2026年高考生物二轮突破复习：题型 05 基因工程的应用（4大考向）（原卷版）

/题型05基因工程的应用目录目录第一部分题型解码高屋建瓴，掌握全局第二部分考向破译微观解剖，精细教学考向解读方法透视典例引领变式演练考向01基因工程核心操作流程考向02基因工程在农业领域的应用考向03基因工程在医药与医学领域的应用考向04蛋白质工程的应用第三部分新题演练整合应用，模拟实战高考真题命题点常见设问/关键词2025

黑吉辽蒙：PCR的原理、应用；浙江：PCR原理、目的基因的获取；河北：基因自由组合定律的实质和应用

基因突变

PCR扩增的原理与过程

基因连锁与交换定律；江苏：基因突变与基因工程；安徽：基因工程与发酵工程（PCR

扩增、菌种筛选、发酵条件控制）；山东：基因工程与发酵工程（PCR

扩增、菌种筛选、发酵条件控制）；陕晋青宁：基因工程的操作程序综合；湖南：基因表达载体的构建；动物细胞融合与单克隆抗体的制备；北京：PCR技术的应用；2024·北京：贵州：限制酶的作用特点；甘肃、湖北、江西：基因工程技术的基本步骤；浙江：引物、凝胶电泳；山东、安徽：DNA粗提取与鉴定、PCR条件；河北：PCR的原理、条件；吉林：琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物；全国、重庆2023·浙江：PCR技术；广东、湖南：基因工程培养抗逆性作物；山西、山东、湖北：构建基因表达载体；设问关键词：限制酶、基因表达载体的组成包括哪些元件、构建过程中为何要选择同种限制酶切割目的基因和载体、启动子的作用是什么关键技巧解答高考生物基因工程应用类非选择题，需紧扣操作流程与核心原理。首先要明确基因工程工具的特性，限制酶需识别特定序列且注意黏性末端匹配，载体要具备标记基因等必备元件。构建表达载体时，需牢记其包含目的基因、启动子、终止子和标记基因，且启动子需适配受体细胞类型。目的基因导入环节，要区分动植物和微生物的不同方法，如农杆菌转化法适用于植物、显微注射法用于动物。筛选鉴定需分层次，先通过标记基因筛选导入成功的受体细胞，再用分子杂交技术检测目的基因的转录与表达。答题时结合题干应用场景，用专业术语规范表述操作逻辑，确保流程与原理对应。思维误区1、工具酶功能认知混淆易混淆限制酶与DNA连接酶的作用，误将限制酶的“切割磷酸二酯键”等同于DNA连接酶的“连接氢键”；同时忽略DNA聚合酶与DNA连接酶的差异，认为二者均可连接DNA片段，实则前者仅用于DNA复制时单链的延伸，后者才用于目的基因与载体的拼接。2、基因表达载体元件理解偏差误认为基因表达载体只需包含目的基因，遗漏启动子、终止子、标记基因等核心元件；还会混淆启动子与起始密码子、终止子与终止密码子的概念，将调控转录的启动子/终止子归为翻译层面的密码子，忽略二者的作用阶段和本质差异。3、目的基因导入方法与受体细胞错配对不同受体细胞的导入方法记忆混乱，比如将农杆菌转化法用于动物细胞，或将显微注射法用于微生物细胞；同时忽视受体细胞的特殊性，如导入植物细胞时未考虑体细胞需经植物组织培养才能获得转基因植株，导入微生物细胞前未进行Ca²⁺处理增加通透性。4、筛选鉴定层次与方法混淆把“筛选成功导入载体的受体细胞”和“鉴定目的基因是否表达”的方法混为一谈，比如用抗原-抗体杂交技术筛选导入载体的细胞，而非仅用于检测蛋白质水平的表达；还会遗漏分子水平检测的多步流程，仅进行标记基因筛选就判定目的基因已成功表达。5、基因工程安全性与应用原理脱节分析转基因生物安全性时，仅泛泛提及“生态风险”，未结合具体实例（如抗虫基因可能流向近缘物种）；在解释基因工程应用机理时，如抗虫棉的抗虫原理，误将Bt毒蛋白基因直接等同于毒蛋白，忽略基因需经转录翻译才能合成抗虫蛋白的过程。考向01基因工程核心操作流程这是基础考向，聚焦基因工程的核心步骤与工具。常以流程图为载体，考查限制酶、DNA连接酶等工具酶的选择与作用，基因表达载体的必备元件（启动子、终止子、目的基因、标记基因）及构建逻辑，还有目的基因导入不同受体细胞（植物、动物、微生物）的方法差异，需精准区分各步骤的原理与操作细节。1、核心操作流程技巧：牢记“获取目的基因→构建基因表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定”四步流程。目的基因获取可通过PCR扩增、从基因文库中提取；基因表达载体构建是核心，需含启动子、目的基因、终止子、标记基因（如抗生素抗性基因）；导入受体细胞方法需匹配生物类型（植物用农杆菌转化法，动物用显微注射法，微生物用感受态细胞法）。2、关键步骤分析逻辑：构建表达载体时，需用同种限制酶切割目的基因和载体，再用DNA连接酶连接，保证目的基因正确插入；检测鉴定分三步——分子水平检测（DNA分子杂交、分子杂交、抗原-抗体杂交）和个体水平鉴定（如抗虫实验），解题时按“步骤→工具→目的”梳理，明确各环节作用。3、应用场景匹配技巧：基因工程应用聚焦“医疗、农业、环保”三大领域。医疗上如生产胰岛素、基因治疗遗传病；农业上如培育抗虫（Bt毒蛋白基因）、抗逆作物；环保上如降解污染物的基因工程菌。答题时需结合具体应用，对应核心操作流程，说明技术原理。4、规范答题模板：按“操作流程→核心工具→应用场景→预期效果”表述，例：“该基因工程中，先通过PCR扩增获取抗虫基因，与含标记基因的载体用限制酶和DNA连接酶构建表达载体，经农杆菌转化法导入棉花细胞，通过抗原-抗体杂交检测目的基因表达，最终培育出抗虫棉花品种”。例1.（2025·天津·高考真题）内共生假说认为，线粒体起源于在厌氧真核细胞中共生的需氧细菌。研究人员将经过改造的大肠杆菌导入相应的专性厌氧酵母细胞质中构建共生体，为上述假说提供证据。(1)获得专性厌氧呼吸的酵母菌株利用基因敲除技术破坏酵母菌的功能，导致该细胞器不能产生ATP。(2)获得维生素营养缺陷且能分泌ATP的大肠杆菌菌株①利用基因敲除技术获得维生素营养缺陷型大肠杆菌菌株A。②构建含有ATP转运蛋白基因X的质粒2。已知在基因X和质粒1上均无EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点。研究者采用引物P1（含EcoRⅠ识别序列）和P2（含NotⅠ识别序列）对基因X进行扩增，并采用引物P3（含EcoRⅠ识别序列）和P4（含NotⅠ识别序列）对质粒1进行扩增，使质粒1线性化，再经酶切、连接，使基因X与质粒1重组为质粒2．