核酸适配体课件

APTAMER核酸适配体

核酸适配体，这一概念或许对部分人来说有些陌生，但它在生物医学等众多领域有着不可估量的价值。它是人工合成的核酸，能与靶标分子特异性结合，就像一把精准的钥匙，能打开特定的锁。其应用前景十分广阔，无论是在疾病治疗，还是在生物检测方面，都有着巨大的潜力。

深入了解核酸适配体，不仅能拓宽我们的科学认知，更可能为解决一些棘手的医学问题提供新的思路和方法。所以，让我们一起走进核酸适配体的奇妙世界，去探索其中的奥秘。接下来，我将为大家详细介绍关于核酸适配体的相关内容。

核酸适配体英文表述为“Aptamers”，其词源融合了拉丁语“aptus”（意为契合）和希腊语“meros”（意为部分），这个名称直观体现了它能与靶标分子精准契合的特性。

核酸适配体主要分为核酸适配体（NucleicAcidaptamers）和多肽适配体（Peptideaptamers）。核酸适配体是人工合成的核酸，能形成稳定二级结构，与靶标分子特异性结合，可结合的靶分子范围广泛，包括小分子、蛋白、细菌等。多肽适配体则是以多肽为基础，同样具备与特定靶标结合的能力。

这两种适配体在生物医学、分析检测等多个领域都展现出巨大的应用潜力。它们就像是精准的“分子钥匙”，能够打开特定靶标分子的“锁”，为解决各种复杂的生物学和医学问题提供了有力工具。随着研究的深入，核酸适配体和多肽适配体有望在更多领域发挥重要作用，为人类健康和科学研究带来新的突破。

核酸适配体是一种具有独特性质和重要应用价值的核酸。它是人工合成的核酸，具备稳定的二级结构，能与靶标分子特异性结合。其类型既可以是RNA，也可以是DNA，长度通常在25到60个核苷酸之间。

核酸适配体是一系列单链核酸分子，它与长度相同的特异靶分子相结合，这种结合的特异性如同抗体一样，对可结合的配体有着严格的识别能力，并且具备高度的亲和力。这就好比一把精准的钥匙，能够准确无误地打开与之匹配的锁。

核酸适配体的结合范围十分广泛，其可以结合的靶分子涵盖了小分子、蛋白、细菌、病毒、细胞和组织等。这使得核酸适配体在众多领域都有着巨大的应用潜力，比如在医学诊断、疾病治疗、生物检测等方面，都可能发挥出关键作用。

核酸适配体概念的提出与RNA催化作用的研究密切相关。1989年，悉尼·奥尔特曼和托马斯·切赫凭借对RNA催化作用的研究，共同荣获诺贝尔化学奖。这一奖项不仅是对他们科研成果的高度认可，更在核酸适配体的发展历程中具有里程碑意义。RNA催化作用的发现，为核酸适配体概念的诞生奠定了坚实基础。它让科学家们意识到，RNA不仅仅是遗传信息的传递者，还具有催化功能。这一发现拓展了人们对RNA的认知边界，也为后续核酸适配体的研究提供了新的思路和方向。

从更广泛的角度来看，这一研究成果推动了分子生物学领域的发展。它促使科学家们深入探索RNA的更多功能和应用，为核酸适配体在生物医学、生物技术等领域的应用开辟了道路。可以说，悉尼·奥尔特曼和托马斯·切赫的研究，为核酸适配体的研究和应用搭建了重要的桥梁，让我们对核酸的认识和利用提升到了一个新的高度。RNA为生命起源的假说引人入胜，而有三个关键方面的证据能为这一假说提供支持。

其一，若能找到完全或主要依赖RNA进行生命活动的生物，那将是RNA作为生命起源的直接证据。这意味着在自然界中存在以RNA为核心来维持生存、繁衍和代谢等生命进程的生物，就像找到了一把能打开生命起源奥秘之门的钥匙，有力地证明RNA具备独立承载生命活动的能力。

其二，在现存生物的基因组里寻找负责基本生命活动的功能性RNA“痕迹”。现存生物是生命演化的结果，若能在其基因组中发现这些“痕迹”，就如同在历史的长河中找到了古老文明留下的遗迹，说明RNA在生命演化的早期就参与了基本生命活动，为生命起源于RNA提供了演化层面的证据。

其三，从随机RNA序列库中筛选到能够完成基本生命活动的RNA序列。这表明RNA本身具有完成基本生命活动的潜力，即使是随机的RNA序列，也有可能具备这样的功能，进一步暗示了在生命诞生之初，RNA有很大概率承担起生命活动的重任。这三个方面的证据相互补充，共同为RNA是生命起源的假说增添了可信度。

生命活动的基础是什么？答案是“Binding”，也就是结合。这看似简单的概念，实则为证明“RNA起源说”提供了重要思路。如果能找出具有强亲和性和特异性的RNA序列，就意味着向证明“RNA起源说”迈进了一步。1990年，两个研究组几乎同时开展了相关研究。他们以T4DNApolymerase与几种有机染料为靶标，筛选出了能特异性结合的RNA分子，并将其命名为aptamer，即适配体。这一发现意义重大，它让我们看到了RNA在结合方面的潜力。1992年，Ellington和Szostak延续了这种研究方法，筛选出了可与靶分子特异性结合的单链DNA分子。这不仅证明了单链DNA能够折叠成特殊的三维结构，还暗示了DNA可能具有催化活性。这一成果进一步拓展了我们对核酸功能的认知。

