T-TPPA 0010-2024 中药注射剂（真溶液型）中高分子杂质的测定高效分子排阻色谱-蒸发光散射检测法

CCSC272024-05-31发布2024-05-31实施天津市医药行业协会发布T/TPPA0010-2024 2规范性引用文件 3术语和定义 4检测原理 25材料与设备 25.1材料 25.2设备 26实验方法 26.1溶液配制 26.2测定法 37数据分析及判定 47.1系统适用性 47.2专属性 47.3灵敏度 47.4数据处理 47.5判定 5IT/TPPA0010-2024本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由天津天士力之骄药业有限公司提出。本标准由天津市医药行业协会归口。本标准起草单位：天津天士力之骄药业有限公司、天津市药品检验研究院、天津市中药注射剂安全性评价企业重点实验室、现代中药创制全国重点实验室、甘肃之骄制药有限公司、天士力医药集团股份有限公司、河南天地药业股份有限公司、现代中医药海河实验室、天津市药品检验研究院北辰药品检验所。本标准主要起草人：李莉、张磊、岳洪水、鞠爱春、周军、孙伟、林梅、李洪英、胡洪艳、张俊华、周水平、何毅、白晓丽、张彦明、冯玉波、孙孝梅、郑文科、王杰、李春、贺超凡、王亚虎、苏小琴、尚献召、李兵、刘朋。1T/TPPA0010-2024中药注射剂（真溶液型）中高分子杂质的测定高效分子排阻色谱-蒸发光散射检测法本文件规定了高效分子排阻色谱-蒸发光散射检测法（HPMEC-ELSD）测定中药注射剂中高分子杂质的方法。本文件中的中药注射剂为不含乳状液型、混悬型和非水溶性注射液的中药注射剂。本文件适用于中药注射剂中高分子杂质的检测。当某些中药注射剂不适于使用高效分子排阻色谱法蒸发光散射检测法检测高分子杂质，可以采用其他方法测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T33087仪器分析用高纯水规格及试验方法《中华人民共和国药典》（2020年版）3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1分子排阻色谱法molecularexclusionchromatography；MEC又称尺寸排阻色谱法(sizeexclusionchromatography，SEC)；凝胶色谱法(gelchromatography)。固定相为多孔性凝胶，根据样品分子体积(即根据分子流体动力学直径或体积)大小进行分离的一种液相色谱法。体积大的分子先流出，体积小的分子后流出。3.2高分子macromolecule又称大分子。在结构上由许多个实际或概念上的低分子量分子结构作为重复单元组成的高分子量分子。其分子量通常在10000Da以上。3.3截留分子量molecularweightcutoff；MWCO对有孔材料孔径大小的一种描述。能自由通过某种有孔材料的分子中最大分子的分子量即为该材料2T/TPPA0010-2024的截留分子量。大于截留分子量的分子，被材料截留；小于截留分子量的分子，则可自由通过。截留分子量是凝胶过滤介质、半透膜、超滤膜等材料的重要技术参数。4检测原理采用超滤离心技术使溶液中的高分子物质和小分子物质进行分离，并使高分子物质得到富集。富集后的溶液注入液相色谱仪，依据分子排阻色谱法原理，大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱至柱外，表现为保留时间较短；小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在色谱柱中滞留时间较长，表现为保留时间较长；其余分子则按分子大小依次被洗脱。采用最小二乘法（或者可采用其他数学模型）以对照品峰分子量的对数值（lgMp）与对应的保留时间（tR）制得标准曲线的回归方程；利用供试品的保留时间和标准曲线的回归方程计算其分子量，或由标准曲线的回归方程计算分子量为10000Da物质的其保留时间，通过分子量和保留时间的对比判定是否检出高分子杂质。5材料与设备5.1材料5.1.1耗材a）超滤离心管（MWCO3000Da）。b）凝胶色谱柱。5.1.2试剂试药a）甲酸：色谱纯。b）乙酸铵：分析纯。c）线性结构对照品：如聚乙二醇1000、聚乙二醇4000、聚乙二醇7000、聚乙二醇10000、聚乙二醇13000、聚乙二醇20000等，其峰分子量范围为1000Da～20000Da。d）支链结构对照品：如右旋糖酐D1、右旋糖酐D2、右旋糖酐D3、右旋糖酐D4、右旋糖酐D5、右旋糖酐D6等，其峰分子量范围为2700Da～64650Da。e）其他类别对照品：至少包含5个分子量水平（核糖核酸酶A、胰岛素、胸腺肽α1、生长抑素、细胞色素C、溶菌酶、脱辅基肌红蛋白、卵清蛋白、转铁蛋白其峰分子量范围应涵盖分子量10000Da。5.2设备电子分析天平、高效液相色谱仪、蒸发光散射检测器、离心机等。6实验方法6.1溶液配制3T/TPPA0010-20246.1.1流动相的制备取甲酸适量，加水制成浓度为0.02%的溶液；或取乙酸铵适量，加水制成浓度为0.77%的溶液。