请在下图质粒1处标出引物P3和P4的位置及方向。③将质粒2转入菌株A中，筛选获得菌株B。(3)采用下图所示过程将菌株B导入步骤（1）获得的酵母菌中，筛选获得融合菌株促进膜融合的化学试剂通常选择。大肠杆菌细胞壁为双层结构，内层为坚固的肽聚糖，外层为脂质双分子层膜结构。融合细胞中的大肠杆菌形态正常且具有活性，说明与酵母细胞膜融合的是菌株B的。在以丙酮酸为唯一碳源的选择培养基上筛选到能够增殖的融合菌株，其中酵母菌为大肠杆菌提供，大肠杆菌为酵母菌提供，表明二者建立了互利共生关系。在筛选融合菌株时，不能用葡萄糖为碳源，原因是：。例2.（2025·广西·高考真题）CAR-T是指通过基因工程技术表达CAR基因的T细胞。CAR-T能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T过程见图，回答下列问题：(1)构建含CAR基因的重组质粒，选用的限制酶组合是。(2)将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原因是。(3)将获得的重组质粒导入T细胞并成功表达后，为了研究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，除了有CAR-T与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有（至少写出2点）。(4)研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合以及。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T难以接触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中①是，②是，③是，④是。1．研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。所用农杆菌的Ti质粒的结构如图所示，其中Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移，回答下列问题:(1)利用PCR可以快速扩增抗冻蛋白基因afp，PCR反应需要提供DNA模板、引物、脱氧核苷酸和，需要在一定的缓冲液中进行，缓冲液中Mg²⁺的作用是。(2)构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶和酶。根据图中农杆菌的Ti质粒的结构，为提高农杆菌的转化效率，构建重组质粒应选择的限制酶是。(3)采用农杆菌转化法能将afp基因导入番茄细胞利用了农杆菌的特点是。(4)为检测抗冻的番茄培育是否成功，首先进行分子水平的检测，所采用的生物技术有和。2．研究人员将海岛棉中抗草铵膦除草剂基因Bar导入陆地棉中，经培养筛选获得抗草铵膦除草剂的棉花。据图回答下列问题：(1)为了便于质粒和Bar基因连接构建基因表达载体，在利用PCR技术扩增Bar基因时需要设计特定的引物，结合图1分析，左边引物要包括哪些碱基序列（注明引物的方向）。耐高温的DNA聚合酶从引物的端开始连接脱氧核苷酸。与单酶切相比，双酶切构建基因表达载体的优点是（答出1点）。(2)图1质粒中TetR基因的作用是；利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，一般选择陆地棉的细胞作为受体细胞，最终得到的转基因棉花不具有抗四环素的特性，原因是。(3)为了鉴定转基因棉培育是否成功，可提取转基因棉花的基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳对提取到的DNA样品进行检测，在凝胶中DNA分子的迁移速率除与DNA分子的大小有关外，还与有关（答出2点）；还可以从个体水平进行鉴定，方法是。3．土壤中的污染物RDX具有高毒性和不易降解的特点。研究人员拟将细菌的RDX降解酶基因XplA与XplB整合为融合基因，导入柳枝稷草使其根细胞分泌RDX降解酶，以修复污染土壤。图1、2为降解酶基因XplA、XplB及农杆菌转化流程示意图。回答下列问题：(1)获取XplA与XplB基因。随着测序技术的发展，可通过检索获取XplA与XplB的相关序列，然后用法制备得到。(2)通过融合PCR获得XplB-XplA融合基因。为使两基因能正确融合并表达，引物和的端需包含部分互补序列。同时部分引物还应包含相应的限制酶识别序列。PCR循环步骤中，步骤的温度需根据引物的碱基组成（GC含量）调整，引物长度一定时，GC含量增加（合理范围内），该步骤温度应，其目的是。(3)图2中，将融合基因插入Ti质粒T-DNA区后，可通过PCR验证重组质粒是否构建成功，该过程中常采用技术鉴定PCR产物，再将重组质粒与经处理的农杆菌混合以实现转化。在添加潮霉素的LB培养基中（填“能”或“不能”）直接筛选出导入融合基因的农杆菌。(4)获得融合基因转化成功的目的农杆菌后，对其进行。再用农杆菌侵染经消毒的柳枝稷草外植体，其Ti质粒上的T-DNA可将融合基因整合到柳枝稷草细胞的。若经组织培养获得了转基因柳枝稷草，但其根细胞仍不能合成RDX降解酶，从基因表达调控角度分析，可能的原因是（结合载体具体元件分析）。考向02基因工程在农业领域的应用为高频应用考向，结合农业生产实际场景出题。核心考查抗虫、抗病、抗逆（抗盐碱、抗干旱）转基因作物的培育原理，如抗虫棉中Bt毒蛋白基因的表达机制、抗除草剂作物的作用靶点；还会涉及转基因作物的优势分析（如减少农药使用）及育种流程的优化，需将基因工程技术与作物育种需求结合。1、应用方向定位技巧：聚焦农业核心需求，明确三大高频应用方向——抗逆（抗虫、抗病、抗除草剂、耐盐碱）、改良品质（提高营养含量、改善口感）、提高产量（促进生长、抗倒伏）。解题时先锁定题干需求，对应匹配基因工程技术路径，如抗虫需求优先关联Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因。2、核心操作适配技巧：结合农业应用场景细化操作流程——目的基因选择需针对性（抗虫选Bt基因，抗除草剂选EPSPS基因）；载体常用农杆菌Ti质粒（植物转化首选）；导入方法优先农杆菌转化法（双子叶植物）或基因枪法（单子叶植物）；检测鉴定需兼顾分子水平（抗原-抗体杂交验证表达）和田间实验（抗虫性、产量对比）。