这些研究都记录在相关文献中，如TuerkC和GoldL在1990年发表于《Science》的研究，以及EllingtonAD和SzostakJW在同年发表于《Nature》的研究。它们为后续的研究奠定了坚实的基础，也让我们对生命起源的探索有了新的方向。第7页

我们在探寻核酸适配体的过程中，会关注自然界中是否存在核酸适配体的证据，而核糖开关就是这样的证据。核糖开关被认为是调节基因表达最古老的机制。2002年，耶鲁大学分子生物学家RonaldBreaher及其同事，受Andrew等人研究成果的启发，发现并命名了核糖开关。这一发现为核酸适配体的研究提供了新的方向。

核糖开关本质上是一种RNA结构元件，它能够与代谢物或其他小分子配体结合。当它与配体结合后，会发生构象变化，进而调控目的基因的转录或翻译。这种调控方式十分巧妙，就像一把精准的钥匙，能够开启或关闭基因表达的大门。

核糖开关的发现，不仅证实了自然界中核酸适配体的存在，也让我们对基因表达的调控机制有了更深入的认识。这对于理解生命的奥秘、开发新的治疗方法等都具有重要意义。第8页

核酸适配体具有巨大的应用前景。在医药治疗领域，相关研究《APTAMERS:ANEMERGINGCLASSOFTHERAPEUTICS》（发表于Annu.Rev.Med.2005.56:555–83）表明，它正成为一类新兴的治疗手段。核酸适配体能够与靶分子特异性结合，这一特性使其在疾病治疗方面具有独特优势，比如可以精准地作用于病变细胞或分子，有望为多种疾病的治疗带来新的突破。

在分析应用方面，AndrewD.Ellington在《AnalyticalApplicationsofAptamers》（发表于AnnualReviewofAnalyticalChemistry2008.Volume1,Jul2008）中有所阐述。核酸适配体可用于对各种物质的分析检测，凭借其高亲和力和高特异性，能够准确识别和检测目标分子，在生物分析、环境监测等领域都有广阔的应用空间。总之，核酸适配体的这些应用前景，为相关领域的发展带来了新的机遇和可能。第9页2005年12月20日，美国FDA批准了哌加他尼钠注射液（Macugen）用于治疗眼科疾病，这是核酸适配体的第一个临床应用案例。该药物主要针对新生血管型（湿性）老年黄斑病变（AMD），可缓解患者视力缓慢丧失的症状。AMD是一种常见的眼科疾病，会导致患者中心视力下降，严重影响生活质量。而Macugen作为一种选择性血管内皮生产因子（VEGF）拮抗剂，能够通过抑制VEGF的活性，减少视网膜新生血管的形成，从而控制病情发展。

这一批准具有重要意义，它不仅为AMD患者提供了新的治疗选择，也标志着核酸适配体在临床应用上取得了重大突破。它为后续核酸适配体在更多疾病治疗领域的研究和应用奠定了基础，让我们看到了核酸适配体在医学领域的巨大潜力和广阔前景。第10页

核酸适配体的化学本质是核酸，其与配体结合的奥秘在于单链核酸结构和空间构象的多样性。在靶分子出现时，核酸适配体就像一位灵动的舞者，通过链内某些互补碱基间的配对，以及静电作用、氢键作用等，进行适应性折叠。它能形成如发卡、假结、凸环、G2四分体等稳定的三维空间结构。

这些独特的结构让适配体与靶分子之间拥有较大的接触面积，就如同两块拼图完美契合，从而实现与靶物质的紧密结合，展现出高亲和力和高特异性。可以说，核酸适配体就像是一把专门为靶分子打造的钥匙，精准地开启与之对应的锁。

经过SELEX技术反复筛选的适配体，更是将这种亲和力和特异性发挥到极致。核酸适体与靶物质的亲和力极高，其kd值多在pmol/L-nmol/L之间。这意味着核酸适配体在与靶分子结合时，有着极高的精准度和稳定性，为其在生物医学等领域的应用奠定了坚实基础。

现在我们来聚焦一种针对生物素的RNA适配体结构。适配体的表面和主链以黄色呈现，而生物素以球体形式展示，它恰好能紧密地嵌入到RNA表面的一个空腔之中。

这种紧密贴合并非偶然，它揭示了核酸适配体与靶分子之间高亲和力和高特异性结合的奥秘。核酸适配体的化学本质是核酸，它基于单链核酸结构和空间构象的多样性，在靶分子存在时，通过自身的适应性折叠形成稳定的三维空间结构。就像这个RNA适配体与生物素的结合，适配体形成的结构与生物素之间有较大的接触面积，从而实现了紧密结合。

理解这种结构对于深入认识核酸适配体的识别机理至关重要。它有助于我们更好地利用核酸适配体的特性，在分析检测、疾病治疗等领域发挥其巨大的应用潜力。例如在医疗领域，我们可以根据这种结合原理开发更有效的诊断试剂和治疗药物，为人类健康带来更多的福祉。第13页

核酸适配体的体外筛选主要依靠SELEX技术，即指数富集配体系统进化。这一技术的原理基于分子生物学，通过构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库来实现筛选。

文库中的随机序列长度在20到100个碱基左右，这些随机序列为筛选提供了丰富的可能性。将这个文库与靶分子相互作用，只有那些能够与靶分子结合的寡核苷酸配基，也就是适配体，才会被保留下来。

