DB12∕T 653-2016 鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测 实时荧光PCR法

ICS67.050B45DB12天津市市场和质量监督管理委员会发布DB12/T653—2016本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市东丽区产品质量监督检验所。本标准主要起草人：赵新、易萌、刘娜、兰青阔、刘雪岩、陈锐、朱珠、王成、徐石勇。本标准2016年9月首次发布。DB12/T653—2016鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测实时荧光PCR法本标准规定了鲜冻畜、禽肉中动物源性成分（包括牛、羊、猪、鸡、鸭等）的定量PCR检测方法的术语和定义、检测方法、结果计算。本标准适用于生鲜、冷冻畜禽肉中动物源性成分的定量PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实时荧光PCRrealtimePCR实时荧光PCR是指PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，对未知模板进行定性或定量分析。3.2Ct值cycletime每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.3内参基因referencegene能够同时检测出多种动物源性成分的基因（包括牛、羊、猪、鸡、鸭等）。3.4牛源性成分bovine-derivedmaterials牛种属特异性DNA片段。3.5羊源性成分ovine-derivedmaterials羊种属特异性DNA片段。3.6猪源性成分porcine-derivedmaterials猪种属特异性DNA片段。3.7鸡源性成分chicken-derivedmaterials鸡种属特异性DNA片段。3.8鸭源性成分duck-derivedmaterials鸭种属特异性DNA片段。DB12/T653—20164原理根据牛、羊、猪、鸡、鸭等的DNA特征序列，筛选种间保守区域设计一对通用引物和种内特异性区域设计五对种属特异性引物，通用引物可同时扩增牛、羊、猪、鸡、鸭等多种动物源性DNA，采用TaqMan实时荧光PCR技术，根据标准参照物模板含量与Ct值间的线性关系，绘制标准曲线，计算试样中种属特异性基因和内参基因的比值，从而对鲜冻畜、禽肉中动物源性成分进行定量检测。5检测方法5.1试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。5.1.1DNA提取用试剂三氯甲烷；异戊醇；乙酸钠；无水乙醇；Tris饱和酚；裂解液：10mmoL/LTris-HCl（pH8.025mmol/LEDTA（pH8.05g/LSDS，0.1g/L蛋白酶K；TE缓冲液16SrDNARd1Sus-ACTBDuc5.1.4阳性对照5.1.2qMan荧光PCR反应试剂盒5.1.3引物和探针。TaqMan探针标记荧光报告标记对应的荧用已知含相应动物源性成分的样品作阳性对照。用水分别将上述引物和探针稀释到10µmol/L，探针需避光保存。预期扩增片段信息参见附录A，32DB12/T653—20165.1.5双蒸水。5.2仪器荧光定量PCR扩增仪；核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计；分析天平，感量0.1g和0.1mg；离心机：离心力12000g；微量移液器：0.5µL～10µL，10µL～100µL，10µL～200µL，100µL～1000µL；实时荧光PCR反应管；重蒸馏水发生器或纯水仪；恒温水浴箱。5.3分析步骤5.3.1试样制备生鲜肉直接进行试样制备，冷冻肉于室温融化后进行制样。充分混匀，用四分法缩分出不少于500g作为试样，装入清洁容器中，加封后，标明标记。将试样于-20℃冷冻保存。5.3.2DNA提取取待测样本剔去动物组织中的结缔组织和脂肪，液氮预冷后放入研钵中，然后缓慢向研钵中加入SDS裂解液和20μL蛋白酶K（20mg/mL混匀，55℃水浴消化数小时，期间不停颠倒混匀，直至溶液透明；将消化后的组织裂解液加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒混匀，12000rpm离心10min，转移上清至一新离心管，重复1次；加入0.5倍体积的Tris饱和酚和0.5倍体积的氯仿/异戊醇（24:1缓慢颠倒混匀，12000rpm离心10min，转移上清至一新离心管；加入0.1倍体积的乙酸钠溶液和2.5倍体积4℃预冷的无水乙醇，缓慢颠倒混匀，可见白色DNA絮状沉淀析出，-20℃沉淀2h；12000rpm离心5min，加入500μL70%乙醇洗涤沉淀；室温下放置使残余乙醇完全挥发，加入100μLTE缓冲液溶解DNA沉淀。5.3.3标准曲线样品制备采用牛、羊、猪、鸡、鸭相应的标准品绘制种属特异性基因和16SrDNA内参基因的标准曲线。提取动物源性成分标准物质基因组DNA，用0.1×TE或水稀释梯度稀释，标准溶液至少涵盖5个动物源性成分浓度梯度。5.3.4PCR反应5.3.4.1标准样品和试样实时荧光PCR反应同时进行标准样品和试样的PCR反应，每个PCR反应设置3次平行。