3、优势与问题分析逻辑：答题需体现“技术优势→实际价值”“潜在风险→应对措施”。优势如减少农药使用（抗虫作物）、拓宽种植范围（耐盐碱作物）；风险如基因污染、害虫抗药性，应对措施可提“合理布局非转基因作物”“多基因叠加导入”。4、规范答题模板：按“需求→基因选择→操作流程→应用效果”表述，例：“为培育抗虫棉花，选择Bt毒蛋白基因作为目的基因，与Ti质粒构建表达载体，通过农杆菌转化法导入棉花细胞，经筛选鉴定获得转基因植株，其可表达抗虫蛋白，减少农药使用，提高产量”。例1.（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题：(1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及检测，筛选获得重组菌株W1。(2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有（答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是。(3)研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为。(4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：。1．水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器（如图1），为环境污染治理提供新方法。请回答下列问题：(1)基因工程中启动子与增强子都与基因转录有关，增强子可增强转录效率。启动子是，其位于基因的上游，紧挨。(2)分析上图可知，当环境中存在水杨酸时，可激活Ps，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。(3)研究人员欲通过改造重组质粒，实现在相同浓度的水杨酸条件下荧光强度增强为原来的2倍，从而提高传感器的灵敏度。方法一是选择激活能力更强的调控蛋白基因nahRl替代nahR：方法二是在mrfp基因前插入。(4)水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基因与mrfp基因连接成融合基因，则工程菌可同时实现对水杨酸的。现欲通过PCR判定融合基因已准确连接，应选择图2中的引物组合是。(5)工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdB两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdA、ccdB分别插入图3中的、（填字母）位点。2．赖氨酸是人体必需氨基酸之一，但玉米种子中赖氨酸含量较低，影响其营养价值。科学家发现，玉米中赖氨酸的合成受关键酶（天冬氨酸激酶，AK）的反馈抑制：当赖氨酸积累时，AK活性被抑制。通过基因工程改造AK基因，可解除这种抑制，从而提高赖氨酸含量。下图为科学家拟用农杆菌转化法将改造后的AK基因导入玉米细胞的示意图，回答下列问题：(1)天然玉米中，赖氨酸对AK的抑制作用属于调节，这种调节的意义是。(2)为便于筛选，应选择的农杆菌作为受体细胞。在构建基因表达载体时需将AK基因插入Ti质粒的T-DNA区域，目的是。(3)已知AK基因的a链为模板链，则在PCR扩增AK基因时应在图示的3’端添加的酶切位点，便于AK基因的正确连接和表达。启动子应选择玉米种子特异性启动子，目的是。为验证AK基因是否成功表达，可采用的检测方法是。(4)与传统诱变和杂交育种相比，基因工程培育高赖氨酸玉米的优势是。3．C4植物玉米细胞内存在GOLDEN2（G2）基因和GOLDEN2-LIKE（GLK）基因，它们通过激活位于叶绿体内编码光合作用相关蛋白的基因来调控光合作用。为研究这两种基因在光合作用中的作用，科学家利用构建的过表达G2基因水稻ZmG2、过表达GLK基因水稻ZmGLK1和野生型水稻WT（无GLK和G2基因）作为研究对象，探究了它们在田间生长时相关因素的变化情况，结果如图1所示。请回答下列问题：(1)在叶绿体基质中分布有DNA、RNA以及（结构），因此叶绿体可以进行DNA的复制和基因的表达。从细胞核基因控制的角度分析，叶绿体是（填“完全”或“不完全”）自主性细胞器。(2)结合图甲和图乙所示结果，转基因水稻相较于野生型水稻产量（填“增加”或“减少），原因是G2基因和GLK基因。(3)当植物光合结构吸收的光能超过光合作用所能利用的量时，过剩的光能会引起光能转化效率的下降，这种现象即光抑制。为探究光抑制对ZmGLK1和ZmC2的影响，科学家测定了高光照处理后光系统Ⅱ（PSⅡ）的最大光化学效率（Fv/Fm,即植物的最大光能转化效率）和热耗散（NPQ,即光能以热能形式散失）变化，如图2ⅰ和图ⅱ。根据实验结果可知，转基因水稻ZmGLK1和ZmG2的光抑制强度（填“高于”或“低于”）野生型水稻，结合图示分析出现该现象的机制是。考向03基因工程在医药与医学领域的应用侧重技术的医用价值，考查基因工程药物（如胰岛素、干扰素）的生产流程，即目的基因在工程菌中的高效表达条件；同时涵盖基因治疗的两种策略（体内基因治疗、体外基因治疗），以及针对遗传病、肿瘤等疾病的治疗原理，需区分基因工程药物生产与基因治疗的本质差异。1、应用方向定位技巧：聚焦医学核心需求，明确三大高频方向——药物生产（重组蛋白类药物）、基因治疗（遗传病/肿瘤）、诊断技术（分子探针）。解题时先锁定题干场景，如“生产胰岛素”对应重组药物，“治疗镰状细胞贫血”对应基因治疗，精准匹配技术路径。2、核心技术适配技巧：按应用场景细化操作——药物生产需选择高效表达载体（如大肠杆菌、酵母菌），目的基因多为功能蛋白基因（胰岛素、干扰素基因）；基因治疗分体外（提取细胞修饰后回输）和体内（直接导入治疗基因）途径，常用病毒载体（如逆转录病毒、腺病毒）；诊断技术依赖DNA分子杂交、PCR扩增等技术，实现病原体或基因突变检测。3、关键逻辑分析技巧：答题需体现“技术原理→临床价值”“风险防控”。如重组药物生产逻辑：目的基因克隆→构建表达载体→导入工程菌→表达纯化→药物制剂；基因治疗需强调“靶向性”和“安全性”，避免载体引发免疫反应。4、规范答题模板：按“需求→技术路径→核心操作→应用效果”表述，例：“为生产重组人胰岛素，先克隆人胰岛素基因，与大肠杆菌表达载体构建重组质粒，导入工程菌后诱导表达，经纯化获得药物，可精准调节血糖，治疗糖尿病”。