2026年植病研究技术题库及答案

2026年植病研究技术题库及答案一、单项选择题（本大题共30小题，每小题1分，共30分。在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的）

1.在植物病原真菌的分离培养中，最常用的通用培养基是（）。

A.牛肉膏蛋白胨培养基

B.马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）

C.玉米粉琼脂培养基（CMA）

D.赫奇逊培养基

2.革兰氏染色法中，经乙醇脱色后仍呈阳性反应（紫色）的细菌，其细胞壁结构特点是（）。

A.肽聚糖层薄，脂类含量高

B.肽聚糖层厚，脂类含量低

C.无肽聚糖层

D.具有外膜层

3.下列哪种技术主要用于植物病毒粒体的形态观察与鉴定？（）

A.酶联免疫吸附测定（ELISA）

B.逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）

C.免疫电镜技术（ISEM）

D.双向扩散法

4.在植物病原细菌的柯赫氏法则验证中，最常用的接种方法通常是（）。

A.花器接种

B.叶液接种（喷雾或针刺）

C.根部接种

D.维管束注射

5.实时荧光定量PCR中，用于反映扩增过程中荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数指标是（）。

A.Tm值（熔解温度）

B.Ct值（循环阈值）

C.OD值（光密度值）

D.Rf值（比移值）

6.植物病理学研究中，用于测定植物抗病性时，常用的对照品种是（）。

A.感病品种和抗病品种

B.仅感病品种

C.仅抗病品种

D.中间型品种

7.下列哪种染色剂常用于真菌菌丝细胞核的染色？（）

A.棉酚蓝

B.苯胺蓝

C.苏黑精或姬姆萨

D.孔雀石绿

8.在血清学反应中，抗原抗体反应具有高度特异性，这主要取决于抗原分子的（）。

A.分子量大小

B.表面决定簇

C.物理状态

D.化学分类

9.进行植物病原菌核分离时，通常采取的处理措施是（）。

A.直接挑取

B.表面消毒后挑取

C.研碎稀释平板法

D.组织培养法

10.下列哪种技术是利用植物病原菌产生的毒素来筛选抗病种质资源的？（）

A.组织学

B.生物化学

C.毒素生物测定

D.分子生物学

11.在PCR反应体系中，TaqDNA聚合酶发挥作用的必需辅因子是（）。

A.Mg²⁺

B.Ca²⁺

C.K⁺

D.Na⁺

12.植物病毒学研究中，用于指示病毒存在及侵染范围的最初级指示植物称为（）。

A.枯斑寄主

B.系统侵染寄主

C.带毒寄主

D.介体昆虫

13.下列哪种培养基常用于培养植物病原细菌？（）

A.PDA

B.NA（营养肉汤琼脂）

C.WA（水琼脂）

D.SDA（沙保氏琼脂）

14.利用双生病毒的滚动复制环状DNA（RCR）特性进行检测的现代分子技术是（）。

A.RFLP

B.RAPD

C.RollingCircleAmplification(RCA)

