2026《金版教程》高考复习方案生物创新多选版-小单元3 微专题10 PCR技术及其应用

1．PCR技术与病毒检测某些RNA病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部分序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶分解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR检测某种病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙。2．基因定点突变与基因改造重叠延伸PCR技术是一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。3．融合PCR技术与融合蛋白融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来，进而可以用于生产融合蛋白。[例1]临床上常采用RT­PCR技术(以mRNA为模板逆转录为cDNA，再进行PCR扩增)对受试者的咽拭子取样后进行流感病毒核酸检测。以下是某医院发热门诊医生采用该项技术对受试者进行流感病毒核酸检测的相关操作步骤：①从受试者组织样本中提取mRNA；②分析PCR扩增结果；③利用PCR扩增cDNA片段；④采集受试者组织样本；⑤用mRNA逆转录得到cDNA。下列说法错误的是()A．RT­PCR技术的正确操作顺序应是④①⑤③②B．RT­PCR操作过程中，所需的酶有逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶C．RT­PCR的产物经过BamHⅠ、EcoRⅠ双限制酶处理以后，再与经过同样双酶处理的小双节病毒(PBV)载体连接，该操作属于基因工程操作步骤中的构建基因表达载体D．利用RT­PCR技术获取的目的基因不能在物种间进行交流答案：D解析：RT­PCR技术正确的操作顺序应该是：④采集受试者组织样本→①从受试者组织样本中提取mRNA→⑤用mRNA逆转录得到cDNA→③利用PCR扩增cDNA片段→②分析PCR扩增结果，A正确；RT­PCR操作过程中，用mRNA逆转录得到cDNA需要使用逆转录酶，利用PCR扩增cDNA片段需要耐高温的DNA聚合酶，B正确；RT­PCR的产物(目的基因)经过BamHⅠ、EcoRⅠ双限制酶处理以后，再与经过同样双酶处理的小双节病毒(PBV)载体连接，即将目的基因与载体相连，故该操作属于基因工程操作步骤中的构建基因表达载体，C正确；生物界共用一套遗传密码，是基因工程所依据的原理之一，而RT­PCR技术获取的目的基因通常无内含子等非编码序列，利于基因在物种间交流，D错误。[例2]巢式PCR是指先后用外内引物扩增目的基因的方法。其原理为：先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物(F1，R1)进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物(F2，R2)扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是()A．两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段B．第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定C．由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性D．如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物答案：D解析：两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段，以便与模板互补配对，A正确；第二轮PCR使内侧引物以第一轮PCR产物为模板进行再次扩增，第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定，B正确；由于和两套引物同时都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性，将需要的目的基因扩增出来，C正确；如果两套引物一起加入反应体系中，外引物复性温度要明显高于内引物，使外引物先进行反应，D错误。[例3](多选)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列叙述错误的是()A．限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计B．据图可知，最后大量获得的ssDNA与图中乙链的碱基序列相同C．上述过程中子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3′端延伸D．该不对称PCR过程中需要(26－1)a个限制性引物答案：BC解析：当限制性引物的浓度降低，甚至基本耗尽，双链DNA的合成速率显著下降，此时非限制性引物将继续引导单链DNA的合成，非限制性引物是与乙链结合，故反应的最后阶段只产生初始DNA中一条链的拷贝(非限制性引物引导合成的单链)，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致，B错误；扩增时耐高温的DNA聚合酶将脱氧核苷酸连接至引物的3′端，子链都是沿引物的5′端向3′端延伸，C错误；由题意可知，6次循环后开始扩增产生ssDNA，即限制性引物只能满足6次循环，PCR扩增时引物是新子链的一部分，假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后产生26a个DNA分子，因此该不对称PCR过程中需要(26－1)a个限制性引物，D正确。[例4]通过体内同源重组可以进行靶向基因敲除，原理如图1所示。同源重组技术结合tetr­sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。图2是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tetr是四环素抗性基因，sacB基因是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X­gal水解成蓝色化合物。回答下列问题：限制酶识别序列和切割位点EcoRⅠ5′—G↓AATTC—3′BamHⅠ5′—G↓GATCC—3′HindⅢ5′—A↓AGCTT—3′XmaⅠ5′—C↓CCGGG—3′(1)据图1分析，与传统转基因技术相比，体内同源重组具有的特点是__________________________。(2)采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系中需加入引物，引物的作用是__________________________，若目的基因扩增3代，则共用引物________个。PCR完成以后，常采用________________________法来鉴定PCR的产物。(3)过程①中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加________、________限制酶的识别序列；过程⑤中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加________基因两端的同源序列。(4)过程⑦中，在含有____________________的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tetr­sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加____________________。答案：(1)无需使用限制酶和DNA连接酶(2)使DNA聚合酶能够从引物3′端连接脱氧核苷酸14琼脂糖凝胶电泳(3)EcoRⅠBamHⅠLacZ(4)四环素和X­gal蔗糖和X­gal解析：(1)体内同源重组在活细胞内完成，不需要使用限制酶和DNA连接酶，就可实现靶基因的敲除或替换。(2)采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系中需加入引物，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，若目的基因扩增3代，DNA有23＝8个，DNA单链有8×2＝16个，去除两条模板链，则共用引物14个。PCR完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳法来鉴定PCR的产物。(3)选择限制酶时，不能破坏目的基因、标记基因、复制原点，所以可选择BamHⅠ和EcoRⅠ对载体进行切割，由于目的基因两端没有相应的酶切位点，则设计引物时在引物5′端分别添加BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列。过程⑤中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加上LacZ基因两端的同源序列，以便利用同源重组技术将LacZ基因敲除。(4)由于LacZ基因表达产物能将无色化合物X­gal水解成蓝色化合物，若含有X­gal的培养基中出现白色菌落，则说明成功导入重组质粒，LacZ基因成功敲除，由于重组质粒上还有四环素标记基因，故在培养基中添加四环素用于筛选。过程⑧通过同源重组技术结合tetr­sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，由于sacB基因是蔗糖致死基因，则添加蔗糖起到选择作用，LacZ基因表达产物能将无色化合物X­gal水解成蓝色化合物，则添加X­gal起到筛选作用，所以在培养基中添加蔗糖和X­gal可筛选LacZ基因回补菌株。[例5]融合PCR技术(fusionPCR)采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来，为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。图1表示融合PCR技术的过程示意图(P1～P4表示引物)，图2表示融合后产物的电泳图。(1)从化学本质上来说，引物是________________。(2)图1过程设计的P2与P3引物的添加序列必须能够发生________________。融合PCR步骤1中，至少进行________次循环才能获得基因A的PCR产物。(3)融合PCR步骤2中基因A、B融合形成一个基因的机制是__________________________________________________________________________________________________________。若要对A、B融合基因继续进行PCR扩增，则图1中的M、N处位置所需要的引物分别是________。(4)图2中电泳图中________号条带最可能表示融合后片段，若PCR反应没有扩增出任何产物，则可能的原因是______________________________________________(至少两点)。答案：(1)一小段单链DNA或RNA(2)碱基互补配对2(3)引物P2与P3添加序列的互补链发生碱基互补配对，然后在TaqDNA聚合酶的作用下向两边延伸，基因A、B完全融合P1、P4(4)4复性温度太高；引物设计不合理无法与目的基因结合解析：(2)由于A、B基因需要融合，融合