例1.（2025·四川·高考真题）杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5-3方向。②密码子对应的氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。(1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是。(2)采用EcoRI和BamHI完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是。(3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带（填氨基酸名称）的tRNA进入结合位点，导致，最终引起细菌死亡。(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有（答出1点即可）。例2.（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。(1)可从中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入和限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。(2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有的污染。初步判断实验组（从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是。(3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有。a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3'b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3'c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3'd：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3'(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。1．人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的胰岛素原，切除部分肽段（C肽段）后形成成熟的胰岛素，如图1所示。科学家据此提出了利用基因工程改造的大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用人体某细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。(1)AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列的原因是。(2)图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时需要添加限制酶的识别序列。根据图中限制酶识别及切割位点等信息，设计出适合目的基因上游引物,该引物的第1、9、15位的碱基分别是。(3)为获得更多的目的基因，需利用PCR技术进行扩增，引物与DNA结合发生在阶段，PCR第四次循环需要消耗对引物。(4)质粒中复制原点应使用大肠杆菌的复制原点的原因是(5)采用法将重组质粒导入大肠杆菌。2．科学家设想将HIV的壳体蛋白（CA）基因与Ti质粒连接构建重组载体转染到枸杞细胞内，利用愈伤组织作为反应器生产HIV的壳体蛋白作为疫苗，以研究CA疫苗对人体的免疫应答。建立愈伤组织反应器的主要过程如下图所示。回答下列问题∶(1)①过程为，进行①过程操作的目的是。为获得大量图中的DNA片段（目的基因），科学家需要根据设计引物。若有a条起始的RNA片段，经过图中的①过程，再进行PCR循环30次，理论上PCR过程需要引物（用算式表示）个。(2)选用Ti质粒作为HIV壳体蛋白（CA）基因的载体，优点是∶。(3)切割CA-DNA和Ti质粒所用的限制性内切核酸酶是，不选用其他两种限制酶的原因是。(4)为了筛选出含重组载体的农杆菌，在选择培养基上添加氨苄青霉素，一段时间后，培养基上形成的菌落（填“一定”或“不一定”）含有重组载体，原因是。是否成功培育出转基因植株需从与个体水平上对转基因植株进行检测与鉴定。3．人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的胰岛素原，切除部分肽段（C肽段）后形成成熟的胰岛素，如图1所示。科学家据此提出了利用基因工程改造的大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用人体某细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。(1)AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列的原因是。BCA法是从人体胰岛B细胞中获取mRNA，再由mRNA（填过程）得到胰岛素基因。(2)图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶（选填编号）的识别序列。①MunI

②XhoI

③EcoRI

④SalI

