2026年高考生物二轮突破复习：题型 05 基因工程的应用（4大考向）（解析版）

/题型05基因工程的应用目录目录第一部分题型解码高屋建瓴，掌握全局第二部分考向破译微观解剖，精细教学考向解读方法透视典例引领变式演练考向01基因工程核心操作流程考向02基因工程在农业领域的应用考向03基因工程在医药与医学领域的应用考向04蛋白质工程的应用第三部分新题演练整合应用，模拟实战高考真题命题点常见设问/关键词2025

黑吉辽蒙：PCR的原理、应用；浙江：PCR原理、目的基因的获取；河北：基因自由组合定律的实质和应用

基因突变

PCR扩增的原理与过程

基因连锁与交换定律；江苏：基因突变与基因工程；安徽：基因工程与发酵工程（PCR

扩增、菌种筛选、发酵条件控制）；山东：基因工程与发酵工程（PCR

扩增、菌种筛选、发酵条件控制）；陕晋青宁：基因工程的操作程序综合；湖南：基因表达载体的构建；动物细胞融合与单克隆抗体的制备；北京：PCR技术的应用；2024·北京：贵州：限制酶的作用特点；甘肃、湖北、江西：基因工程技术的基本步骤；浙江：引物、凝胶电泳；山东、安徽：DNA粗提取与鉴定、PCR条件；河北：PCR的原理、条件；吉林：琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物；全国、重庆2023·浙江：PCR技术；广东、湖南：基因工程培养抗逆性作物；山西、山东、湖北：构建基因表达载体；设问关键词：限制酶、基因表达载体的组成包括哪些元件、构建过程中为何要选择同种限制酶切割目的基因和载体、启动子的作用是什么关键技巧解答高考生物基因工程应用类非选择题，需紧扣操作流程与核心原理。首先要明确基因工程工具的特性，限制酶需识别特定序列且注意黏性末端匹配，载体要具备标记基因等必备元件。构建表达载体时，需牢记其包含目的基因、启动子、终止子和标记基因，且启动子需适配受体细胞类型。目的基因导入环节，要区分动植物和微生物的不同方法，如农杆菌转化法适用于植物、显微注射法用于动物。筛选鉴定需分层次，先通过标记基因筛选导入成功的受体细胞，再用分子杂交技术检测目的基因的转录与表达。答题时结合题干应用场景，用专业术语规范表述操作逻辑，确保流程与原理对应。思维误区1、工具酶功能认知混淆易混淆限制酶与DNA连接酶的作用，误将限制酶的“切割磷酸二酯键”等同于DNA连接酶的“连接氢键”；同时忽略DNA聚合酶与DNA连接酶的差异，认为二者均可连接DNA片段，实则前者仅用于DNA复制时单链的延伸，后者才用于目的基因与载体的拼接。2、基因表达载体元件理解偏差误认为基因表达载体只需包含目的基因，遗漏启动子、终止子、标记基因等核心元件；还会混淆启动子与起始密码子、终止子与终止密码子的概念，将调控转录的启动子/终止子归为翻译层面的密码子，忽略二者的作用阶段和本质差异。3、目的基因导入方法与受体细胞错配对不同受体细胞的导入方法记忆混乱，比如将农杆菌转化法用于动物细胞，或将显微注射法用于微生物细胞；同时忽视受体细胞的特殊性，如导入植物细胞时未考虑体细胞需经植物组织培养才能获得转基因植株，导入微生物细胞前未进行Ca²⁺处理增加通透性。4、筛选鉴定层次与方法混淆把“筛选成功导入载体的受体细胞”和“鉴定目的基因是否表达”的方法混为一谈，比如用抗原-抗体杂交技术筛选导入载体的细胞，而非仅用于检测蛋白质水平的表达；还会遗漏分子水平检测的多步流程，仅进行标记基因筛选就判定目的基因已成功表达。5、基因工程安全性与应用原理脱节分析转基因生物安全性时，仅泛泛提及“生态风险”，未结合具体实例（如抗虫基因可能流向近缘物种）；在解释基因工程应用机理时，如抗虫棉的抗虫原理，误将Bt毒蛋白基因直接等同于毒蛋白，忽略基因需经转录翻译才能合成抗虫蛋白的过程。考向01基因工程核心操作流程这是基础考向，聚焦基因工程的核心步骤与工具。常以流程图为载体，考查限制酶、DNA连接酶等工具酶的选择与作用，基因表达载体的必备元件（启动子、终止子、目的基因、标记基因）及构建逻辑，还有目的基因导入不同受体细胞（植物、动物、微生物）的方法差异，需精准区分各步骤的原理与操作细节。1、核心操作流程技巧：牢记“获取目的基因→构建基因表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定”四步流程。目的基因获取可通过PCR扩增、从基因文库中提取；基因表达载体构建是核心，需含启动子、目的基因、终止子、标记基因（如抗生素抗性基因）；导入受体细胞方法需匹配生物类型（植物用农杆菌转化法，动物用显微注射法，微生物用感受态细胞法）。2、关键步骤分析逻辑：构建表达载体时，需用同种限制酶切割目的基因和载体，再用DNA连接酶连接，保证目的基因正确插入；检测鉴定分三步——分子水平检测（DNA分子杂交、分子杂交、抗原-抗体杂交）和个体水平鉴定（如抗虫实验），解题时按“步骤→工具→目的”梳理，明确各环节作用。3、应用场景匹配技巧：基因工程应用聚焦“医疗、农业、环保”三大领域。医疗上如生产胰岛素、基因治疗遗传病；农业上如培育抗虫（Bt毒蛋白基因）、抗逆作物；环保上如降解污染物的基因工程菌。答题时需结合具体应用，对应核心操作流程，说明技术原理。4、规范答题模板：按“操作流程→核心工具→应用场景→预期效果”表述，例：“该基因工程中，先通过PCR扩增获取抗虫基因，与含标记基因的载体用限制酶和DNA连接酶构建表达载体，经农杆菌转化法导入棉花细胞，通过抗原-抗体杂交检测目的基因表达，最终培育出抗虫棉花品种”。例1.（2025·天津·高考真题）内共生假说认为，线粒体起源于在厌氧真核细胞中共生的需氧细菌。研究人员将经过改造的大肠杆菌导入相应的专性厌氧酵母细胞质中构建共生体，为上述假说提供证据。(1)获得专性厌氧呼吸的酵母菌株利用基因敲除技术破坏酵母菌的功能，导致该细胞器不能产生ATP。(2)获得维生素营养缺陷且能分泌ATP的大肠杆菌菌株①利用基因敲除技术获得维生素营养缺陷型大肠杆菌菌株A。②构建含有ATP转运蛋白基因X的质粒2。已知在基因X和质粒1上均无EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点。研究者采用引物P1（含EcoRⅠ识别序列）和P2（含NotⅠ识别序列）对基因X进行扩增，并采用引物P3（含EcoRⅠ识别序列）和P4（含NotⅠ识别序列）对质粒1进行扩增，使质粒1线性化，再经酶切、连接，使基因X与质粒1重组为质粒2．请在下图质粒1处标出引物P3和P4的位置及方向。③将质粒2转入菌株A中，筛选获得菌株B。(3)采用下图所示过程将菌株B导入步骤（1）获得的酵母菌中，筛选获得融合菌株促进膜融合的化学试剂通常选择。大肠杆菌细胞壁为双层结构，内层为坚固的肽聚糖，外层为脂质双分子层膜结构。融合细胞中的大肠杆菌形态正常且具有活性，说明与酵母细胞膜融合的是菌株B的。在以丙酮酸为唯一碳源的选择培养基上筛选到能够增殖的融合菌株，其中酵母菌为大肠杆菌提供，大肠杆菌为酵母菌提供，表明二者建立了互利共生关系。在筛选融合菌株时，不能用葡萄糖为碳源，原因是：。【答案】(1)线粒体(2)(3)PEG（或聚乙二醇，或高Ca2+-高pH）细胞壁外层（或外层脂质双分子层膜）维生素B1ATP葡萄糖可在酵母细胞质中分解产生ATP，未与大肠杆菌融合的酵母也可存活【分析】PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。