D.SouthernBlot

15.在植物病害流行学调查中，表示病害严重程度最直观的指标是（）。

A.普遍率

B.严重度

C.病情指数

D.反应型

16.植物病原真菌的分类鉴定中，有性世代产生的孢子类型是（）。

A.分生孢子

B.游动孢子

C.子囊孢子或担孢子

D.孢子囊孢子

17.下列哪种电泳技术常用于植物病毒RNA基因组的大小分析？（）

A.SDS

B.琼脂糖凝胶电泳

C.等电聚焦电泳

D.双向电泳

18.在植物病原细菌的鉴定中，氧化酶试验主要用于区分（）。

A.革兰氏阳性与阴性菌

B.假单胞菌属与黄单胞菌属

C.欧文氏菌属与土壤杆菌属

D.棒形杆菌属与芽孢杆菌属

19.用于检测植物体内植物激素（如乙烯、水杨酸）变化，以研究抗病机制的技术是（）。

A.气相色谱-质谱联用（GC-MS）

B.核酸杂交

C.WesternBlot

D.凝胶电泳

20.植物病理学研究中，利用同位素标记示踪物质代谢途径的技术属于（）。

A.免疫学技术

B.电子显微镜技术

C.同位素示踪技术

D.细胞化学技术

21.下列哪种分子标记技术是基于PCR技术，且不需要预先知道基因组DNA序列信息？（）

A.SSR

B.AFLP

C.RAPD

D.SNP

22.在植物真菌病害的生物防治研究中，测定拮抗菌抑菌作用最常用的方法是（）

A.平板对峙培养法

B.纸片扩散法

C.试管稀释法

D.盆栽试验法

23.观察植物维管束病害组织病变，最常用的制片技术是（）。

A.整体透明法

B.徒手切片法

C.石蜡切片法

D.冷冻切片法

24.酶联免疫吸附测定（ELISA）中，间接法与双抗体夹心法的主要区别在于（）。

A.底物不同

B.包被抗原或抗体的不同

C.温育温度不同

D.显色时间不同

25.植物病毒经汁液摩擦接种时，常加入的摩擦剂是（）。

A.琼脂

B.碳化硅或金刚砂

C.氯化钙

D.乙醇

26.下列哪种技术可用于检测植物病原真菌的遗传多样性和群体结构？（）

A.Bio-PCR

B.ISSR

C.NorthernBlot

D.DAS-ELISA

27.在植物病害田间试验设计时，为了减少土壤肥力差异造成的误差，常采用（）。

A.随机区组设计

B.裂区设计

C.正交设计

D.完全随机设计

28.用于检测植物病原细菌产生的胞外酶（如果胶酶）活性的培养基是（）。

A.鉴别培养基

B.选择培养基

C.加有特定底物的培养基

D.基础培养基

29.下列哪种显微镜技术具有最高的分辨率，可用于观察病毒的超微结构？（）

A.普通光学显微镜

B.相差显微镜

C.扫描电子显微镜（SEM）

D.透射电子显微镜（TEM）

30.在分子植物病理学中，利用基因沉默技术研究基因功能的技术是（）。

A.SouthernBlot

B.VIGS（病毒诱导的基因沉默）

C.RACE

D.InsituHybridization

二、多项选择题（本大题共15小题，每小题2分，共30分。在每小题给出的四个选项中，有两项或两项以上是符合题目要求的。多选、少选、错选均不得分）

31.植物病原真菌分离培养时，常用的抑菌剂有（）。

A.链霉素

B.氯霉素

C.孟加拉红

D.青霉素

32.下列属于植物病毒接种方法的有（）。

A.汁液摩擦接种

B.嫁接接种

C.介体昆虫接种

D.薰蒸接种

33.PCR技术的基本反应步骤包括（）。

A.变性

B.退火

C.延伸

D.电泳

34.植物病原细菌致病性测定中，常用的接种方式包括（）。

A.喷雾法

B.注射法

C.剪叶法

D.浸根法

35.酶联免疫吸附测定（ELISA）的主要优点包括（）。

A.灵敏度高

B.特异性强

C.适合大量样品检测

D.可以检测活菌活性

36.下列哪些指标常用于评价植物诱导抗病性的效果？（）

A.病斑数量的减少

B.病斑面积的缩小

C.防御相关酶（如PAL、POD）活性的升高

D.植物生物量的增加

37.植物病害标本制作与保存的基本要求包括（）。

A.保持病原物的形态特征

B.保持病害症状的典型性

C.标本干燥且防虫防霉

D.必须保持鲜活状态

38.用于植物病原真菌分子检测的靶基因区域通常包括（）。

A.ITSrDNA

B.β-tubulin

C.EF-1α

D.16SrDNA

39.下列哪些技术属于生物芯片技术的范畴？（）

A.DNA微阵列

B.蛋白质芯片

C.PCR芯片

D.ELISA板

40.植物病理学研究中，常用的核酸提取方法需要去除的杂质包括（）。