⑤NheI(3)实践操作中，通过添加保护碱基序列GGG可以延长限制酶识别序列一端的碱基数，从而提高限制酶识别及切割的效率。根据上述信息，设计出适合作为目的基因上游引物的序列5′—-3'（写出18个碱基）(4)采用法将重组质粒导入大肠杆菌。β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质，筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，应在培养基中加入，应选择培养基上（填“蓝色”或“白色”）的菌落。考向04蛋白质工程的应用蛋白质工程作为基因工程的延伸，其高考应用类题型围绕“原理-改造-应用-争议”的核心逻辑展开考查，聚焦逆向工程本质与实践场景的结合。题型核心先立足基础原理，重点检测“从预期蛋白质功能出发，设计蛋白质结构、推测氨基酸序列，进而改造基因序列”的逆向逻辑，同时需区分其与基因工程“生产天然蛋白质”的差异，拆解分子设计、基因改造、表达鉴定等关键流程。高频考向集中在医药领域，涉及人源化抗体改造以降低免疫原性、酶类药物（如长效胰岛素）的活性优化、疫苗抗原修饰以增强免疫效果等“定制化”应用，凸显临床价值。工农领域则侧重功能蛋白的定向改良，农业中通过改造抗逆蛋白、贮藏蛋白提升作物抗逆性与营养品质，工业上优化纤维素酶、蛋白酶的热稳定性和催化效率以适配生产需求。此外，试题还会考查技术瓶颈与伦理争议，如蛋白质空间结构预测难度、表达折叠障碍，以及医用蛋白的免疫风险、生态影响等，全面检测学生的知识应用与辩证思维能力。1、应用方向定位技巧：紧扣“功能优化”核心需求，明确三大高频方向——改造现有蛋白质（如提高酶的热稳定性、改变抗体亲和力）、合成新型蛋白质（如设计抗菌肽、肿瘤靶向蛋白）、修正异常蛋白（如治疗遗传病的功能蛋白）。解题时先锁定题干功能需求，如“耐高温蛋白酶”对应改造酶的结构，精准匹配技术路径。2、核心改造流程技巧：牢记“从基因入手”的本质，流程为“预期蛋白质功能→设计预期氨基酸序列→推测对应基因序列→改造/合成基因→表达验证蛋白质”。关键在于“基因修饰”，需通过碱基对替换、插入或缺失改变氨基酸序列，进而优化蛋白质结构与功能，避免混淆“蛋白质直接改造”（不可行）与“基因层面改造”（核心路径）。3、场景适配分析逻辑：结合具体应用场景梳理逻辑链——工业领域（改造酶结构提升催化效率、降低成本）、医药领域（设计靶向蛋白药物、优化抗体治疗效果）、农业领域（改良植物蛋白营养、增强抗逆蛋白功能）。答题需体现“结构决定功能”，如“替换酶的关键氨基酸残基→改变空间结构→提升热稳定性”。4、规范答题模板：按“功能需求→基因改造→蛋白质优化→应用效果”表述，例：“为获得耐高温淀粉酶，先明确其热稳定功能需求，设计对应的氨基酸序列并推测基因序列，通过定点突变改造淀粉酶基因，导入工程菌表达后验证，最终获得高温下仍具高效催化活性的酶，适用于工业高温发酵场景”。例1.（2025·贵州·高考真题）番茄细胞中线粒体形态与其自身功能密切相关，并影响番茄果实的成熟过程。研究者将决定蛋白质在细胞内定位的特定肽链“嫁接”到绿色荧光蛋白（GFP）上，控制GFP在番茄细胞内的分布，从而在显微镜下观察线粒体的形态变化。回答下列问题：(1)根据蛋白质工程原理，一般不会直接拼接肽链，而是将两段肽链对应的拼接在一起完成“嫁接”，细胞色素c氧化酶Ⅳ（COXⅣ）参与有氧呼吸生成水的过程。COXⅣ的一段肽链序列X决定了COXⅣ在细胞内的分布，研究者选择将X与GFP拼接，理由是。(2)拼接好的序列应插入下图中农杆菌T-DNA的（填下图字母）处。理由是。(3)选择番茄幼嫩子叶进行离体培养，这些培养的器官、组织或细胞被称为。农杆菌侵染后有一定几率将目的基因整合到番茄细胞的中，番茄组织培养过程中，芽诱导期需在培养基中添加的植物激素是。例2.（2025·重庆·高考真题）绝大多数哺乳动物生来怕辣，而小型哺乳动物树鼩先天不怕辣，喜食含辣椒素类物质的植物。为探究其原因，我国研究人员进行了系列研究。(1)研究发现，树鼩的受体蛋白TR1对辣椒素的敏感性低于其他哺乳动物。为研究树鼩和其他哺乳动物TR1蛋白的差异，可设计开展如下实验：①；②将分别进行酶切并连接；③将重组DNA分子导入大肠杆菌；④分离表达的TR1蛋白质测定，明确蛋白之间的差异。(2)树鼩及一些哺乳动物的TR1蛋白存在差异，如图所示。据分析，树鼩对辣椒素的敏感性降低，很可能是由于TR1第579位氨基酸差异造成的，可证实该推测的实验思路是。(3)树鼩与其喜食植物的地理分布基本一致，据此可推测树鼩对含辣椒素类物质植物的适应形成的必要条件是。1．抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，与传统抗生素相比具有无药残、不易产生耐药性等特点，是抗生素理想的替代品，具有广谱抗细菌活性，在医学和饲料企业中具有重要应用价值。研究人员根据抗菌肽A和抗菌肽D的部分氨基酸序列，人工设计并合成了抗菌肽AD基因，然后利用酵母菌发酵生产抗菌肽AD。请回答下列问题。注:K为赖氨酸，A为丙氨酸，M为甲硫氨酸（5’-AUG-3’），起始密码子为5’-AUG-3’，终止密码子为5’-UAA-3’。Leu⁺为控制亮氨酸合成的基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，O为复制原点。注：Leu+为控制亮氨酸合成的基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，氨苄青霉素通过干扰细菌细胞壁的合成发挥作用；O为复制原点。(1)由抗菌肽AD的氨基酸序列可推得多种不同序列的AD基因，原因是。(2)研究人员在人工合成AD基因后，为了使AD基因与pC穿梭质粒正确连接，设计了引物P1（由12个脱氧核苷酸组成的正向引物，结合在AD基因的上游）和P2（由18个脱氧核苷酸组成的反向引物，结合在AD基因的下游），通过PCR扩增AD基因，然后与pC穿梭质粒连接形成重组质粒。据图推测引物P1的碱基序列为5'--3'。在P2引物中，除了构建相应限制酶的识别序列外，还构建了2个终止密码子的编码序列，以保证翻译过程的顺利进行，推测引物P2的碱基序列为5'--3'(3)将构建的重组质粒导入酵母菌后，需要用选择培养基筛选并培养受体菌。从培养基的成分分析，与普通培养基相比，该选择培养基应。(4)通过上述筛选仍不能确定导入受体菌的是pC穿梭质粒还是含AD基因的重组质粒，可采用方法（填一种方法）做进一步鉴定。(5)为提高抗菌肽活性，研究人员拟对其氨基酸序列进行一定的修饰和改造，该项技术需要通过工程来实现，直接操作的对象是。2．科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器（下图），水杨酸是常见的水体污染物。请回答：(1)获得纯净的大肠杆菌的关键是防止，对该工程菌进行扩大培养时所用的液体培养基中是否（填“是”或“否”）需要添加琼脂成分。若需分离得到大肠杆菌单菌落，可采用（答2种方法）。