6.1.2对照品线性溶液的制备分别称取各分子量对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释制成每1mL中约含1mg的溶液，即得。6.1.3空白溶液的制备取水10mL至超滤离心管上管中，离心至超滤离心管上管截留液体体积约为0.75mL，用可调节移液器转移至2mL量瓶中，再向超滤离心管上管加入适量水，用可调节移液器吹打混匀后转移至量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。6.1.4灵敏度溶液的制备取6.1.2项下对照品线性溶液，分别逐级稀释，即得。6.1.5供试品溶液的制备6.1.5.1标示装量为10mL或10mL以上的注射液或注射用浓溶液取供试品1瓶（支），小心翻转，使溶液混合均匀，小心打开容器，取溶液10mL至超滤离心管上管中，离心至超滤离心管上管截留体积约为0.75mL，用可调节移液器转移至2mL量瓶中，再向超滤离心管上管加入适量水，用可调节移液器吹打混匀后转移至量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。6.1.5.2标示装量为10mL以下的注射液或注射用浓溶液取供试品1瓶（支），小心翻转，使溶液混合均匀，小心打开容器，将溶液转移至超滤离心管上管中，再用适量水分3次润洗容器，并转移至超滤离心管上管中，使超滤离心管上管中的溶液体积约为10mL，离心至超滤离心管上管截留体积约为0.75mL，用可调节移液器转移至2mL量瓶中，再向超滤离心管上管加入适量水，用可调节移液器吹打混匀后转移至量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。6.1.5.3注射用无菌粉末取供试品1瓶（支），小心开启瓶盖，加入水适量，盖上瓶盖，小心翻转使内容物分散均匀，小心打开瓶盖，将溶液转移至超滤离心管上管中；再用适量水分3次润洗容器，并转移至超滤离心管上管中，使超滤离心管上管中的溶液体积约为10mL，离心至超滤离心管上管截留体积约为0.75mL，用可调节移液器转移至2mL量瓶中，再向超滤离心管上管加入适量水，用可调节移液器吹打混匀后转移至量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。注：当中药注射剂的黏度过高，采用上述方法无法制备供试品溶液时，可用水或其他适宜6.2测定法釆用适宜分子量分离范围的色谱柱或系列色谱柱，色谱柱以亲水硅胶、凝胶或经修饰的凝胶如羟基4T/TPPA0010-2024化聚异丁烯酸酯凝胶（HydroxylatedPolyisobutyrateGel）、葡聚糖凝胶（Sephadex）或琼脂糖凝胶（Sepharose）等为填充剂；以0.02%甲酸水溶液（或以0.77%乙酸铵水溶液）为流动相；蒸发光散射检测器检测。6.2.1系统适用性取6.1.2项下对照品线性溶液，连续进样5次，记录其保留时间和峰面积的测量值。6.2.2专属性取6.1.2项下对照品线性溶液和6.1.3项下空白溶液，按上述色谱条件进行测定，记录其保留时间的测量值。6.2.3灵敏度取6.1.4项下的灵敏度溶液，按上述色谱条件进行测定，记录信噪比和进样量。6.2.4样品测定分别精密吸取6.1.2项下对照品线性溶液和6.1.5项下供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录其保留时间和峰面积的测量值。7数据分析及判定7.1系统适用性峰面积的相对标准偏差应不大于3.0%，保留时间的相对标准偏差应不大于1.0%。7.2专属性除另有规定外，空白色谱中不得检出保留时间不大于对照品保留时间的组分。7.3灵敏度以信噪比为3:1时注入液相色谱仪的量确定为灵敏度。7.4数据处理7.4.1数据的拟合将对照品峰分子量的对数值（lgMp）与保留时间（tR）用最小二乘法进行线性回归计算（或者可采用其他数学模型拟合方程的相关系数应不低于0.99，即判定系数应不低于0.98，数据处理将以线性拟合为例进行说明。lgMp=atR+b……式1式中：R—对照品色谱峰的保留时间；5T/TPPA0010-2024a—线性回归方程的系数；b—线性回归方程的常量（截距）；Mp—对照品的峰分子量；lgMp—对照品的峰分子量的对数值。7.4.2最大分子量的计算通过对拟合方程（式1）进行转化得到式2，将供试品溶液最先流出组分的保留时间（非溶剂峰）带入式2，计算求得该组分的峰分子量，即供试品溶液中的最大分子量。M=10atR+b式中：R—供试品中最短保留时间；a—线性回归方程的系数；b—线性回归方程的常量（截距）；Mp—供试品中保留时间最短组分的峰分子量。7.4.3分子量为10000Da物质对应tR的计算依据拟合方程（式1），计算分子量为10000Da的物质的保留时间（如式3）。式中：R—分子量为10000Da的物质的保留时间a—线性回归方程的系数；b—线性回归方程的常量（截距）。7.5判定可以采用下述两种方法中的任意一种方法进行判定。7.5