A.蛋白质

B.多糖

C.酚类物质

D.无机盐

41.下列关于柯赫氏法则的描述，正确的有（）。

A.必须在所有病株上分离得到相同的病原物

B.必须将分离得到的病原物进行纯培养

C.接种纯培养物必须诱发相同症状

D.必须从接种发病的植株上再次分离得到相同的病原物

42.植物病原菌生理小种鉴定常用的方法包括（）。

A.在鉴别寄主上测定反应型

B.分子标记辅助鉴定

C.血清学反应

D.形态观察

43.观察植物病原真菌形态时，常用的临时玻片制作浮载剂有（）。

A.水

B.乳酚油

C.甘油

D.乙醇

44.植物病害生物防治机制主要包括（）。

A.拮抗作用

B.竞争作用

C.重寄生

D.捕食作用

45.利用转录组测序技术研究植物-病原物互作，可以分析（）。

A.植物防御反应相关基因的表达谱

B.病原物毒性基因的表达谱

C.基因的可变剪接情况

D.蛋白质的修饰情况

三、填空题（本大题共20空，每空1分，共20分）

46.植物病原真菌菌丝生长的最适温度范围通常在____℃之间。

47.革兰氏染色反应的关键步骤是____处理，时间过长会导致假阴性。

48.在植物病毒检测中，利用单克隆抗体进行的ELISA法称为____ELISA。

49.PCR反应中，引物的延伸温度通常设定为____℃。

50.植物病原细菌的鞭毛染色主要用于观察细菌的____和____。

51.测定杀菌剂毒力的生物测定方法主要有____法和____法。

52.SouthernBlotting技术主要用来检测____，而NorthernBlotting主要用来检测____。

53.植物组织培养中，脱毒苗的检测常采用____法和____法相结合。

54.在植物病害流行的时间动态分析中，常用的模型有____模型和____模型。

55.植物病原真菌的无性繁殖体通常产生于____或____中。

56.真菌核糖体DNA中，进化速率最快、常用于种下分类鉴定的区域是____。

57.用于检测植物病原细菌致萎能力的快速方法是____测定。

58.在分子系统发育分析中，构建进化树常用的软件有MEGA、PAUP和____。

四、名词解释（本大题共10小题，每小题3分，共30分）

59.柯赫氏法则

60.选择培养基

61.血清学反应

62.PCR（聚合酶链式反应）

63.系统侵染

64.潜育期

65.单克隆抗体

66.基因芯片

67.转录组

68.毒素

五、简答题（本大题共6小题，每小题10分，共60分）

69.简述植物病原真菌常规分离的主要步骤及注意事项。

70.比较间接ELISA和双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）的原理及优缺点。

71.简述实时荧光定量PCR（Real-timeqPCR）的基本原理及其在植物病理学研究中的应用。

72.在植物病害标本采集与制作过程中，应遵循哪些原则以保证标本的科研价值？

73.简述植物病原细菌致病性测定的基本流程。

74.简述利用RAPD技术进行植物病原真菌遗传多样性分析的基本操作流程。

六、论述题（本大题共3小题，每小题40分，共120分）

75.某地发现一种新的玉米叶部病害，疑似由真菌或细菌引起。作为植物病理学研究人员，请详细设计一套完整的试验方案（从田间症状观察到病原物的最终鉴定），以明确该病害的病原物种类，并制定相应的防控建议。

76.试述现代分子生物学技术（如PCR、核酸杂交、测序技术等）在植物病原物检测与鉴定中的主要应用，并结合实例说明其相对于传统植物病理学方法的优势与局限性。

77.植物诱导系统抗性（ISR）和系统获得抗性（SAR）是植物抗病性的重要表现形式。请论述这两种抗性的主要区别，并设计试验方案证明一种生防菌诱导了植物的系统抗性。

参考答案及解析

一、单项选择题

1.【答案】B

【解析】PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）营养丰富，原料易得，适合大多数植物病原真菌的生长。NA适合细菌，CMA适合某些特定真菌（如疫霉菌），赫奇逊培养基用于自养细菌。

2.【答案】B

【解析】革兰氏阳性菌细胞壁具有较厚的肽聚糖层（约20-80nm），且脂类含量极低，乙醇脱色后肽聚糖层脱水收缩，阻止结晶紫-碘复合物外逸，故呈紫色。

3.【答案】C

【解析】免疫电镜技术（ISEM）结合了电镜的高分辨率和免疫反应的特异性，既能观察形态又能进行血清学鉴定。ELISA和PCR主要用于生化或分子检测，不直接观察形态。