（4）条件：Mg2+、模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。【详解】（1）线粒体是有氧呼吸产生ATP的主要场所，要获得专性厌氧呼吸的酵母菌株，利用基因敲除技术破坏酵母菌线粒体的功能，就能导致该细胞器不能产生ATP。（2）要使质粒1线性化，且能与扩增后的基因X经酶切、连接重组为质粒2，引物P3和P4应分别位于质粒1的两端，且方向相反（因为PCR扩增时引物是从5’到3’方向延伸的，这样才能保证扩增出的线性化质粒两端分别带有EcoRⅠ和NotⅠ识别序列，与基因X两端的酶切位点匹配）。位置及方向如图：。（3）促进膜融合的化学试剂通常选择PEG（或聚乙二醇，或高Ca2+-高pH）。大肠杆菌细胞壁外层为脂质双分子层膜结构，融合细胞中的大肠杆菌形态正常且具有活性，说明与酵母细胞膜融合的是菌株B的细胞壁外层（或外层脂质双分子层膜）。在以丙酮酸为唯一碳源的选择培养基上，酵母菌可进行代谢为大肠杆菌提供维生素B1，大肠杆菌能分泌ATP，为酵母菌提供ATP，表明二者建立了互利共生关系。不能用葡萄糖为碳源筛选融合菌株，原因是葡萄糖可在酵母细胞质中分解产生ATP，未与大肠杆菌融合的酵母也可存活，二者都能在以葡萄糖为碳源的培养基上都能生长，无法区分出只有二者互利共生才能生长的融合菌株。例2.（2025·广西·高考真题）CAR-T是指通过基因工程技术表达CAR基因的T细胞。CAR-T能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T过程见图，回答下列问题：(1)构建含CAR基因的重组质粒，选用的限制酶组合是。(2)将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原因是。(3)将获得的重组质粒导入T细胞并成功表达后，为了研究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，除了有CAR-T与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有（至少写出2点）。(4)研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合以及。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T难以接触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中①是，②是，③是，④是。【答案】(1)EcoRⅠ、NotⅠ(2)便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落(3)肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等(4)减少CAR-T细胞表面PD-1的表达CAR序列终止子溶解酶1基因序列溶解酶2基因序列【分析】1、基因工程的工具：①限制酶，能识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；②DNA连接酶，连接两个核苷酸之间的磷酸二酯键；③运载体，质粒是最常用的运载体，除此之外，还有λ噬菌体衍生物、动植物病毒。2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有利用PCR技术扩增和人工合成等。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法等；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。【详解】（1）构建含CAR基因的重组质粒，为了避免质粒和目的基因自连、目的基因反向插入，常采用双酶切法；目的基因CAR基因需要插入质粒的启动子和终止子区域，而限制酶ClaⅠ和HindⅢ位于启动子和终止子区域之外，且CAR基因片段中间含有BamHⅠ识别序列，故应该选用EcoRⅠ和NotⅠ分别切割CAR基因和质粒。（2）固体培养基通常是在液体培养基中添加一定量的凝固剂制成的。在固体培养基上，人们可以清楚地观察到在培养基表面由单个细胞生长繁殖成的菌落，质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养的目的是便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落，方便后续筛选出重组质粒。（3）研究目的是探究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，自变量为是否含有CAR基因的T细胞，而因变量抗肿瘤效果，即肿瘤细胞凋亡率的检测指标为肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等；实验组为CAR-T与肿瘤细胞共同培养，对照组为肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养。（4）肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制，为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合，使用PD-1抗体、PD-L1抗体分别与PD-1、PD-L1的结合，或减少CAR-T细胞表面PD-1的表达；根据题干信息：与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子，且需要减弱原有PD-1启动的抑制通路，表达CAR基因的T细胞能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，可知新的重组质粒中①是CAR序列；溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率，且P启动子是双向启动子，可知②是终止子，③是溶解酶1基因序列，④是溶解酶2基因序列。1．研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。所用农杆菌的Ti质粒的结构如图所示，其中Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移，回答下列问题:(1)利用PCR可以快速扩增抗冻蛋白基因afp，PCR反应需要提供DNA模板、引物、脱氧核苷酸和，需要在一定的缓冲液中进行，缓冲液中Mg²⁺的作用是。(2)构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶和酶。根据图中农杆菌的Ti质粒的结构，为提高农杆菌的转化效率，构建重组质粒应选择的限制酶是。(3)采用农杆菌转化法能将afp基因导入番茄细胞利用了农杆菌的特点是。(4)为检测抗冻的番茄培育是否成功，首先进行分子水平的检测，所采用的生物技术有和。