之后，经过反复的扩增和筛选循环，每一次循环都是对适配体的一次优化和富集。随着循环次数的增加，与靶分子特异结合的寡核苷酸序列会越来越多，而那些亲和力低的序列则会逐渐被淘汰。

这种筛选策略的优势在于，它能够高效地从大量的随机序列中找到与靶分子具有高亲和力和特异性的适配体。通过SELEX技术，我们可以为各种靶分子找到合适的适配体，这在生物医学、分析检测等领域都具有重要的应用价值。第14页SELEX筛选流程包含三个关键步骤，每一步都对最终获得合适的核酸适配体序列至关重要。

第一步是确立筛选方法。不同的配体具有不同的特性，适配体也会因配体不同而展现出不同特性。所以，要根据配体的具体情况来确定适配体筛选方法，就像量体裁衣一样，为不同的配体选择最合适的筛选路径，这样才能更精准地筛选出符合要求的适配体。

第二步是建立筛选文库。人工构建一个约含有10¹⁵个不同寡核苷酸的随机序列库，这个库就像是一个巨大的“素材库”。随机序列两端的固定序列是后续PCR循环的关键，若筛选的是RNA-aptamer，还需在5´端引物中加上一段T7启动子，以识别转录所需的T7RNA聚合酶。之后将靶分子加入库中，充分结合后分离出与靶分子结合的寡核苷酸序列，这就像是从“素材库”中初步挑选出可能有用的“素材”。

第三步是扩增与循环筛选。通过PCR或RT-PCR等技术对分离出的序列进行扩增，生成次一级文库。然后让次一级文库再与配体结合，如此反复多次循环。随着每一轮筛选条件不断提高，与靶目标高度特异结合的DNA或RNA分子会呈指数增长，而亲和力低的序列则逐步被淘汰，就像大浪淘沙，最终留下的就是我们所需要的合适序列。第15页

这张筛选流程图清晰展现了核酸适配体筛选的完整过程。前面我们了解到，核酸适配体筛选是利用SELEX技术完成的。该流程起始于确立筛选方法，依据不同配体特性选择适配体，进而确定具体筛选方法，这一步为后续筛选指明了方向。

接下来是建立筛选文库，人工构建约含10¹⁵个不同寡核苷酸的随机序列库，两端设置固定序列用于PCR循环。若筛选RNA-aptamer，还需在5´端引物加T7启动子。将靶分子加入文库，充分结合后分离出结合的寡核苷酸序列。

之后通过PCR或RT-PCR等技术扩增，生成次一级文库，再次与配体结合。经过反复多次循环，每一轮筛选条件不断提高，与靶目标高度特异结合的DNA或RNA分子呈指数增长，亲和力低的序列逐步被淘汰，直至获得合适序列。

整个筛选过程中，高效分离结合与未结合靶分子的序列是关键步骤，像毛细管电泳、超滤离心膜分离法、硝酸纤维素膜分离法、亲和介质分离等方法都发挥着重要作用。这张流程图直观地呈现了核酸适配体筛选的复杂而有序的过程，让我们更清晰地理解其筛选原理和步骤。第16页

在运用SELEX技术筛选核酸适配体时，高效分离结合靶分子的序列与未结合靶分子的序列是关键步骤。目前主要有四种分离方法。

毛细管电泳是基于不同组间荷质比差异导致的电泳迁移率不同来进行分离。在电场中，待分离组分在特定内径的毛细管中，因荷质比差异而有不同迁移速度，从而实现分离。当靶分子与其适配体亲和作用强、复合物稳定时，能分别得到游离寡核苷酸与复合物的电泳峰。

超滤离心膜分离法由滤膜滤芯和套管组成。分离时套管套住滤芯，将待分离液体加在滤芯上，通过高速离心滤掉不与靶标结合的游离寡核苷酸，使与靶标特异性结合的单链DNA留在超滤离心膜上，操作简便。

硝酸纤维素膜分离法虽未详细介绍，但也是重要的分离手段之一。

亲和介质分离则利用具有亲和表面的介质，如琼脂糖、纤维素及亲和小珠或小柱等。像J.ColinCox等人利用链霉亲和素标记的磁珠完成溶菌酶适配体的自动化筛选，通过设定程序自动完成特异结合序列的分离、扩增、转录等操作，大大提高了筛选效率。第17页

毛细管电泳是核酸适配体筛选中一种重要的分离方法，其原理基于不同组间荷质比差异导致的电泳迁移率不同。在电场环境里，待分离组分处于50-75μm内径的毛细管中，由于荷质比的差异，它们会以不同的速度迁移，进而实现分离。

这种分离方式具有独特的优势。当靶分子和其适配体（aptamer）之间的亲和作用足够强，形成的复合物足够稳定时，在合适的分离和检测条件下，就可以分别得到游离的寡核苷酸与复合物的电泳峰。这意味着能够清晰地区分结合了靶分子的适配体和未结合的寡核苷酸，为后续的研究和应用提供了可靠的基础。

从应用角度看，毛细管电泳的高分辨率和准确性，使得它在核酸适配体筛选中发挥着关键作用。它能够高效地分离出与靶分子特异结合的适配体，为进一步研究适配体的结构和功能，以及开发基于适配体的诊断和治疗方法提供了有力支持。第18页