4.【答案】B

【解析】植物病原细菌通常通过伤口或自然孔口侵入，叶液接种（喷雾或针刺）模拟了自然接种过程，是验证柯赫氏法则中最常用的方法。

5.【答案】B

【解析】Ct值是指PCR反应中荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，Ct值越低，说明模板起始浓度越高。Tm值是熔解温度，OD值是光密度。

6.【答案】A

【解析】在抗病性测定中，必须同时设置已知的感病品种和抗病品种作为对照，以验证接种是否成功及试验条件的可靠性。

7.【答案】C

【解析】苏黑精或姬姆萨染液能使细胞核着色清晰，便于观察真菌细胞核的数量及分布。棉酚蓝和苯胺蓝常用于染细胞壁或菌丝。

8.【答案】B

【解析】抗原抗体反应的特异性取决于抗原分子表面的抗原决定簇，抗体特异性识别并结合这些决定簇。

9.【答案】B

【解析】菌菌核通常来源于土壤或病残体表面，带有杂菌，分离时必须进行严格的表面消毒（如0.1%升汞或次氯酸钠处理）后再挑取或培养。

10.【答案】C

【解析】毒素生物测定利用病原菌产生的毒素处理植物组织，根据组织反应（如坏死、褪色）来筛选对毒素不敏感的抗病材料。

11.【答案】A

【解析】Mg²⁺是TaqDNA聚合酶的辅因子，对酶的活性至关重要，也是引物与模板结合所需的离子环境。

12.【答案】A

【解析】枯斑寄主受病毒侵染后仅出现局部坏死斑，不表现系统症状，常用于病毒的定量检测和分离纯化。

13.【答案】B

【解析】NA（营养肉汤琼脂）是培养细菌最常用的基础培养基。PDA主要用于真菌。

14.【答案】C

【解析】RCA（滚环扩增）技术利用环状DNA滚环复制的原理，在恒温条件下对环状DNA（如双生病毒基因组）进行高效扩增。

15.【答案】B

【解析】严重度是指发病器官（如叶片、果实）上病斑面积占总面积的百分比，是病害轻重程度的直观指标。普遍率是指发病植株或器官比例。

16.【答案】C

【解析】有性世代是真菌分类的高级依据，子囊菌产生子囊孢子，担子菌产生担孢子。分生孢子是无性世代孢子。

17.【答案】B

【解析】琼脂糖凝胶电泳常用于核酸（DNA/RNA）的分离和分子量测定。SDS用于蛋白质。

18.【答案】B

【解析】氧化酶试验常用于假单胞菌属（通常阳性）与肠杆菌科细菌（通常阴性）的区分，也是区分假单胞菌与黄单胞菌的依据之一。

19.【答案】A

【解析】GC-MS具有高灵敏度和高分辨率，常用于植物体内痕量激素、挥发性代谢物（如植保素）的定性与定量分析。

20.【答案】C

【解析】同位素示踪技术利用放射性同位素标记的化合物，追踪物质在植物体内的代谢途径和转化。

21.【答案】C

【解析】RAPD（随机扩增多态性DNA）使用随机引物，无需预先知道基因组序列。SSR、SNP需要已知序列信息设计引物，AFLP虽部分未知但需酶切接头连接，操作较复杂。