【答案】(1)耐高温的DNA聚合酶激活DNA聚合酶(2)DNA连接限制酶Ⅲ(3)农杆菌中的T-DNA能转移到番茄细胞内，并整合到其染色体DNA上(含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞并将其整合到该细胞的染色体上)(4)PCR技术抗原-抗体杂交技术【分析】基因工程基本操作程序包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。【详解】（1）PCR反应需要提供DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。需要在一定的缓冲液中进行，缓冲液中Mg²⁺的作用是激活DNA聚合酶。（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶和DNA连接酶。构建重组质粒，应选择的限制酶是限制酶Ⅲ，使用限制酶Ⅰ会破坏标记基因（四环素抗性基因），使用限制酶Ⅱ会破坏Vir区活化基因。（3）农杆菌的特点是T-DNA能转移到番茄细胞内，并整合到其染色体DNA上(含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞并将其整合到该细胞的染色体上)。（4）为检测抗冻的番茄培育是否成功，首先进行分子水平的检测，所采用的生物技术有通过PCR技术检测番茄细胞的染色体DNA上是否插入了含基因afp的T-DNA，或检测基因afp是否转录出mRNA，利用抗原-抗体杂交技术检测基因afp是否翻译出抗冻蛋白。2．研究人员将海岛棉中抗草铵膦除草剂基因Bar导入陆地棉中，经培养筛选获得抗草铵膦除草剂的棉花。据图回答下列问题：(1)为了便于质粒和Bar基因连接构建基因表达载体，在利用PCR技术扩增Bar基因时需要设计特定的引物，结合图1分析，左边引物要包括哪些碱基序列（注明引物的方向）。耐高温的DNA聚合酶从引物的端开始连接脱氧核苷酸。与单酶切相比，双酶切构建基因表达载体的优点是（答出1点）。(2)图1质粒中TetR基因的作用是；利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，一般选择陆地棉的细胞作为受体细胞，最终得到的转基因棉花不具有抗四环素的特性，原因是。(3)为了鉴定转基因棉培育是否成功，可提取转基因棉花的基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳对提取到的DNA样品进行检测，在凝胶中DNA分子的迁移速率除与DNA分子的大小有关外，还与有关（答出2点）；还可以从个体水平进行鉴定，方法是。【答案】(1)5’-GAATTCATGGGC-3’3’能避免目的基因和载体自身环化（能避免目的基因与载体反向连接）(2)作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选（答到标记基因即可）受精卵或体细胞只有T-DNA片段能转移并整合到受体细胞的染色体DNA上，而TetR基因不在T-DNA片段上(3)凝胶浓度、分子构象（电场强度）用草铵膦处理陆地棉，观察其是否能正常生长【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。【详解】（1）扩增Bar基因，需要设计2种引物，分别与模板DNA的两条链的3’端进行配对，根据限制酶位点、转录方向和碱基互补配对原则，左边引物应该与EcoRⅠ和Bar基因的下面一条链配对，即左边引物为5’-GAATTCATGGGC-3’。耐高温的DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。与单酶切相比，双酶切构建基因表达载体的优点是防止目的基因和质粒自身环化，防止目的基因反向接入质粒。（2）图1质粒中TetR基因的作用是作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选。一般利用农杆菌转化法将目的基因导入植物的受精卵或体细胞，随后采用植物组织培养技术将转基因植物细胞培育成转基因植株，由于只有T-DNA片段能转移并整合到受体细胞的染色体DNA上，而TetR基因不在T-DNA片段上，所以最终获得的转基因棉花不含抗四环素基因，不具有抗四环素的特有。【点睛】在凝胶中DNA分子的迁移速率除与DNA分子的大小有关外，还与凝胶浓度、分子构象、电场强度等有关。由于Bar基因控制性状具有抗草铵膦除草剂的作用，所以可以用抗草铵膦处理陆地棉，观察其是否能正常生长，若能正常生长，则表明转基因棉培育成功。3．土壤中的污染物RDX具有高毒性和不易降解的特点。研究人员拟将细菌的RDX降解酶基因XplA与XplB整合为融合基因，导入柳枝稷草使其根细胞分泌RDX降解酶，以修复污染土壤。图1、2为降解酶基因XplA、XplB及农杆菌转化流程示意图。回答下列问题：(1)获取XplA与XplB基因。随着测序技术的发展，可通过检索获取XplA与XplB的相关序列，然后用法制备得到。(2)通过融合PCR获得XplB-XplA融合基因。为使两基因能正确融合并表达，引物和的端需包含部分互补序列。同时部分引物还应包含相应的限制酶识别序列。PCR循环步骤中，步骤的温度需根据引物的碱基组成（GC含量）调整，引物长度一定时，GC含量增加（合理范围内），该步骤温度应，其目的是。(3)图2中，将融合基因插入Ti质粒T-DNA区后，可通过PCR验证重组质粒是否构建成功，该过程中常采用技术鉴定PCR产物，再将重组质粒与经处理的农杆菌混合以实现转化。在添加潮霉素的LB培养基中（填“能”或“不能”）直接筛选出导入融合基因的农杆菌。(4)获得融合基因转化成功的目的农杆菌后，对其进行。再用农杆菌侵染经消毒的柳枝稷草外植体，其Ti质粒上的T-DNA可将融合基因整合到柳枝稷草细胞的。若经组织培养获得了转基因柳枝稷草，但其根细胞仍不能合成RDX降解酶，从基因表达调控角度分析，可能的原因是（结合载体具体元件分析）。【答案】(1)基因数据库化学合成(2)245'退火升高提高引物与模板结合的特异性，减少引物与非目标序列结合导致的非特异性扩增(3)琼脂糖凝胶电泳CaCl2不能(4)扩大培养染色体DNA柳枝稷草的根细胞中缺乏识别融合基因启动子的RNA聚合酶（该融合基因启动子在柳枝稷草根细胞中活性不足）【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。【详解】（1）现代分子生物学中，目的基因的序列可通过基因数据库检索获得，若序列已知，可通过化学合成法直接合成。（2）构建融合基因需把基因XplA的b链的3'端与基因XplB的a链的5'端相连，理由是DNA两条链反向平行，基因XplA和XplB共用启动子和终止子，且转录时只能以模板链的3'→5'方向为模板进行转录，要使融合基因能正常转录，需将基因XplA的b链的3'端与基因XplB的a链的5'端相连。利用PCR拼接融合基因时，需在引物2和引物4的5'端加入互补序列，这样在PCR过程中，引物2和引物4扩增出的片段就能通过互补序列连接形成融合基因。