(2)分析上图可知，当环境中存在水杨酸时，水杨酸-调控蛋白复合物可激活启动子，最终使菌体发出红色荧光，根据可判定环境中的水杨酸浓度。(3)水杨酸羟化酶可催化水杨酸分解。工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdB两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdB基因应插入下图中的位点。(4)在分子水平上可以采用技术检测nahR蛋白。科研人员利用细胞工程技术制备了抗nahR蛋白的单克隆抗体，制备过程中给小鼠注射nahR蛋白的目的是，诱导细胞融合时所用到的灭活病毒失去了感染能力，但其结构并未被破坏。用抗nahR蛋白的单克隆抗体检测nahR蛋白的优点是。(5)结果显示转智能工程菌的灵敏性并未达到预期，为提升nahR蛋白的生物活性，科研人员欲通过蛋白质工程对其进行改造。以下是相关步骤，诸按正确顺序排列：。①通过X射线衍射技术分析原始nahR蛋白的空间结构②推导出提高生物学活性功能所需的关键氨基酸替换位点③采用定点突变技术修改nahR基因的脱氧核苷酸序列④将改造后的nahR基因导入受体细胞并检测其生物学活性3．抗菌肽是生物体为了抵抗外来细菌而迅速诱导产生的一系列具有抗菌或杀菌活性的多肽类物质，在医学上具有重要应用价值。研究人员根据天然抗菌肽A和抗菌肽D的部分氨基酸序列，以及酵母菌对密码子的偏好，人工设计并合成了抗菌肽AD基因，然后利用酵母菌发酵生产活性更高的抗菌肽AD，请回答下列问题：注:K为赖氨酸，A为丙氨酸，M为甲硫氨酸（5’-AUG-3’），起始密码子为5’-AUG-3’，终止密码子为5’-UAA-3’。Leu⁺为控制亮氨酸合成的基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，O为复制原点。(1)由抗菌肽AD的氨基酸序列可推出多种不同序列的AD基因，原因是。图中丙氨酸A的反密码子为5’--3’。(2)研究人员在人工合成AD基因后，为了使AD基因与pC穿梭质粒正确连接，设计了引物P1（由12个脱氧核苷酸组成的正向引物，结合在AD基因的上游）和P2（由18个脱氧核苷酸组成的反向引物，结合在AD基因的下游），通过PCR扩增AD基因，然后与pC穿梭质粒连接形成重组质粒。据图推测引物P1的碱基序列为5’--3’。在引物P2中，除了构建相应限制酶的识别序列外，还构建了2个终止密码子的编码序列，以保证翻译过程的顺利进行，推测引物P2的碱基序列为：5’--3’(3)将AD基因重组质粒导入酵母菌后，需用选择培养基筛选并培养受体菌。从培养基的成分分析，该选择培养基与普通培养基的不同之处是。(4)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是。1．（2025·浙江宁波·一模）玉米作为重要的粮食和饲料作物，在转基因育种中提高其转化效率不仅能降低成本，还能加速新品种的培育进程，更好地满足农业生产的需求。已有研究发现，提高WUS、BBM、GRF、GF等发育调节因子的表达量可有效提高单子叶植物的转化效率。回答下列问题：(1)GRF蛋白是一类调控植物生长发育的关键转录因子，GIF蛋白是其辅助因子。通常将GRF基因与GIF基因组成融合基因，制备过程如图1。为使扩增出的GRF和GIF基因片段在混合后通过引物部分延伸融合，引物和引物的碱基序列必须有（填“相同”或“互补”）片段。(2)科研人员欲利用上述四种发育调节因子的基因加速玉米的遗传改良，构建了图2所示的三种载体。其中DsRed和NPTⅡ作为用于筛选转化成功的受体细胞，每个插入单位均需含有。(3)将三种载体分别导入玉米胚中。将构建的重组Ti质粒导入经过处理的农杆菌后，稀释得到一定浓度的农杆菌液。双子叶植物伤口处的细胞会分泌酚类化合物吸引农杆菌，但农杆菌一般难以感染单子叶植物。为了提高转化成功率，将玉米萌发种子的胚芽尖端割伤，在伤口处施加，然后放入中浸泡。(4)将各组玉米胚插入诱导愈伤组织的培养基中，该过程需在操作完成，以减少空气中微生物的污染。培养一段时间后，将愈伤组织转接到生长素用量与细胞分裂素用量比值的培养基上，诱导愈伤组织生芽。不同阶段的实验数据如下表所示，由表可知，发育调节因子能大幅度提高转基因玉米的。组别载体胚（个）愈伤组织（个）存活率（%）带芽的愈伤组织（个）再生率（%）转化效率（%）1对照载体1215646.28814.296.612WUS+BBM985556.122138.1821.433GRF-GIF964647.922554.3526.042．（2025·山东聊城·三模）CRISPR/Cas12a系统是由crRNA和Cas12a（Cpf1）蛋白形成的复合体。crRNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，引导Cas12a蛋白到相应位置剪切DNA。下图是CRISPR/Cas12a系统的工作原理示意图。请回答下列问题。注：PAM是一种短DNA序列，N表示任意碱基。PAM可以帮助Cas12a识别和切割目标DNA序列。“”表示在相应位置剪切DNA。(1)在CRISPR/Cas12a系统中，crRNA序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域最多含种核苷酸。Cas12a是一种内切核酸酶，能催化水解，从而使DNA在PAM序列的上游被切断，切割DNA后形成的是（填“黏性”或“平”）末端。(2)某科研团队基于CRISPR/Cas12a系统对宫颈癌细胞中的KIFC1基因进行敲除，来探讨KIFC1基因对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。他们利用crRNA对应基因序列和PX458质粒（如下图）构建crRNA/Cas12a重组载体，转染至HeLa细胞进行相关研究。①为保证crRNA对应的基因序列与PX458质粒正确连接，应在扩增该基因序列的一对引物的5’端分别添加两种限制酶的识别序列。其中P1的碱基序列为5’3’（写出前9个碱基）。PX458质粒中利用U6、CMV两个启动子，而不共用同一个启动子的目的是。②将CrRNA/Cas12a重组载体成功转染至HeL.a细胞。与对照组相比，实验组中KIFCl蛋白表达量、细胞数目的变化如下图所示，由此得出结论是。判断依据是：。3．（2025·山东淄博·三模）荧光素酶互补实验可用于研究两种蛋白质的相互作用。