGCTCA－3′，由于经实验得知该基因扩增引物长度为10个核苷酸时特异性强、效率高，加上XhoⅠ的识别序列CTCGAG，总共16个碱基，因此设计该端对应引物的序列是5′－CTCGAGCCTTTCAGCT－3′。(2)甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔，因此hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是有利于hCGβ进入内质网中加工，并分泌到细胞外。AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达，因此选用AOX1作为hCGβ基因启动子，可以通过控制培养液中甲醇的有无，来控制hCGβ基因的表达。(3)由于环化质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，因此导入环化质粒的大肠杆菌具有氨苄青霉素抗性，因此应在含有氨苄青霉素的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。(4)由于环状质粒中含有组氨酸合成酶基因和氨芐青霉素抗性基因，且筛选重组质粒时大肠杆菌是在含有氨苄青霉素的培养基上培养的，因此为筛选导入重组质粒的酵母菌，培养基中不需要再加入组氨酸和氨苄青霉素(即a和b)，但需要加入无机盐和琼脂，形成固体培养基，以筛选目的菌体。hCGβ是一种分泌蛋白，可被分泌到细胞外，将培养物离心后分出细胞和培养液两部分，细胞经破碎处理后，再次离心取上清液，可获得较多的hCGβ，用抗hCGβ单克隆抗体分别进行检测，即抗原—抗体杂交法，原理为抗原与抗体特异性结合。若培养液及上清液中均能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ基因在酵母菌细胞中得到表达，并能分泌到细胞外。3.(2024·黑吉辽卷，25)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T－DNA转移)和不含有Vir基因、含有T－DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；