PCR的复性（退火）步骤温度由引物GC含量决定：GC碱基对含3个氢键，稳定性更高，因此GC含量增加时，复性温度需升高，以提高引物与模板结合的特异性，减少引物与非目标序列结合导致的非特异性扩增。（3）PCR产物的鉴定常用琼脂糖凝胶电泳（根据片段大小判断是否扩增出目标融合基因）。农杆菌转化需用CaCl2处理，使其细胞膜通透性增加，成为感受态细胞。潮霉素抗性基因是载体上的标记基因，导入了重组质粒和空质粒的农杆菌均能在添加潮霉素的LB培养基中生长，因此不能直接筛选出导入融合基因的农杆菌。（4）目的农杆菌需先扩大培养（至对数期），以保证侵染效率。农杆菌Ti质粒的T-DNA可将携带的融合基因整合到受体细胞（柳枝稷草）的染色体DNA上，实现稳定表达。基因表达需启动子（驱动转录）和终止子（终止转录）等关键元件：若柳枝稷草的根细胞中缺乏识别融合基因启动子的RNA聚合酶（该融合基因启动子在柳枝稷草根细胞中活性不足）则无法启动转录，最终导致根细胞不能合成RDX降解酶。考向02基因工程在农业领域的应用为高频应用考向，结合农业生产实际场景出题。核心考查抗虫、抗病、抗逆（抗盐碱、抗干旱）转基因作物的培育原理，如抗虫棉中Bt毒蛋白基因的表达机制、抗除草剂作物的作用靶点；还会涉及转基因作物的优势分析（如减少农药使用）及育种流程的优化，需将基因工程技术与作物育种需求结合。1、应用方向定位技巧：聚焦农业核心需求，明确三大高频应用方向——抗逆（抗虫、抗病、抗除草剂、耐盐碱）、改良品质（提高营养含量、改善口感）、提高产量（促进生长、抗倒伏）。解题时先锁定题干需求，对应匹配基因工程技术路径，如抗虫需求优先关联Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因。2、核心操作适配技巧：结合农业应用场景细化操作流程——目的基因选择需针对性（抗虫选Bt基因，抗除草剂选EPSPS基因）；载体常用农杆菌Ti质粒（植物转化首选）；导入方法优先农杆菌转化法（双子叶植物）或基因枪法（单子叶植物）；检测鉴定需兼顾分子水平（抗原-抗体杂交验证表达）和田间实验（抗虫性、产量对比）。3、优势与问题分析逻辑：答题需体现“技术优势→实际价值”“潜在风险→应对措施”。优势如减少农药使用（抗虫作物）、拓宽种植范围（耐盐碱作物）；风险如基因污染、害虫抗药性，应对措施可提“合理布局非转基因作物”“多基因叠加导入”。4、规范答题模板：按“需求→基因选择→操作流程→应用效果”表述，例：“为培育抗虫棉花，选择Bt毒蛋白基因作为目的基因，与Ti质粒构建表达载体，通过农杆菌转化法导入棉花细胞，经筛选鉴定获得转基因植株，其可表达抗虫蛋白，减少农药使用，提高产量”。例1.（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题：(1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及检测，筛选获得重组菌株W1。(2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有（答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是。(3)研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为。(4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：。【答案】(1)mKate2蛋白或荧光(2)细菌计数板计数法作为mKate2蛋白的荧光对照PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解(3)快速生长期荧光值较低，生长稳定期快速增强(4)先敲除野生菌株中的酶B基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，并将两种质粒导入野生菌株中【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。2、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸。3、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。【详解】（1）在基因工程中，筛选重组菌株时，常用的检测方法除了PCR，根据质粒中存在红色荧光蛋白基因，可利用荧光检测，筛选获得重组菌株W1。（2）检测培养液中细胞密度常用的方法是细菌计数板计数法。接种前检测液体培养基的荧光强度，作用是作为mKate2蛋白的荧光对照。进入生长稳定期后，由于PGro在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，同时C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。（3）在重组菌株W2中，启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在细胞快速生长阶段，阻遏蛋白X阻遏mKate2基因的表达；随着细胞进入生长稳定器，阻遏蛋白X停止表达并被降解，对PX启动子的阻遏作用降低，mKate2基因开始表达，荧光强度开始上升，由于原料的限制，最后保持稳定，所以培养期间荧光强度的变化趋势为快速生长期荧光值较低，生长稳定期快速增强。（4）为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除酶B基因；然后将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后该酶降解，减少对莽草酸的转化；同时将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，利用其调控机制在生长稳定期实现莽草酸合成相关基因的稳定表达，从而大量积累莽草酸，最后将两种质粒导入野生菌株。1．水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器（如图1），为环境污染治理提供新方法。请回答下列问题：(1)基因工程中启动子与增强子都与基因转录有关，增强子可增强转录效率。启动子是，其位于基因的上游，紧挨。(2)分析上图可知，当环境中存在水杨酸时，可激活Ps，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。(3)研究人员欲通过改造重组质粒，实现在相同浓度的水杨酸条件下荧光强度增强为原来的2倍，从而提高传感器的灵敏度。方法一是选择激活能力更强的调控蛋白基因nahRl替代nahR：方法二是在mrfp基因前插入。(4)水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基因与mrfp基因连接成融合基因，则工程菌可同时实现对水杨酸的。现欲通过PCR判定融合基因已准确连接，应选择图2中的引物组合是。(5)工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdB两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdA、ccdB分别插入图3中的、（填字母）位点。