荧光素酶蛋白被切成N端（NLuc）和C端（CLuc）两个功能片段，将待检测的两个蛋白分别与NLuc和CLuc融合，当两个蛋白有相互作用时，NLuc和CLuc在空间上才能靠近并正确组装，发挥荧光素酶活性，分解荧光素底物并产生荧光。科研人员利用该技术探究植物中的ERF114蛋白能否与MYB8蛋白相互作用，过程如下图。(1)Gibson无缝克隆技术要求载体插入位点的两端与目的基因的两末端有至少15bp的相同序列，这些相同序列通过设计引物、经PCR获得。图1中为保证基因正向连接在质粒上，PCR的引物中应有种相同的15bp序列，这些序列应构建在相应引物的（填“5′端”“3′端”）。(2)以构建重组载体ERF114-Nluc为例，将PCR获得的ERF114、NLuc及线性化质粒混合并加入三种酶，50℃条件下共同孵育1h可完成连接，原理见图2。图中过程③和过程④分别加入的酶是、。与传统克隆技术相比，Gibson无缝克隆技术的优点是（答出1点即可）。(3)将构建正确的ERF114-Nluc、MYB8-CLuc、NLuc、CLuc、T-NLuc及p53-CLuc等6种重组载体分别导入农杆菌，将不同农杆菌组合注射到烟草叶片中，24h后将荧光素底物喷洒到叶片上，结果如图3。若ERF114能与MYB8相互作用，则（填图中数字）区域会发出荧光。该实验还需要增加的一组对照，该对照中的混合重组载体是。4．（2025·江苏南京·二模）中国“干扰素之父”侯云德院士于1982年成功研发我国第一个基因工程创新药物——干扰素。干扰素是一种白细胞产生的具有抗病毒能力的分泌蛋白。研究人员从感染病毒的鸡白细胞提取全基因组mRNA，利用PCR技术获取鸡干扰素基因，图1表示鸡干扰素蛋白有关的基因片段，序号①~④表示引物。然后将获取的目的基因连接在大肠杆菌的pET32a质粒（5900bp，注：bp表示碱基对）上，图2表示pET32a质粒及其上部分限制酶切割位点。最后将重组质粒导入大肠杆菌后获得成熟干扰素。(1)利用鸡白细胞总mRNA获得干扰素蛋白基因，需要在酶的作用下先合cDNA。选择cDNA而不是提取DNA后进行PCR获取干扰素蛋白基因的原因是。图1表示成熟干扰素蛋白序列及其前端的信号肽序列，信号肽是分泌蛋白合成过程中开始合成的一段肽链，其在干扰素合成中的作用是。(2)为了获取不含信号肽序列的干扰素基因，在进行PCR扩增时需要用到的一对引物是，为了将目的基因准确连接到pET32a质粒上需要在目的基因的两端添加限制酶的序列。PCR扩增过程除了引物，还需要的条件有（答出2点）。(3)为了检测目的基因是否插入pET32a质粒，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图3，样品最可能是插入了目的基因的重组质粒，判断的理由是。(4)将重组pET32a质粒导入大肠杆菌的方法为，检测大肠杆菌是否能成功表达干扰素蛋白的方法为。天然的干扰素在体外保存相当困难，为了生产出耐储存干扰素，科学家可通过蛋白质工程对干扰素进行改造，具体流程是：从预期的蛋白质功能出发→→→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因→使用工程菌获得耐储存的干扰素。5．（2025·江西九江·三模）黄瓜花叶病毒是寄主范围最多的植物病毒之一，对多种重要经济作物的生存造成威胁。研究发现，由该病毒C基因表达出的C蛋白是病毒合成和释放的关键成分，将C基因敲除后，单株烟草病毒侵染性大大降低。为提高烟草等经济作物产量，科研人员利用PCR技术大量扩增出C基因，并将C基因导入Ti质粒中，通过农杆菌转化法获得能表达C基因反义RNA（能与病毒C基因转录形成的mRNA结合形成双链）的转基因抗病毒烟草。回答以下问题。注：图1中a~e表示不同的引物；图2为Ti质粒，T-DNA的左、右边界见图，其中EcoRI和XhoI是两种限制酶且切割后形成的黏性末端不互补。(1)一般来说，设计的引物序列越短，其特异性越（填“强”或“弱”）。据图可知扩增完整的C基因，应选择图1中的引物。若任意使用图1中涉及的所有引物，通过PCR技术可扩增出种等长的DNA片段。(2)该实验利用反义RNA介导基因沉默，主要抑制病毒C基因表达中的过程。结合图2，为确保C基因按照实验要求的方式正确连接在Ti质粒上，应在左侧引物的5’端设计添加酶切位点。(3)重组质粒构建完成后需进行琼脂糖凝胶电泳实验验证，为保证电泳结果的准确性，对该环状质粒电泳时需分为无酶切组和单酶切组，结果发现无酶切组的电泳速率慢于酶切组，由此可知电泳时DNA分子的迁移速率与其有关。(4)为进一步验证转基因抗病毒烟草的抗病毒效果，还需进行个体水平检测，请简述实验思路。6．（2025·河南·三模）抗菌肽是生物体免疫系统自身分泌的一种可以有效抵御外来病原体侵害的肽类化学物质。抗菌肽TLN-58是存在于人皮肤病变小泡中的多肽，抗菌肽hLYZ是人体免疫防御机制的组成部分。科研人员将基因TLN-58和基因hLYZ进行融合（图1），构建重组载体（图2），从而获得具有更高抗菌活性的杂合抗菌肽TLN-58-hLYZ。回答下列问题：(1)为使基因TLN-58和基因hLYZ融合，需要先设计引物，通过PCR技术在引物R2的（填“3′端”或“5′端”）添加一段核苷酸序列，从而使两个基因能够融合成一个基因。利用PCR技术扩增目的基因时，需要加入作为合成DNA子链的原料，该过程需要的酶是。(2)要使融合基因按图示方向插入到质粒中，应在引物（填“F1”“F2”“R1”或“R2”）的5′端添加限制酶EcoRⅠ的识别序列。构建基因表达载体时，一般采用双酶切法，而不用单酶切法，优点是（答出2点）。(3)为验证杂合抗菌肽TLN-58-hLYZ对金黄色葡萄球菌具有较高的抗菌活性（高于单一抗菌肽），科研人员做了如下实验，请完善实验步骤。①将适宜浓度的金黄色葡萄球菌菌液均匀涂布到平板上；②用经灭菌的镊子分别将浸过等量且适量无菌水（A组）、抗菌肽TLN-58（B组）、抗菌肽hLYZ（C组）、（D组）的圆形滤纸片沥干后置于上述平板上；③将培养基置于适宜条件下培养一段时间；④测量并比较。预期结果及结论：。7．（2025·北京海淀·二模）发酵工程离不开微生物培养，为监测、调控和利用细菌的葡萄糖代谢途径，优化目标产物的生产过程，研究者尝试通过基因工程技术构建生物传感器。将GFP（绿色荧光蛋白）基因作为报告基因，构建出基因表达载体（R），将其导入大肠杆菌时。