在核酸适配体的筛选工作中，超滤离心膜分离是一项关键技术。超滤离心膜由滤膜滤芯和套管两部分构成。在进行分离离心操作时，套管套住滤芯，将待分离液体置于滤芯上。通过高速离心，不与靶标结合的游离寡核苷酸会被滤掉，而与靶标特异性结合的单链DNA（ssDNA）则会留在超滤离心膜上。

这种分离方法在SELEX技术中具有重要意义。它能够高效地将结合靶分子的序列与未结合的序列分离开来，满足了筛选过程中的分离需求。而且，相较于其他一些复杂的分离方法，超滤离心膜分离的操作十分简便，不需要复杂的仪器设备和繁琐的操作流程，这大大提高了筛选工作的效率。可以说，超滤离心膜分离为核酸适配体的筛选提供了一种实用且高效的手段，推动了相关研究和应用的发展。第19页

在适配体筛选中，具有亲和表面的介质发挥着重要作用，像琼脂糖、纤维素，还有具有亲和表面的小珠或小柱等都可用于适配体筛选。其中，J.ColinCox等人利用链霉亲和素标记的磁珠完成溶菌酶适配体的自动化筛选，为适配体筛选提供了新的思路。

其具体流程是，借助链酶亲和素与生物素的相互作用，把生物素化的靶蛋白固定在磁珠上。之后，特异结合序列的分离、RT-PCR扩增和转录都能通过设定好的程序自动完成。最后，将筛选得到的序列克隆到载体中进行测序鉴定。

这种自动化筛选工作台优势显著，Cox等仅用不到两天时间就完成了12轮筛选。这大大提高了筛选效率，节省了时间和人力成本。它也为适配体筛选的自动化和高效化发展提供了范例，有望在未来推动适配体筛选技术不断进步，为相关领域的研究和应用带来更多可能。第20页

本部分主要介绍核酸适配体的应用，包含两个方面。一是核酸适配体在分析化学中的应用，可实现靶物质的分析与检测等；二是其在疾病诊断和新药研发方面的作用。这两方面展现了核酸适配体广泛的应用价值和发展潜力。第21页

核酸适配体在分析化学领域有着重要应用，主要用于靶物质的分析与检测。其应用的基本思路是把各种报告基团，像荧光试剂，定点标记在aptamer核苷酸上，在特定条件下让aptamer与靶物质相互作用，再通过检测报告基团的信号，实现对靶物质的定性检测或定量分析。Tan等人将aptamer应用于分子信标研究，开发出分子aptamer信标（MAB）这一高效、高灵敏检测生物分子的方法。他们把凝血酶aptamer的5´和3´端分别标记上荧光素和猝灭剂。当凝血酶不存在时，aptamer分子呈茎环结构，两端的荧光素与猝灭剂相互靠近发生能量转移，无法观察到荧光。而当结合凝血酶后，aptamer分子构象改变，使得MAB的荧光素与猝灭剂分开，从而能检测到荧光信号，并且随着凝血酶浓度增加，荧光强度也会增强。

这种方法为生物分子的检测提供了一种新的思路和手段，在分析化学领域具有广阔的应用前景。第22页

在蛋白质检测领域，Lindner等人取得了重要突破，他们开发出基于aptamer芯片的蛋白质检测方法。该方法将能特异识别IgE的ssDNA-aptamer和IgE抗体固定在芯片上，与IgE温育后发现，aptamer对IgE的特异性和敏感性远超IgE抗体，检测限可达10ng/ml。这一成果意义重大，意味着在检测IgE时，aptamer能更精准、灵敏地发挥作用。

不仅如此，Lindner等人还借助aptamer芯片系统，成功从混合蛋白质中识别出专一性的蛋白。并且，他们利用凝血酶aptamer证明了在同一芯片上同时检测两种蛋白方法的可行性。这进一步拓宽了该检测方法的应用范围。

寡核苷酸aptamer作为低分子量的分子受体，在芯片上展现出强大优势。它不仅能专一性地检测蛋白质，而且稳定性良好。以它为阵列来捕获蛋白质，将为蛋白质组学研究带来新的发展机遇，推动该领域的研究迈向新的高度。第23页

基于适配体的生物传感器是一种利用适配体作为识别元件，来特异性检测相应靶物质的先进技术。不过目前，适配体生物传感器尚处于起步阶段，还有很大的发展空间。ChunyanYao等人进行了一项具有开创性的研究，他们把IgE适配体固定在石英晶体微平衡生物传感器阵列上，成功建立了适配体压电石英生物传感器模型。这个模型主要用于特异性检测标准溶液和人血清中的IgE。

该检测方法具有显著优势。它的灵敏度极高，最低能够在标准溶液和人血清中分别检测出2.5-200ug/L的IgE。而且检测速度快，整个检测过程仅需15分钟。更值得一提的是，固定在金膜表面的适配子经过反复洗脱后，其灵敏度依然不受影响，这充分体现了该方法的稳定性和可靠性。

适配体生物传感器的出现，为生物检测领域带来了新的希望和可能。随着技术的不断发展和完善，相信它在未来会发挥出更大的作用，为生物医学研究和临床诊断等领域提供更有力的支持。第24页