【答案】(1)RNA聚合酶识别和结合的位点转录的起始位点(2)水杨酸-调控蛋白复合物(3)提高表达效率的DNA序列/增强子/强启动子(4)动态检测和清除引物1和引物3(5)CB【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定。【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，启动子位于转录的起始位点上游，其作用是起始转录。（2）从图中可知，当环境中存在水杨酸时，水杨酸-调控蛋白复合物可激活Ps启动子，启动基因表达红色荧光蛋白，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。（3）方法一：基因工程中用到的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶，改造重组质粒，用基因nahRI替代nahR，需要先用限制性核酸内切酶切割质粒和基因，再用DNA连接酶将基因连接到质粒上。方法二：选择灵敏度更高的启动子替代Ps，在mrfp基因前插入提高表达效率的DNA序列，使启动子能更高效地启动下游基因表达，从而提高红色荧光蛋白的表达量，增强荧光强度。（4）水杨酸是常见的水体污染物，若将水杨酸羟化酶基因与mrfp基因连接成融合基因，则工程菌可同时实现对水杨酸的动态检测和清除。PCR技术要求引物与模板链的3'端互补配对，且DNA聚合酶从引物的3'端开始延伸子链。要判定水杨酸羟化酶基因与基因连接成的融合基因已准确连接，需要选择能扩增出融合基因的引物组合。引物1和引物3可以分别与融合基因中水杨酸羟化酶基因的3'端和mrfp基因的3'端互补配对，从而扩增出融合基因，所以应选择的引物组合是引物1和引物3。（5）ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，为了保证在水杨酸存在时工程菌正常生存，ccdA应插入在Ps启动子之后，即图中的C位点，这样在水杨酸存在时，Ps启动子启动，ccdA基因表达抗毒素蛋白；ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，当水杨酸被耗尽时，Ps启动子不再启动，此时要让工程菌启动“自毁”，ccdB应插入在Pc启动子控制的区域，所以应插入Pc启动子之后，即图中的B位点。2．赖氨酸是人体必需氨基酸之一，但玉米种子中赖氨酸含量较低，影响其营养价值。科学家发现，玉米中赖氨酸的合成受关键酶（天冬氨酸激酶，AK）的反馈抑制：当赖氨酸积累时，AK活性被抑制。通过基因工程改造AK基因，可解除这种抑制，从而提高赖氨酸含量。下图为科学家拟用农杆菌转化法将改造后的AK基因导入玉米细胞的示意图，回答下列问题：(1)天然玉米中，赖氨酸对AK的抑制作用属于调节，这种调节的意义是。(2)为便于筛选，应选择的农杆菌作为受体细胞。在构建基因表达载体时需将AK基因插入Ti质粒的T-DNA区域，目的是。(3)已知AK基因的a链为模板链，则在PCR扩增AK基因时应在图示的3’端添加的酶切位点，便于AK基因的正确连接和表达。启动子应选择玉米种子特异性启动子，目的是。为验证AK基因是否成功表达，可采用的检测方法是。(4)与传统诱变和杂交育种相比，基因工程培育高赖氨酸玉米的优势是。【答案】(1)（负）反馈避免物质和能量浪费，维持代谢平衡(2)对四环素敏感使目的基因随T-DNA转移至受体细胞并整合到染色体DNA上(3)Hind让AK基因在玉米种子中特异性表达抗原-抗体杂交(4)定向改造性状，克服远缘杂交障碍，缩短育种周期等【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。【详解】（1）分析题意可知，玉米中赖氨酸的合成受关键酶（天冬氨酸激酶，AK）的反馈抑制：当赖氨酸积累时，AK活性被抑制，调节过程的结果与起点相反，故该代谢过程体现负反馈调节，这种调节可避免细胞内物质和能量浪费，维持代谢平衡。（2）受体菌的选择应结合载体上的标记基因，因此应选择对四环素敏感（不含四环素抗性基因）的农杆菌；T-DNA是可转移DNA，将AK基因插入Ti质柱的T-DNA区域，目的是T-DNA可转移至受体细胞并整合到染色体DNA上。（3）为了便于AK基因的正确连接和表达，限制酶应位于启动子和终止子之间，且图示BclI会破坏启动子，故应选择Hind和BamH两种限制酶切割质粒，AK基因的a链为模板链，其3’端的上游为启动子位置，因此应在PCR扩增AK基因时应在其3’端添加Hind的酶切位点；选择玉米种子特异性启动子，目的是让AK基因在玉米种子中特异性表达，从而增加玉米种子中赖氨酸的含量；AK基因最终表达的产物是蛋白质，抗原与抗体的结合具有特异性，故为验证AK基因是否成功表达，可采用的检测方法是抗原-抗体杂交。（4）与传统诱变和杂交育种相比，基因工程培育高赖氨酸玉米的优势是能定向改造性状，能克服远缘杂交不亲和的障碍，缩短育种周期等优点。3．C4植物玉米细胞内存在GOLDEN2（G2）基因和GOLDEN2-LIKE（GLK）基因，它们通过激活位于叶绿体内编码光合作用相关蛋白的基因来调控光合作用。为研究这两种基因在光合作用中的作用，科学家利用构建的过表达G2基因水稻ZmG2、过表达GLK基因水稻ZmGLK1和野生型水稻WT（无GLK和G2基因）作为研究对象，探究了它们在田间生长时相关因素的变化情况，结果如图1所示。请回答下列问题：(1)在叶绿体基质中分布有DNA、RNA以及（结构），因此叶绿体可以进行DNA的复制和基因的表达。从细胞核基因控制的角度分析，叶绿体是（填“完全”或“不完全”）自主性细胞器。(2)结合图甲和图乙所示结果，转基因水稻相较于野生型水稻产量（填“增加”或“减少），原因是G2基因和GLK基因。(3)当植物光合结构吸收的光能超过光合作用所能利用的量时，过剩的光能会引起光能转化效率的下降，这种现象即光抑制。为探究光抑制对ZmGLK1和ZmC2的影响，科学家测定了高光照处理后光系统Ⅱ（PSⅡ）的最大光化学效率（Fv/Fm,即植物的最大光能转化效率）和热耗散（NPQ,即光能以热能形式散失）变化，如图2ⅰ和图ⅱ。根据实验结果可知，转基因水稻ZmGLK1和ZmG2的光抑制强度（填“高于”或“低于”）野生型水稻，结合图示分析出现该现象的机制是。【答案】(1)核糖体不完全(2)增加激活了编码光合作用相关蛋白的基因，促使它们表达出相应的蛋白质，促进光合色素的合成和气孔导度的增大，从而促进光合作用速率，使水稻产量更高(3)低于高光照条件下，转基因植物通过提高热耗散，将更多过剩的光能转化为热能散失掉，减小过剩的光能对光能转化效率的抑制，使光抑制强度下降【分析】光合作用包括光反应和暗反应两个阶段。光反应发生场所在叶绿体的类囊体薄膜上，色素吸收光照，吸收光能、传递光能，并将一部分光能用于水的光解生成NADPH和氧气，另一部分光能用于合成ATP；暗反应发生场所是叶绿体基质中，首先发生二氧化碳的固定，即二氧化碳和五碳化合物结合形成两分子的三碳化合物，三碳化合物利用光反应产生的NADPH和ATP被还原。