22.【答案】A

【解析】平板对峙培养法是将拮抗菌与病原菌在平板上对峙划线或点植，通过观察抑菌带大小来评价拮抗作用。

23.【答案】C

【解析】石蜡切片法能制作连续切片，且切片较薄，适合观察维管束等内部组织的解剖结构和病原物分布。

24.【答案】B

【解析】间接法包被抗原，双抗体夹心法包被抗体。这是两者在操作流程上的根本区别。

25.【答案】B

【解析】碳化硅或金刚砂作为摩擦剂，能轻微破坏叶片表皮细胞，便于病毒进入。

26.【答案】B

【解析】ISSR（简单序列重复区间扩增多态性）是一种常用于遗传多样性分析的分子标记技术。Bio-PCR是检测技术，NorthernBlot是核酸杂交。

27.【答案】A

【解析】随机区组设计将局部环境差异（如肥力梯度）控制在区组内，能有效降低试验误差，是田间试验最常用的设计。

28.【答案】C

【解析】测定胞外酶活性时，需在培养基中加入该酶的特异性底物，通过观察底物分解后的透明圈或显色反应来判断酶活性。

29.【答案】D

【解析】透射电子显微镜（TEM）分辨率最高（可达0.1nm），可用于观察病毒粒体、细菌超微结构等。SEM主要用于表面形态观察。

30.【答案】B

【解析】VIGS（病毒诱导的基因沉默）是利用改造的病毒载体携带植物基因片段，诱导植物内源基因发生沉默，从而研究基因功能。

二、多项选择题

31.【答案】ABC

【解析】链霉素、氯霉素常用于抑制细菌生长；孟加拉红（虎红）常用于抑制细菌和放线菌生长，利于真菌分离。青霉素虽然也抗细菌，但在真菌分离中不如链霉素常用，且易热分解。通常选ABC。

32.【答案】ABC

【解析】汁液摩擦、嫁接、介体昆虫是植物病毒最主要的接种方式。薰蒸不是接种方式。

33.【答案】ABC

【解析】PCR包括变性（94-95℃）、退火（50-65℃）、延伸（72℃）三个基本步骤循环。电泳是后续检测步骤。

34.【答案】ABCD

【解析】喷雾（模拟气孔或表面侵染）、注射（模拟维管束或深部组织）、剪叶（模拟伤口）、浸根（模拟根部侵染）均为常用细菌接种方式。

35.【答案】ABC

【解析】ELISA灵敏度高、特异性强、可高通量检测。它检测的是抗原抗体反应，不能检测活菌活性。

36.【答案】ABC

【解析】评价诱导抗性主要看病害表现减轻（A、B）以及生理生化指标的变化（C）。生物量增加可能由多种因素引起，非直接指标。

37.【答案】ABC

【解析】标本需保持典型性、形态特征，并干燥保存。鲜活标本难以长期保存，一般制作成干标本或浸渍标本。

38.【答案】ABC

【解析】ITS、β-tubulin、EF-1α是真菌分子鉴定的常用条形码基因。16SrDNA主要用于细菌。

39.【答案】AB

【解析】DNA微阵列和蛋白质芯片属于生物芯片。PCR芯片是微流控技术，ELISA板是酶标板，不属于芯片范畴。

40.【答案】ABC

【解析】蛋白质、多糖、酚类是植物组织提取核酸时的主要干扰杂质，必须去除。无机盐通常不是主要去除对象。

41.【答案】BCD

【解析】柯赫氏法则包括：分离致病菌（B）、纯培养（B）、接种发病（C）、再分离（D）。A项“所有病株”过于绝对，实际操作中是从典型病株分离。

42.【答案】AB

【解析】生理小种鉴定主要依靠在鉴别寄主上的致病型反应（A）或分子标记（B）。血清学和形态观察通常用于种或属的鉴定。

43.【答案】ABC

【解析】水、乳酚油、甘油均可作为浮载剂。乳酚油具有杀菌和透明作用，效果最好。

44.【答案】ABC

【解析】生物防治机制主要包括抗生菌产生的拮抗物质（A）、营养和空间竞争（B）、重寄生（如木霉）（C）。捕食作用在线虫生防中常见，真菌细菌中少见。

45.【答案】ABC

【解析】转录组测序主要分析基因表达谱（A、B）和可变剪接（C）。蛋白质修饰主要靠蛋白质组学分析。

三、填空题

46.【答案】20-30（或24-28）

47.【答案】乙醇脱色

48.【答案】单克隆（或抗原捕获）

49.【答案】72

50.【答案】数目，着生位置（或鞭毛位置）

51.【答案】孢子萌发，抑菌圈（生长速率）

52.【答案】DNA，RNA

53.【答案】指示植物，ELISA（或分子生物学/RT-PCR）

54.【答案】逻辑斯蒂，单分子（或指数）

55.【答案】分生孢子盘，分生孢子器（或分生孢子梗）

56.【答案】ITS（InternalTranscribedSpacer）

57.【答案】致病性（或过敏反应）

58.【答案】PHYLIP

四、名词解释

59.【答案】柯赫氏法则：是确定某种微生物是植物病害病原物的经典原则。内容包括：①在所有病株上都能分离到同一种微生物；②该微生物必须在人工培养基上分离并纯培养；③将纯培养物接种到健康植物上，必须诱发与原来相同的症状；④必须从接种发病的植物上再次分离得到同一种微生物。