在分析化学领域，利用核酸适配体进行靶物质检测是一项极具潜力的技术。这里要介绍一种针对三价砷的独特检测方法。

当存在三价砷离子时，针对三价砷的核酸适配体会优先和砷离子结合。与此同时，带有正电荷的PDDA会发挥作用，它会使带负电荷的金纳米粒子发生聚集现象。

这种聚集可不是普通的变化，它会带来明显的颜色改变，金纳米粒子溶液的颜色会从红色变为蓝色。基于此，我们就可以通过比色法来测定三价砷。

比色法的优势在于直观、便捷，通过颜色变化就能快速判断三价砷是否存在以及大致含量。这种利用核酸适配体和金纳米粒子的特性进行检测的方法，为三价砷的快速、灵敏检测提供了新途径，在环境监测、食品安全等领域有着广阔的应用前景。第25页

在核酸适配体的应用领域，利用其独特的结构特性实现对多种物质的检测是一项重要成果，对铅和汞的同时测定便是其中的典型代表。核酸适配体与铅和汞分别能形成G-quartet结构和发卡结构，这一特性为同时测定这两种物质提供了可能。

这种测定方法具有显著优势。一方面，通过核酸适配体与铅、汞形成特定构型，实现了对这两种物质的精准识别和同时检测，大大提高了检测效率，能在一次检测中获取两种物质的信息。另一方面，相较于传统检测方法，核酸适配体的特异性结合使得检测结果更加准确可靠。

从实际应用角度来看，这种同时测定铅和汞的方法在环境监测、食品安全等领域具有重要意义。在环境监测中，能快速检测环境样本中铅和汞的含量，及时发现潜在的污染问题；在食品安全检测中，可对食品中的铅和汞残留进行有效监测，保障消费者的健康。可以说，利用核酸适配体与铅和汞形成特定结构实现同时测定，为相关领域的检测工作带来了新的有效手段。第26页

在核酸适配体的应用领域，对于钾离子的检测有独特的方法。钾离子具有一种特殊能力，它能够让富含鸟嘌呤的核酸适配体形成特异的G-quadruplex二级构型，并且还能对这个结构起到一定的稳定作用。

这种特性为钾离子的检测提供了新的思路。我们可以利用核酸适配体二级结构信号的变化来实现对钾离子的检测。当钾离子存在时，核酸适配体形成特定的二级构型，其结构和信号会发生相应改变。通过对这些变化的监测和分析，就能确定钾离子的存在与否以及其含量情况。

这种检测方法具有重要意义。在生物领域，钾离子在细胞生理活动中起着关键作用，对细胞的正常功能维持至关重要。通过这种检测方法，我们可以更精准地了解生物体内钾离子的水平，为疾病诊断、药物研发等提供有力支持。在环境监测方面，也能帮助我们快速检测环境中钾离子的含量，评估环境质量。第27页

核酸适配体在检测领域展现出了独特的优势，就拿双酚A的检测来说，其中的原理十分巧妙。在溶液里没有双酚A时，核酸适配体能够吸附在金纳米粒子表面，为其提供一层保护，使其免受金属离子的聚集作用。此时，溶液呈现出原本的红色。

然而，当溶液中存在双酚A时，适配体便会与双酚A特异性结合。这一结合过程使得金纳米粒子失去了核酸适配体的保护，在金属离子的作用下，金纳米粒子开始聚集，溶液的颜色也由红变蓝。这种颜色的变化十分明显，我们可以通过肉眼直接判别，从而实现对双酚A的检测。

这种检测方法具有显著的优势。它操作相对简单，不需要复杂的仪器设备，仅通过观察颜色变化就能得出结果。而且，其检测限可达0.1ng/mL，这意味着它具有较高的灵敏度，能够检测到低浓度的双酚A。这一方法为双酚A的检测提供了一种便捷、高效的途径，在环境监测、食品安全等领域具有广阔的应用前景。第28页

接下来，我们聚焦于基于核酸适配体的可卡因快速检测芯片。核酸适配体是一种具有高亲和力和特异性的单链核酸分子，在生物检测领域展现出巨大潜力。而可卡因作为一种常见的毒品，对社会和个人健康造成极大危害，快速准确检测可卡因意义重大。

这款基于核酸适配体的检测芯片，正是利用核酸适配体与可卡因的特异性结合特性来实现快速检测。其原理图背后蕴含着精妙的设计，适配体与可卡因结合后会引发一系列物理或化学信号变化，通过检测这些变化就能判断可卡因是否存在以及其浓度。

与传统检测方法相比，该芯片具有快速、灵敏、便捷等优势。快速检测意味着能在短时间内得出结果，为打击毒品犯罪等提供及时信息；灵敏性保证了即使微量的可卡因也能被检测出来；便捷性则体现在操作相对简单，不需要复杂的设备和专业技术人员。

总的来说，基于核酸适配体的可卡因快速检测芯片为毒品检测提供了一种高效可靠的手段，有望在实际应用中发挥重要作用，为维护社会安全和公共健康贡献力量。第29页

核酸适配体在疾病诊断和新药研发领域具有重要价值。SELEX技术在这方面展现出巨大应用潜力，比如已有采用荧光标记的抗人凝血素核酸配基进行体内诊断的成功案例。

寡核苷酸适配子作为示踪剂，具备导向剂的所有特性。它的分子能够与放射性核素、毒素等结合，并精准递送至靶组织，因此被Hicke等人称作护送适配子。这一特性使得核酸适配体不仅可以用于体内显像，还能直接抑制靶蛋白，在治疗方面也有很大的潜力。