【详解】（1）叶绿体基质中含有DNA、RNA和核糖体，使叶绿体能独立进行部分遗传信息的表达和蛋白质合成，但其基因表达会受到细胞核基因调控，故称为不完全自主性细胞器。（2）结合题意和图示可知转基因水稻含有的G2基因和GLK基因通过激活位于叶绿体内编码光合作用相关蛋白的基因来调控光合作用，故过表达G2基因水稻ZmG2、过表达GLK基因水稻ZmGLK1激活相关蛋白的基因，使相关基因表达的蛋白质促进转基因水稻合成更多光合色素和增大气孔导度，有利于提高光反应速率和吸收二氧化碳，增大光合作用强度，水稻产量提高。（3）由图i可知，转基因水稻ZmGLK1和ZmG2的Fv/Fm更高，即植物的最大光能转化效率高，光抑制弱，又由图ii可知，转基水稻ZmGLK1和ZmG2的NPQ更高，推测转基因植物通过提高热耗散，将更多过剩的光能转化为热能散失掉，减小过剩的光能对光能转化效率的抑制，使光抑制强度下降。考向03基因工程在医药与医学领域的应用侧重技术的医用价值，考查基因工程药物（如胰岛素、干扰素）的生产流程，即目的基因在工程菌中的高效表达条件；同时涵盖基因治疗的两种策略（体内基因治疗、体外基因治疗），以及针对遗传病、肿瘤等疾病的治疗原理，需区分基因工程药物生产与基因治疗的本质差异。1、应用方向定位技巧：聚焦医学核心需求，明确三大高频方向——药物生产（重组蛋白类药物）、基因治疗（遗传病/肿瘤）、诊断技术（分子探针）。解题时先锁定题干场景，如“生产胰岛素”对应重组药物，“治疗镰状细胞贫血”对应基因治疗，精准匹配技术路径。2、核心技术适配技巧：按应用场景细化操作——药物生产需选择高效表达载体（如大肠杆菌、酵母菌），目的基因多为功能蛋白基因（胰岛素、干扰素基因）；基因治疗分体外（提取细胞修饰后回输）和体内（直接导入治疗基因）途径，常用病毒载体（如逆转录病毒、腺病毒）；诊断技术依赖DNA分子杂交、PCR扩增等技术，实现病原体或基因突变检测。3、关键逻辑分析技巧：答题需体现“技术原理→临床价值”“风险防控”。如重组药物生产逻辑：目的基因克隆→构建表达载体→导入工程菌→表达纯化→药物制剂；基因治疗需强调“靶向性”和“安全性”，避免载体引发免疫反应。4、规范答题模板：按“需求→技术路径→核心操作→应用效果”表述，例：“为生产重组人胰岛素，先克隆人胰岛素基因，与大肠杆菌表达载体构建重组质粒，导入工程菌后诱导表达，经纯化获得药物，可精准调节血糖，治疗糖尿病”。例1.（2025·四川·高考真题）杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5-3方向。②密码子对应的氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。(1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是。(2)采用EcoRI和BamHI完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是。(3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带（填氨基酸名称）的tRNA进入结合位点，导致，最终引起细菌死亡。(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有（答出1点即可）。【答案】(1)F2、F4保证载体能在链霉菌细胞中能正常复制(2)2验证重组质粒是否构建成功(3)苯丙氨酸或phe翻译受阻(4)目的基因发生突变或变异发酵条件优化【分析】基因工程技术的基本步骤：

1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。【详解】（1）引物需要结合到模板的3'端，且与目的基因的部分碱基序列互补配对，子链延伸方向为5'端→3'端，因此用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用F2、F4引物。载体使用链霉菌的复制原点，是为了保证载体能在链霉菌细胞中复制，也使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传给后代。（2）采用EcoRI和BamHI完全酶切构建的重组质粒，会得到载体片段和目的基因片段，共2条电泳条带。电泳检测酶切产物的目的是检测重组质粒是否构建成功，若能得到预期的载体片段和目的基因片段大小的条带，说明酶切成功，重组质粒构建可能成功，但是还需要进一步的鉴定。（3）观察拉索西丁的作用机制图，结合所给密码子信息，可知拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点。因为位点2对应的密码子是UUC，编码苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点，会导致翻译过程无法正常进行，进而使细菌无法合成蛋白质，最终引起细菌死亡。（4）重组链霉菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是目的基因发生突变或变异，导致其表达的产物结构改变，从而失去杀菌活性；也可能是目的基因的表达受到抑制等。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有：优化发酵条件，如温度、pH、溶氧量等；如何提高发酵产物的产量；产物的分离和纯化方法等。例2.（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。(1)可从中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入和限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。(2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有的污染。初步判断实验组（从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是。(3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有。a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3'b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3'c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3'd：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3'(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。【答案】(1)基因数据库/序列数据库XhoⅠXbaⅠDNA连接酶(2)外源DNA1目的基因N大小为2.3kb(3)GCC(4)香树脂醇【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。