60.【答案】选择培养基：在培养基中加入某种化学物质或抗生素，使其仅利于特定类型的微生物（如病原菌）生长，而抑制其他杂菌生长的培养基。

61.【答案】血清学反应：指抗原与抗体在体外发生的特异性结合反应。利用已知抗体检测未知抗原（或反之），具有高度特异性，常用于病原物的鉴定和检测。

62.【答案】PCR：即聚合酶链式反应，是一种体外模拟DNA天然复制过程的核酸扩增技术。通过高温变性、低温退火、中温延伸的循环，将微量的DNA在短时间内扩增数百万倍。

63.【答案】系统侵染：病原物从侵染点进入植物体后，通过维管束或细胞间连丝扩展到植物全株或远离侵染点的部位，引起全株发病的现象。

64.【答案】潜育期：从病原物侵入植物到寄主出现明显症状所需的时间。潜育期的长短受病原物种类、寄主抗性及环境条件影响。

65.【答案】单克隆抗体：由B细胞杂交瘤产生的、针对单一抗原决定簇的均一抗体。具有特异性强、均一性好、可大量制备的特点。

66.【答案】基因芯片：将大量特定的寡核苷酸片段或cDNA片段有序地固定在固相载体（硅片、玻片等）上，通过与标记的样品核酸杂交，检测基因表达谱或进行基因突变分析的技术。

67.【答案】转录组：指特定组织或细胞在特定发育阶段或生理条件下，转录出来的所有RNA的总和（包括mRNA和非编码RNA）。转录组测序用于研究基因表达情况。

68.【答案】毒素：指病原物产生的，在很低浓度下就能干扰寄主生理机能，导致植物组织损伤或死亡的非酶类次生代谢产物。

五、简答题

69.【答案】

步骤：

①标本选择与预处理：选取新鲜、典型病斑，切取病健交界处组织（约5mm×5mm），流水冲洗。

②表面消毒：用70%乙醇浸泡数秒，再用0.1%升汞或次氯酸钠溶液消毒1-3分钟（视组织耐受度而定）。

③冲洗：用无菌水冲洗3-5次，去除残留消毒液。

④分离与培养：在无菌条件下，将组织块移至PDA平板上，每皿放3-5块，置于适宜温度（如25℃）黑暗培养。

⑤纯化：待菌落长出后，挑取菌落边缘菌丝转接至新试管斜面，纯化培养。

注意事项：

①分离材料必须新鲜，避免腐生菌污染。

②表面消毒时间要严格控制，过短杀菌不彻底，过长杀伤病原菌。

③操作全程需严格无菌。

④对于易产孢的真菌，可采用单孢分离法纯化。

70.【答案】

原理：

①间接ELISA：将抗原包被在固相载体上，加入待测血清（一抗），洗涤后加入酶标二抗（抗抗体），加底物显色。

②双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）：将特异性抗体（捕获抗体）包被，加入待测抗原，洗涤后加入酶标特异性抗体（检测抗体），加底物显色。

优缺点：

①间接ELISA：优点是只需一种酶标二抗即可检测多种抗原，通用性强，标记方便；缺点是非特异性吸附稍高，主要用于检测抗体。

②DAS-ELISA：优点是特异性更高（双抗体识别），适合检测大分子抗原；缺点是每种抗原需要特定的配对抗体，制备复杂，主要用于检测抗原。

71.【答案】

原理：在PCR反应体系中加入荧光基团（如SYBRGreen或TaqMan探针）。随着PCR循环的进行，荧光信号强度与PCR产物量成正比。通过实时监测荧光信号的变化，利用Ct值与起始模板浓度的对数线性关系，对模板进行定量分析。