(1)发酵工程一般包括菌种的选育、、培养基的配制、灭菌、接种、发酵产品的分离、提纯等方面。其中是发酵工程的中心环节。(2)PE基因编码的PE酶催化E蛋白磷酸化，磷酸化的E蛋白可转运葡萄糖进入大肠杆菌细胞，转运葡萄糖后E蛋白去磷酸化。M蛋白是一种转录抑制因子。R作为生物传感器，包括启动子（P）、GFP基因和PE基因等元件，工作过程如图1、图2。①据图1、图2可知，存在葡萄糖时，葡萄糖通过E蛋白转运进入细胞中后被磷酸化，M蛋白，PE表达的产物可使E蛋白重新磷酸化。②在周围环境中葡萄糖存在状态不同时，R均可监测大肠杆菌的葡萄糖摄取状态，请阐释其工作原理。③在含有葡萄糖的培养基中培养转入R的大肠杆菌，分别在不同培养时间检测和荧光强度。若结果显示二者呈正相关，则可确定该生物传感器具有检测可靠性。(3)在工业发酵生产色氨酸过程中，研究者利用R监测大肠杆菌对葡萄糖的摄取，发现菌体摄入的葡萄糖偏多，因为代谢过程中形成了一些副产品，导致生产成本偏高。已知大肠杆菌C基因编码的蛋白C可结合启动子Pc，促进RNA聚合酶也结合Pc；当胞内葡萄糖含量较高时，C蛋白无法结合Pc，Pc无法启动下游基因转录。研究者将R的启动子P更换为启动子Pc，解决葡萄糖摄取偏多导致浪费的问题。请在表格中补充不同条件下，2个调控元件对R的精准调控过程。“+”表示相应蛋白结合、“-”表示相应蛋白脱离。条件Pc中c蛋白的结合序列M蛋白的结合序列无葡萄糖++低浓度葡萄糖①②高浓度葡萄糖③④8．（2025·辽宁沈阳·三模）大豆脂肪氧化酶（LOX）在食品加工等方面有重要作用。下图表示建立LOX基因原核表达体系生产LOX的过程。其中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，T7启动子可被IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）激活。回答下列问题。(1)①RT-PCR（逆转录PCR）获得LOX基因（cDNA）的过程需要的催化。为了便于基因表达载体的构建，引物F1和R1分别为。A．5′-GGTACCGTAGTGTTGGTGGGTTGG-3′B．5′-CTCGAGAAAGCCAAACATGAAAGC-3′C．5′-GGTACCAAAGCCAAACATGAAAGC-3′D．5′-CTCGAGGTAGTGTTGGTGGGTTGG-3′(2)图中代表基因工程核心步骤的是（填序号）。③过程需用处理大肠杆菌，以利于重组质粒的转化。仅利用含氨苄青霉素的培养基无法区分含有的大肠杆菌，因此还需利用PCR等技术在水平上对大肠杆菌进行检测与筛选。筛选后的大肠杆菌用于生产时，除营养物质外，培养基中还需添加。(3)已知天然的LOX具有使β-胡萝卜素漂白褪色的特性。简要叙述利用以上过程生产的LOX进行活性鉴定的实验设计思路：。9．（2025·四川乐山·三模）我国科学家将抗虫基因A、抗冻基因B导入番茄，获得了抗虫、耐寒的转基因番茄。所选用的抗虫基因A、抗冻基因B及质粒的限制酶切割位点如图所示。(1)将抗虫基因A和质粒连接的过程需要用到的酶有（填图中限制酶）和DNA连接酶。将抗虫基因A与质粒连接后，再将抗冻基因B连接到重组质粒上所用的限制酶是。(2)构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。我国科学家采用了他们独创的一种方法，将目的基因导入番茄细胞。除此之外，将目的基因导入植物细胞常用的方法还有农杆菌转化法。(3)农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到，并且将其整合到上。(4)抗虫基因A导入番茄细胞后，若要检测抗虫基因A是否插入番茄染色体中，需要从番茄细胞中提取进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是。(5)若要通过实验检测抗虫基因A在番茄细胞中是否表达为抗虫蛋白，请简要写出实验思路。10．（2025·湖南常德·三模）淀粉经淀粉酶催化水解后的产物是重要的工业原料，但工业化生产常需要在高温条件下进行，而现有的淀粉酶耐热性不强。科研人员发现将淀粉酶（AmyS1）第27位的亮氨酸替换为天冬氨酸后，能产生耐热性高的淀粉酶（AmyS2）。科研人员利用蛋白质工程设计并人工合成了AmyS2基因，将其导入芽孢杆菌，过程如图1所示。最终结果表明，与导入质粒B相比，导入质粒C的芽孢杆菌的培养液中更易获得并提纯AmyS2.回答下列问题：(1)科研人员利用蛋白质工程对淀粉酶（AmyS2）进行了如下改造：预期AmyS2的功能→设计AmyS2的结构→设计AmyS2的→人工合成AmyS2基因的序列→将获得的AmyS2基因导入芽孢杆菌生产AmyS2.(2)根据图2分析，利用PCR技术扩增AmyS2基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的。若将该基因扩增过程中至少经过次循环，可获得32个符合要求的目的基因。(3)将AmyS2基因与原始质粒A构建成质粒B，应选择的限制酶是；将质粒B与信号肽基因构建成质粒C，应选择的限制酶是。在工业生产中，使用导入质粒C的工程菌生产α-淀粉酶时，更容易从培养液中获取并提纯目标蛋白质，据此推测，信号肽的功能可能是。(4)芽孢杆菌细胞内的bp基因会表达出一种胞外蛋白酶，导致胞外α淀粉酶被降解。科研人员利用基因编辑技术敲除芽孢杆菌的bp基因，构建能高效表达α淀粉酶的工程菌。利用PCR技术可以检测bp基因是否被成功敲除，请简述实验设计思路：。11．（2025·重庆·一模）土壤盐碱化问题已成为全球性难题，培育耐盐碱作物是解决人类粮食安全和农业发展的重要途径。(1)为研究高粱盐碱响应通路中相关基因AT1的作用，研究人员构建了过表达植株（AT1-OE）。以高粱的cDNA为模板，利用方法获取目的基因。如图1，最好选择限制酶处理目的基因和质粒，构建重组质粒并转入农杆菌。(2)将转化成功的农杆菌与高粱愈伤组织共培养，为筛选出T-DNA成功转入的愈伤组织，培养基中需加入。获得所需愈伤组织后，经再分化发育成完整植株。(3)同时构建基因敲除植株（AT1-KO）。检测植株在高碱土壤中的幼苗长势和作物产量，结果发现：相比野生型植株，AT1-KO植株，AT1-OE植株表型相反，说明AT1在高粱碱胁迫的响应过程中起负调控作用。(4