【详解】（1）GenBank是目前国际上广泛使用的序列数据库之一，它的数据主要是各国的实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库或基因数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用SpeⅠ和XhoⅠ酶切，由于目的基因N含有SpeⅠ识别序列，故N基因不能使用SpeⅠ酶切，但XbaⅠ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用XbaⅠ替换SpeⅠ，即N基因两端应该含有XbaⅠ和XhoⅠ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1序列，而编码链的5'端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5'端添加XbaⅠ、引物15'端添加XhoⅠ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。（2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有外源DNA污染。（3）编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA；密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），可知a引物延伸后的序列为编码链；b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延伸后的序列为编码链，根据a引物5'-端首位GCA为240位，则c引物5'-端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。（4）题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。1．人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的胰岛素原，切除部分肽段（C肽段）后形成成熟的胰岛素，如图1所示。科学家据此提出了利用基因工程改造的大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用人体某细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。(1)AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列的原因是。(2)图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时需要添加限制酶的识别序列。根据图中限制酶识别及切割位点等信息，设计出适合目的基因上游引物,该引物的第1、9、15位的碱基分别是。(3)为获得更多的目的基因，需利用PCR技术进行扩增，引物与DNA结合发生在阶段，PCR第四次循环需要消耗对引物。(4)质粒中复制原点应使用大肠杆菌的复制原点的原因是(5)采用法将重组质粒导入大肠杆菌。【答案】(1)密码子具有简并性(2)C

G

C(3)复性阶段8(4)保证目的基因能在大肠杆菌细胞中正常复制(5)Ca2+【分析】PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术；因为DNA合成时，新链的延伸方向是5’→3’，因此，在设计PCR引物时需要在5’端加上酶切位点。【详解】（1）结合题干“AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段”，而一种氨基酸可能对应一种或多种密码子，即密码子具有简并性，导致AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。（2）分析图2可知：EcoRⅠ限制酶会破坏标记基因，不可用，SalⅠ和NheI限制酶会破坏目的基因，不可用，故选用XhoⅠ和MunⅠ限制酶切割质粒和目的基因，由目的基因的转录方向可知，上游引物的碱基序列为5'-ATGCCAATC-3'，由于需要在引物5'端加上XhoⅠ限制酶识别序列CTCGAG，故上游引物最终碱基序列为5'-CTCGAGATGCCAATC-3'，因此上游引物第1、9、15位的碱基分别为C、G、C。（3）PCR技术基本步骤为变性（高温使得DNA双链间的氢键断裂、解旋）→复性（降低温度，2种引物分别与2条DNA模板结合）→延伸（在耐高温DNA聚合酶的作用下进行子链的延伸），故引物与DNA结合发生在复性阶段；PCR第四次循环是在第三次循环的基础上进行的，经过第三次循环之后，产生的DNA分子为8个，以这8个DNA分子为模板（共16条链）进行复制，需要消耗16个引物，即第四次循环需要消耗8对引物。（4）结合题干，目的基因导入的受体细胞是大肠杆菌，故质粒中复制原点应使用大肠杆菌的复制原点的原因是保证目的基因能在大肠杆菌细胞中正常复制。（5）大肠杆菌为微生物，采用Ca2+法将重组质粒导入大肠杆菌，利用Ca2+处理大肠杆菌后，使其处于一种能从周围环境吸收DNA分子的状态。2．科学家设想将HIV的壳体蛋白（CA）基因与Ti质粒连接构建重组载体转染到枸杞细胞内，利用愈伤组织作为反应器生产HIV的壳体蛋白作为疫苗，以研究CA疫苗对人体的免疫应答。建立愈伤组织反应器的主要过程如下图所示。回答下列问题∶(1)①过程为，进行①过程操作的目的是。为获得大量图中的DNA片段（目的基因），科学家需要根据设计引物。若有a条起始的RNA片段，经过图中的①过程，再进行PCR循环30次，理论上PCR过程需要引物（用算式表示）个。(2)选用Ti质粒作为HIV壳体蛋白（CA）基因的载体，优点是∶。(3)切割CA-DNA和Ti质粒所用的限制性内切核酸酶是，不选用其他两种限制酶的原因是。(4)为了筛选出含重组载体的农杆菌，在选择培养基上添加氨苄青霉素，一段时间后，培养基上形成的菌落（填“一定”或“不一定”）含有重组载体，原因是。是否成功培育出转基因植株需从与个体水平上对转基因植株进行检测与鉴定。【答案】(1)逆转录将单链RNA逆转录为双链DNA，获得CA基因的DNA片段以便与Ti质粒连接成重组载体目的基因DNA片段上游和下游的部分核苷酸序列a×（231-2）(2)Ti质粒的T-DNA能将目的基因转移并整合到侵染植物细胞的染色体DNA上(3)PatI和BamHIEcoRI会破坏目的基因，NotI的切割位点不在T-DNA中(4)不一定空载体和重组载体均含有氨苄青霉素抗性基因分子水平（PCR技术检测目的植株是否含有目的基因，或者检测目的基因是否转录；还可以通过抗原-抗体杂交检测目的基因是否翻译出相应的蛋白质）【分析】1、利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测。【详解】（1）从图中可以看出，①过程是从RNA合成DNA的过程，这一过程为逆转录，进行①过程操作的目的是将单链RNA逆转录为双链DNA，获得CA基因的DNA片段以便与Ti质粒连接成重组载体。