应用：

①病原物检测与定量：测定植物体内病原菌的载量，分析侵染动态。

②抗病性评价：比较不同品种接种后病原菌的增殖量。

③基因表达分析：检测植物防御相关基因的表达水平。

④杀菌剂药效测定：分析药剂对病原菌核酸合成的影响。

72.【答案】

原则：

①典型性：选取具有典型症状的病部标本，最好包含不同发病阶段的样本。

②完整性：标本应尽量包含寄主的根、茎、叶、果等部位，以便全面反映病害特征。

③整洁性：采集时去除泥土和杂物，标本保持平整。

④记录详实：详细记录采集时间、地点、寄主名称、环境条件及采集人。

⑤及时处理：标本采集后应迅速压制干燥或浸渍保存，防止霉变、腐烂或标本变形。

⑥安全性：对于检疫性病害，需严格遵守生物安全规定，防止病原扩散。

73.【答案】

流程：

①病原菌制备：将分离纯化的细菌在适宜培养基上培养，制备成一定浓度的细菌悬浮液（通常用无菌水或缓冲液）。

②接种材料准备：选用健康、生长一致的寄主植物幼苗或叶片。

③接种：采用喷雾、针刺、注射或剪叶等方法接种细菌悬浮液，设无菌水（或缓冲液）对照。

④保湿：接种后将植物置于人工气候箱或保湿罩中，保持高湿度和适宜温度24-48小时，以利于侵染。

⑤发病观察：接种后定期观察记录症状出现的时间、类型及分布情况。

⑥再分离（柯赫氏法则验证）：从接种发病的组织上再次分离细菌，并与原接种菌株进行比较（如菌落形态、生理生化或分子鉴定），确认为同一种细菌。

74.【答案】

流程：

①DNA提取：提取不同供试真菌菌株的基因组DNA。

②PCR扩增：利用随机引物（通常为10bp寡核苷酸）对基因组DNA进行PCR扩增。

③电泳检测：将扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳分离，EB染色后在紫外灯下观察拍照。

④数据统计：根据条带的有无（1/0）构建二进制矩阵。

⑤聚类分析：利用统计软件（如NTSYS）计算遗传相似系数，采用UPGMA等方法构建聚类树状图。

⑥结果分析：根据聚类图分析菌株间的遗传距离和亲缘关系，划分遗传群。

六、论述题

75.【答案】

试验方案：

1.田间症状观察与记录：

详细观察病害在田间的分布、发病部位、病斑形状、颜色、有无霉层、脓胶等特征，初步排除非侵染性病害（如药害、肥害）。拍照记录。

2.病原物的分离与培养：

①真菌分离：取病健交界处组织，经表面消毒后移植于PDA培养基，25℃培养。观察菌落形态、颜色、生长速度。

②细菌分离：取病部组织，研磨稀释后，划线接种于NA培养基，28℃培养。观察菌落形态（圆形、凸起、颜色、是否产生荧光等）。

3.形态学鉴定：

①若为真菌：挑取菌丝或孢子制作玻片，显微镜下观察产孢结构、孢子形态、颜色及大小，依据真菌分类手册初步鉴定到属或种。

②若为细菌：进行革兰氏染色，观察菌体形态、鞭毛（鞭毛染色），测量菌体大小。

4.致病性测定（柯赫氏法则）：

①制备接种体：真菌制备孢子悬浮液，细菌制备菌悬液。

②接种：采用喷雾、针刺或注射法接种健康的玉米植株。

③观察：保湿培养，观察是否产生与田间相同的症状。

④再分离：从发病组织再次分离病原物，并与原分离物比较。

5.生理生化与分子鉴定（确诊）：

①若为细菌：进行氧化酶、接触酶、糖发酵等生理生化测定；提取DNA，利用16SrDNA通用引物进行PCR扩增、测序，通过Blast比对确定种属。

②若为真菌：提取DNA，利用ITS区引物扩增测序，结合形态学特征确定种属。

6.防控建议：

根据鉴定结果（如确定为由弯孢霉引起的叶斑病或由细菌引起的茎腐病），提出综合防控建议：

①农业防治：选用抗病品种，轮作倒茬，清除病残体，合理密植，增施有机肥。

②化学防治：针对病原类型选择合适的杀菌剂（如真菌用三唑类，细菌用铜制剂或抗生素），并建议交替用药。

③生物防治：推荐使用拮抗微生物制剂。

76.【答案】

主要应用：

1.PCR技术：用于快速检测微量病原物。例如，利用特异性引物检测番茄细菌性叶斑病菌，灵敏度高，几小时内即可出结果。

2.实时荧光定量PCR：用于病原物的定量检测