从疾病诊断角度看，核酸适配体为精准定位疾病位置提供了可能；从新药研发角度，它能提高药物的靶向性，让药物更精准地作用于病变部位，减少对正常组织的损伤。可以说，核酸适配体是疾病诊断和新药研发领域一颗极具潜力的新星，未来有望在医疗领域发挥更大的作用。第30页

未修饰适配体在血液中的清除速度极快，半衰期仅为几分钟到几小时。这主要是由于核酸酶的降解作用，以及适配体本身分子量低，易被肾脏从体内清除。这种快速清除的特性，决定了未修饰适配体目前的应用方向。

当前，未修饰适配体的应用聚焦在两个方面。一方面是治疗短暂性病症，比如血液凝固问题，这类病症往往需要在短时间内发挥作用，适配体的快速清除特性不会影响治疗效果，反而能避免长期留存带来的潜在风险。另一方面是用于局部给药可行的器官治疗，像眼睛。在眼睛这样的局部器官中，适配体可以直接发挥作用，而快速清除也能减少对全身的影响。

不过，快速清除并非全然是缺点。在体内诊断成像等应用中，它反而成为了一种优势。在进行体内诊断成像时，适配体需要快速到达目标部位并产生信号，完成任务后又能迅速从体内清除，这样可以避免残留适配体干扰后续的检测和诊断，提高成像的准确性和效率。所以，未修饰适配体虽然有其局限性，但在特定的应用场景中，仍能发挥重要的作用。第31页Aptamers

(fromtheLatinaptus-fit,andGreekmeros-part)核酸适配体（NucleicAcidaptamers）多肽适配体（Peptideaptamers）什么是核酸适配体？核酸适配体是具有稳定的二级结构，能够和靶标分子特异性结合的，人工合成的核酸。它可以是RNA

也可以是DNA，长度一般为25~60个核苷酸。它是一系列单链核酸分子，与长度相同的特异靶分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。核酸适配体可以结合的靶分子有小分子、蛋白、细菌、病毒、细胞和组织等。核酸适配体概念的提出1989年，悉尼·奥尔特曼、托马斯·切赫因为对RNA的催化作用的研究共同获得诺贝尔化学奖。支持RNA为生命起源假说的可能证据：如果我们能找到完全或者主要依赖RNA进行生命活动的生物；如果在现存生物的基因组里找到负责基本生命活动的功能性RNA的"痕迹"；如果我们能够从随机RNA序列库中筛选到能够完成基本生命活动的RNA序列。生命活动的基础是什么？--Binding!如果我们都能找出一个有相当强亲和性和特异性的RNA序列，那我们就向证明"RNA起源说"迈出了一步。1990年，两个研究组几乎同时用T4DNApolymerase与几种有机染料做靶分别筛选出了特异性结合的RNA分子，并把这种RNA叫做aptamer。1992年Ellington和Szostak又用相似的方法筛选出了可以和靶分子特异性结合的单链DNA分子，从而证明了单链DNA也可以折叠成特殊的三维结构，并暗示DNA可能也会具有催化活性。1TuerkC,GoldL.1990.Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment:RNAligandstobacteriophageT4DNApolymerase.Science249:505–10；2EllingtonAD,SzostakJW.1990.InvitroselectionofRNAmoleculesthatbindspecificligands.Nature346:818–22自然界中Aptamer存在的证据：

RiboswitchesRiboswitches:theoldestmechanismfortheregulationofgeneexpression核糖开关是2002年，由耶鲁大学的分子生物学家Ronald

Breaher和他的同事在受Andrew等人的研究成果启发下发现并命名的，它是能够与代谢物或其他小分子配体结合，通过构象变化调控目的基因转录或翻译的RNA结构元件。Aptamer巨大的应用前景APTAMERS:ANEMERGINGCLASSOFTHERAPEUTICS（.Annu.Rev.Med.2005.56:555–83）AnalyticalApplicationsofAptamers(AndrewD.Ellington.AnnualReviewofAnalyticalChemistry(2008).Volume1,Jul2008)核酸适配体的第一个临床应用2005年12月20日，美国FDA宣布批准哌加他尼钠注射液（Macugen）用于治疗眼科疾病新生血管型（湿性）老年黄斑病变（Age-RelatedMacularDegeneration，AMD）患者的视力缓慢丧失。Macugen是一种选择性血管内皮生产因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）拮抗剂。核酸适配体的化学本质与识别机理核酸适配体的化学本质是核酸，它与配体的结合是基于单链核酸结构和空间构象的多样性。在靶分子存在的条件下，它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠形成发卡(hairpin)、假结(pseudoknot)、凸环(stemloop)、G2四分体(G2quartet)等稳定的三维空间结构。这样形成的适配体结构与靶分子之间有较大的接触面积，能与靶物质的紧密结合，具有高亲和力和高特异性。经过SELEX技术反复筛选的适配体能与靶分子以极高的亲和力和特异性相结。核酸适体与靶物质亲和力极高，kd值多在pmol/L-nmol/L之间。StructureofanRNAaptamerspecificforbiotin.Theaptamersurfaceandbackboneareshowninyellow.Biotin(spheres)fitssnuglyintoacavityoftheRNAsurface核酸适配体的筛选策略核酸适配体的体外筛选是利用SELEX技术（SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)