PCR技术扩增目的基因时，需要根据目的基因DNA片段上游和下游的部分核苷酸序列来设计引物。因为引物要与模板链特定区域互补配对，这样才能引导DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，从而扩增出目的基因。PCR技术中，DNA复制遵循半保留复制原则。一个DNA分子经过n次循环后，得到2n个DNA分子。起始有a条RNA片段，逆转录得到a条cDNA，相当于起始有a个DNA模板。1个DNA分子经过30次PCR循环后，得到的DNA分子总数为230个，而最初的DNA模板有a个，所以总共形成的DNA分子数是a×230个。多数DNA分子需要2条引物，但是刚开始的模板链不需要连接引物，因此理论上PCR过程需要引物a×（231-2）个。（2）选用Ti质粒作为HIV壳体蛋白（CA）基因的载体，优点是Ti质粒的T-DNA能将目的基因转移并整合到侵染植物细胞的染色体DNA上。（3）因为EcoRI会破坏目的基因，NotI的切割位点不在T-DNA中，所以选用PatI和BamHI切割CA-DNA和Ti质粒。（4）由于空载体和重组载体均含有氨苄青霉素抗性基因，故在选择培养基上添加氨苄青霉素，一段时间后，培养基上形成的菌落不一定含有重组载体。目的基因的检测包括分子水平和个体水平检测，是否成功培育出转基因植株需从分子水平（PCR技术检测目的植株是否含有目的基因，或者检测目的基因是否转录，还可以通过抗原-抗体杂交检测目的基因是否翻译出相应的蛋白质）与个体水平上对转基因植株进行检测与鉴定。3．人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的胰岛素原，切除部分肽段（C肽段）后形成成熟的胰岛素，如图1所示。科学家据此提出了利用基因工程改造的大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用人体某细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。(1)AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列的原因是。BCA法是从人体胰岛B细胞中获取mRNA，再由mRNA（填过程）得到胰岛素基因。(2)图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶（选填编号）的识别序列。①MunI

②XhoI

③EcoRI

④SalI

⑤NheI(3)实践操作中，通过添加保护碱基序列GGG可以延长限制酶识别序列一端的碱基数，从而提高限制酶识别及切割的效率。根据上述信息，设计出适合作为目的基因上游引物的序列5′—-3'（写出18个碱基）(4)采用法将重组质粒导入大肠杆菌。β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质，筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，应在培养基中加入，应选择培养基上（填“蓝色”或“白色”）的菌落。【答案】(1)1种氨基酸可能对应1种或多种密码子（密码子具有简并性）逆转录(2)①②(3)GGGCTCGAGATGCCAATC(4)Ca2+处理氨苄青霉素和X-gal白色【分析】PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。【详解】（1）AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，由于密码子具有简并性，即1种氨基酸可能对应1种或多种密码子，所以AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种序列。BCA法中mRNA为模板合成DNA的过程称为逆转录。（2）由图可知，对于目的基因，SalI和NheI的作用位点在目的基因的中间，会破坏目的基因，则在引物设计时不能选用这两种限制酶，那么只能在XhoI、MunI和EcoRI中选择；同时质粒上EcoRI的其中一个作用位点是在标记基因（Amp）上，所以只能选择XhoI和MunI两种限制酶，则需要在设计PCR引物时可添加限制酶XhoI和MunI的识别序列。（3）由转录方向可知目的基因左边（上游）应该与启动子相连，添加XhoI识别序列（5'-CTCGAG-3'）；目的基因右边（下游）应该与终止子相连，添加MunI识别序列，且引物的5′端与基因的3端连接。另外，由题干信息可知在限制酶最前端添加GGG可以提高限制酶识别及切割的效率。因此目的基因上游序列为3'-TACGGTTAG-5'，与其互补的上游引物序列为5′-GGGCTCGAGATGCCAATC-3'。（4）采用Ca2+处理法将重组质粒导入大肠杆菌，Ca2+可以使大肠杆菌变为容易吸收外界物质的感受态。结合图示可知，将目的基因的插入的位置是在lacZ基因中，会破坏lacZ基因的结构，不能产生β-半乳糖苷酶，根据题干信息“β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质”，故目的基因的插入破坏了lacZ基因的结构，使其不能正常表达产生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不会被分解，所以筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，在添加了氨苄青霉素（Amp为标记基因）和X-gal的培养基上应选择白色的菌落。考向04蛋白质工程的应用蛋白质工程作为基因工程的延伸，其高考应用类题型围绕“原理-改造-应用-争议”的核心逻辑展开考查，聚焦逆向工程本质与实践场景的结合。题型核心先立足基础原理，重点检测“从预期蛋白质功能出发，设计蛋白质结构、推测氨基酸序列，进而改造基因序列”的逆向逻辑，同时需区分其与基因工程“生产天然蛋白质”的差异，拆解分子设计、基因改造、表达鉴定等关键流程。高频考向集中在医药领域，涉及人源化抗体改造以降低免疫原性、酶类药物（如长效胰岛素）的活性优化、疫苗抗原修饰以增强免疫效果等“定制化”应用，凸显临床价值。工农领域则侧重功能蛋白的定向改良，农业中通过改造抗逆蛋白、贮藏蛋白提升作物抗逆性与营养品质，工业上优化纤维素酶、蛋白酶的热稳定性和催化效率以适配生产需求。此外，试题还会考查技术瓶颈与伦理争议，如蛋白质空间结构预测难度、表达折叠障碍，以及医用蛋白的免疫风险、生态影响等，全面检测学生的知识应用与辩证思维能力。1、应用方向定位技巧：紧扣“功能优化”核心需求，明确三大高频方向——改造现有蛋白质（如提高酶的热稳定性、改变抗体亲和力）、合成新型蛋白质（如设计抗菌肽、肿瘤靶向蛋白）、修正异常蛋白（如治疗遗传病的功能蛋白）。解题时先锁定题干功能需求，如“耐高温蛋白酶”对应改造酶的结构，精准匹配技术路径。2、核心改造流程技巧：牢记“从基因入手”的本质，流程为“预期蛋白质功能→设计预期氨基酸序列→推测对应基因序列→改造/合成基因→表达验证蛋白质”。关键在于“基因修饰”，需通过碱基对替换、插入或缺失改变氨基酸序列，进而优化蛋白质结构与功能，避免混淆“蛋白质直接改造”（不可行