动物源性成分种属特异性基因实时荧光PCR反应按表2在PCR反应管中依次加入反应试剂，混匀；16SrDNA内参基因实时荧光PCR反应按表3在PCR反应管中依次加入反应试剂，混匀。将PCR管放在离心机上，500g~3000进行45次循环扩增反应（95℃变性15s，60℃退火延伸1min在第二阶段的退火延伸（60℃)时段收集荧光信号。——鲑鱼精子DNA作为阴性对照PCR反应体系的模板用纯水作为—16SrDNA内参基—空白对照PCR反应各对照PCR反应及PCR反应条件相同。DB12/T653—2016DB12/T653—20165.3.4.2设置对照应设置阴性对照和5.3.5.1设定阈值实时荧光PCR反应结束后，以PCR刚好进入指数期扩增来设置荧光信号阈值，并根据仪器噪声情况进行调整。设定阈值处，要求不同浓度梯度标准品的扩增曲线平行，而且同一样品的不同平行间重复性良好。5.3.5.2记录Ct值设定阈值后，荧光定量PCR仪的数据分析软件自动计算每个反应的Ct值，并记录。5.3.5.3绘制标准曲线根据标准溶液的扩增Ct值和初始模板含量的对数间的线性关系，分别绘制动物源性成分种属特异性基因和16SrDNA内参基因的标准曲线。4DB12/T653—2016标准曲线公式：式中：y—测试样品的Ct值；a—标准曲线的斜率；x—模板靶标浓度以10为底数的对数；b—标准曲线的截距。5.3.5.4数据可接受的标准动物源性成分种属特异性基因阴性对照和空白对照的Ct值≥38；16SrDNA阴性对照和空白对照的16SrDNA内标基因Ct值≥38；标准曲线的R2≥0.98，标准曲线斜率≥-3.6且≤-3.1，满足上述条件，可以进行结果计算。否则重新进行实时荧光PCR扩增。5.3.5.5含量计算5.3.5.5.1计算试样模板靶标浓度将试样的动物源性成分种属特异性基因和16SrDNA内参基因的Ct值分别带入动物源性成分种属特异性基因和16SrDNA内参基因的标准曲线方程，计算动物源性成分种属特异性基因和16SrDNA内参基因的靶标浓度。计算试样模板靶标浓度公式：y-b式中：n—模板靶标浓度y—测试样品的Ct值；a—标准曲线的斜率；b—标准曲线的截距。5.3.5.5.2计算试样中动物源性成分种属特异性基因含量将动物源性成分种属特异性基因的靶标浓度和16SrDNA内参基因的靶标浓度带入公式（3计算出试样中动物源性成分种属特异性基因百分含量。计算试样中动物源性成分种属特异性基因百分含量的公式：(3)式中：c—试样中动物源性成分种属特异性基因的百分含量(%)；nOA-PRLPRd1、Sus-ACTB、Chk、Duc—动物源性成分种属特异性基因靶标浓度；n16SrDNA—内参基因16SrDNA浓度。6结果分析与表述6.116SrDNA内参基因和动物源性种属特异性基因均出现典型扩增曲线，且16SrDNA内参基因和动物源性种属特异性基因的Ct值<36，表明样品中检出某动物源性成分。表述为“样品中检测出某动物源性成分，某动物源性成分含量为c”。DB12/T653—20166.216SrDNA内参基因出现典型扩增曲线，且Ct值<36，动物源性种属特异性基因Ct值≥36或未出现典型扩增曲线，表明样品中未检出某动物源性成分。表述为“样品中未检测出某动物源性成分”。6.316SrDNA内参基因和动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，16SrDNA内参基因Ct值<36，动物源性种属特异性基因Ct值在36～38之间，应进行重复实验。如重复实验结果符合6.1-6.2的情况，依照6.1-6.2进行判断；如重复实验动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，但Ct值仍在36～38之间，则判定样品检出某动物源性成分，表述为“样品中检测出某动物源性成分”。6.416SrDNA内参基因和动物源性种属特异性基因未出现典型扩增曲线，或Ct值≥38，表明样品中未检出动物源性成分。表述为“样品中未检测出动物源性成分”。6.516SrDNA内参基因和动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，但Ct值均在36～38之间，应进行重复实验。如重复实验结果符合6.1-6.4的情况，依照6.1-6.4进行判断；如重复实验16SrDNA内参基因和动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，但Ct值仍在36～38之间，则判定样品检出某动物源性成分，表述为“样品中检测出某动物源性成分”。DB12/T653—2016（资料性附录）A.1牛种属特异性基因实时荧光PCR扩增产物核苷酸序列1GTAGGTGCACAGTACGTTCTGAAGCTACTTCTGTGAGGCAGATGCCAAACGGCACACTCG61GCTGTGTTCCTTGCCGTCATGTGCCCAGTCTGGCCA.2羊种属特异性基因实时荧光PCR扩增产物核苷酸序列1CCAACATGCCTTTAAACCCTCAAAAACCATTGAGACTGGCGGGGAAGGAAAGGCAGCCAA61ACAGAGCGAGTCAGAAGGCTACAGTTCCA.3猪种属特异性基因实时荧光PCR扩增产物核苷酸序列1GGAGTGTGTATCCCGTAGGTGCACAGTAGGTCTGACGTGACTCCCCGACCTGGGGTCCCC61AGCACACTTAGCCGTGTTCCTTG