）来完成的，SELEX是指数富集配体系统进化的简称，它的基本原理就是就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度在20～100个碱基左右．将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸配基(aptamer)，经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶分子特异结合的寡核苷酸序列得到富集。SELEX筛选流程首先，确立筛选方法。根据不同的配体选择具有不同特性的适配体并以此确定具体的适配体筛选方法；其次，建立筛选文库。人工建立一个约含有1015个不同寡核苷酸的随机序列库，随机序列的两端为固定序列，是之后PCR循环中要用的，如果是筛选RNA-aptamer，要在5´端引物中加上一段T7启动子，以便识别转录过程中所需要的T7RNA聚合酶，把靶分子加入到该库中，充分结合后，将与靶分子结合的寡核苷酸序列分离出来。然后，通过PCR或RT-PCR等技术进行扩增，生成次一级文库，次一级文库再与配体结合，反复多次循环，随着每一轮筛选条件的不断提高，与靶目标高度特意结合的DNA或RNA分子呈指数增长，而亲和力低的序列逐步被淘汰，直到获得合适的序列。

筛选流程图核酸适配体筛选中的分离方法毛细管电泳超滤离心膜分离法硝酸纤维素膜分离法亲和介质分离用SELEX技术筛选核酸适配体的过程中，关键步骤之一是对结合靶分子的序列与未结合靶分子序列进行高效分离。主要分离方法有：毛细管电泳毛细管电泳的原理是基于不同组间荷质比差异导致的电泳迁移率不同而进行分离，在电场中，待分离组分在50~75μm内径的毛细管中因荷质比差异导致不同的迁移速度而得到分离，当靶分子与其aptamer亲和作用足够强,形成的复合物足够稳定时，在合适的分离和检测条件下，可分别得到游离的寡核苷酸与复合物的电泳峰。超滤离心膜分离超滤离心膜有两部分组成，一部分为滤膜滤芯．另一部分为套管，进行分离离心时套管套住滤芯，将需要分离的液体加在滤芯上．通过高速离心将不与靶标结合的游离寡核苷酸滤掉，将与靶标特异性结合的ssDNA留在超滤离心膜上。超滤滤离心膜在SELEX技术中的应用可以满足分离要求，而且操作简便。亲和介质分离一些具有亲和表面的介质也用于适配体的筛选，如琼脂糖、纤维素及具有亲和表面的小珠或小柱等。如J.ColinCox等人利用链霉亲和素标记的磁珠完成了溶菌酶适配体的自动化筛选。具体流程为：通过链酶亲和素与生物素的相互作用，将生物素化的靶蛋白固定在磁珠上。随后特异结合序列的分离，RT-PCR扩增和转录都通过设定的程序自动完成，最后筛选得到的序列克隆到载体中进行测序鉴定。通过这种自动化筛选工作台，Cox等只用了不到两天的时间就完成了12轮的筛选。核酸适配体的应用核酸适配体在分析化学中的应用核酸适配体与疾病诊断和新药研发核酸适配体在分析化学中的应用

靶物质的分析与检测该方面应用的基本思路是将各种报告基团，如荧光试剂，定点标记在aptamer核苷酸上，然后在一定条件下，使aptamer与靶物质发生相互作用，再通过对报告基团的信号检测实现对靶物质的定性检测或定量分析。Tan等将aptamer应用于分子信标研究，发展了一种高效、高灵敏检测生物分子的方法—分子aptamer信标(MAB)。他们将凝血酶aptamer的5´和3´端分别标记上荧光素和猝灭剂，凝血酶不存在时，aptamer分子呈茎环结构，两端的荧光素与猝灭剂相互靠近发生能量转移而观察不到荧光；在结合凝血酶后aptamer分子构象改变，致使MAB的荧光素与猝灭剂分开从而可以检测到荧光信号，并且随着凝血酶浓度的增加荧光强度增强。蛋白质检测Lindner等发展了一种基于aptamer芯片的蛋白质检测方法，将能特异识别IgE的ssDNA-aptamer和IgE抗体分别固定在芯片上，然后将IgE与其温育，发现aptamer对IgE的特异性和敏感性比IgE抗体更好。该方法对IgE的检测限达到10ng/ml。Lindner等还通过aptamer芯片系统成功地从混合蛋白质中识别出专一性的蛋白，而且利用凝血酶aptamer证明了在同一芯片上同时检测两种蛋白方法的可行性。总之，寡核苷酸aptamer作为低分子量的分子受体，它在芯片上能专一性地检测蛋白质而且很稳定，以它为阵列来捕获蛋白质将为蛋白质组学研究的发展起到重要作用。基于适配体的生物传感器是用适配体作为识别元件来特异性地检测其相应的靶物质。目前适配体生物传感器（Aptasensors）尚处于起步阶段。ChunyanYao等将IgE适配体固定在石英晶体微平衡生物传感器阵列，建立了适配体压电石英生物传感器模型，用于特异性检测标准溶液和人血清中的IgE。该方法最低可在标准和人血清溶液中分别检测出2.5-200ug/L的IgE，整个检测时间只需15min，而且固定在金膜表面的适配子在反复洗脱后并不影响其灵敏度。针对三价砷的核酸适配体在三价砷离子存在的情况下与砷离子优先结合,而带有正电荷的PDDA会导致带负电荷的金纳米粒子的聚集,从而颜色由红变蓝实现比色法测定利用核酸适配体与铅和汞分别形成G-quartet结构和发卡结构的构型实现了对铅和汞的同时测定钾离子能够使富含鸟嘌呤的核酸适配体形成特异的G-quadruplex二级构型并对此结构有一定的稳定作用,因此可以通过监测核酸适配体二级结构信号的变化实现对钾离子的检测在不存在双酚A的情况下,核酸适配体吸附在金纳米粒子表面,使其不受金属离子的聚集作用,当溶液中存在双酚A,适配体与双酚A特异性结合,金纳米粒子失去了核酸适配体的保护在金属离子的作用下发生聚集,颜色由红变蓝,可以通过肉眼判别实现对双酚A的检测。该方法的检测限可达0.1ng/mL基于核酸适配体的可卡因快速检测芯片及原理图核酸适配体与疾病诊断和新药研发

疾病诊断

SELEX在疾病诊断与成像方面显示出巨大的应用潜力，已有荧光标记的抗人凝血素核酸配基用于体内诊断的报道。作为示踪剂．寡核苷酸适配子具备了作为导向剂所需的所有特性，其分子可结合放射性核素、毒素等。并递送到靶组织，Hicke等称之为护送适配子(escortaptaraer)．它同时具有直接抑制靶蛋白的功能。是非常有潜力的体内显像和治疗药物。Non-modifiedaptamersareclearedrapidlyfromthebloodstream,withahalf-lifeofminutestohours,mainlyduetonucleasedegradationandclearancefromthebodybythekidneys,aresultoftheaptamer'sinherentlylowmolecularweight.Unmodifiedaptamerapplicationscurrentlyfocusontreatingtransientconditionssuchasbloodclotting,ortreatingorganssuchastheeyewherelocaldeliveryispossible.Thisrapidclearancecanbeanadvantageinapplicationssuchasinvivodiagnosticimaging.Schematicrepresentationofthenovelstrategyforinvivocancerimagingusingactivatableaptamerprobe(AAP)basedoncellmembraneprotein-triggeredconformationalteration.TheAAPconsistsofthreefragments:acancer-targetedaptamersequence(A-strand),apoly-Tlinker(T-strand),andashortDNAsequence(C-strand)complementarytoapartoftheA-strand,withafluorophoreandaquencherattachedateitherterminus.Intheabsenceofatarget,theAAPishairpinstructured,resultinginaquenchedfluorescence.Whentheprobeisboundtomembranereceptorsofthetargetcancercell,itsconformationisaltered,thusresultinginanactivatedfluorescencesignal.湖南大学王柯敏教授，ProcNatlAcadSciUSA.2011Mar8;108(10):3900-5Severalmodifications,suchas2'-fluorine-substitutedpyrimidines,polyethyleneglycol(PEG)linkage,etc.(bothofwhichareusedinMacugen,anFDA-approvedaptamer)areavailabletoscientistswithwhichtoincreasetheserumhalf-lifeofaptamerseasilytothedayorevenweektimescale.AnotherapproachtoincreasethenucleaseresistanceofaptamersistodevelopSpiegelmers,whicharecomposedentirelyofanunnaturalL-ribonucleicacidbackbone.AspiegelmerofthesamesequencehasthesamebindingpropertiesofthecorrespondingRNAaptamer,exceptitbindstothemirrorimageofitstargetmolecule.Inadditiontothedevelopmentofaptamer-basedtherapeutics,manyresearcherssuchastheEllingtonlabandindependentlyanothercompanySomaLogic(Boulder,CO)havebeendevelopingdiagnostictechniquesforaptamerbasedplasmaproteinprofilingcalledaptamerplasmaproteomics.Thistechnologywillenablefuturemulti-biomarkerproteinmeasurementsthatcanaiddiagnosticdistinctionofdiseaseversushealthystates.新药研发在新药研发方面，aptamer可以鉴定药物靶标，尤其是多道自动工作站的应用更是加速药物靶标高通量筛选和功能鉴定的进程.Aptamer可以作为药物分子或先导分子．以及作为生物导弹指导靶向治疗．利用SELEX技术筛选获得的针对VEGF的RNA配基(aptamer)，经过美国Eyetech和Pfizer制药公司15年的研制，已经于2004年12月获得美国FDA批准上市，商品名为Macugen，用于老年性视网膜黄斑营养不良(AMD)的治疗。同时，根据aptamer的反义序列设计的antidote还可作为解毒剂与aptamer联合应用，及时清除体内过量aptamer分子，在心血管疾病，抗病毒药物，肿瘤治疗方面都具有广阔的前景．核酸适配体与抗体的比较与传统抗体相比，核酸适配体具有其无法比拟的性能和优势:寡核苷酸序列库的筛选是通过化学方法合成的，不依赖于生物体，可以大量的快速的在体外合成；可以针对不同的目标靶进行筛选，包括生物毒性大分子以及只具有半抗原的分子，且目标范围比较广；核酸适配体具有和抗体相当甚至更高的亲和性以及较高的热稳定性，变性的适配体也很容易再生；核酸适配体的纯度高，批间差异比抗体要小；适配体末端易于连接一些活性基团，容易被固定在基质上，末端指示基团的修饰比抗体容易的多。核酸适配体与目标物的结合是依靠四种基本核苷酸组成的结构，与由二十种基本氨基酸残基组成的抗体蛋白质相比，其可能的结合形式远不如后者丰富。这可能会限制高亲和力或特异性核酸适配体的获得。但是，需要指出的是，某些化合物与核酸适配体的亲和力比其已知的单克隆抗体的亲和力高，双酚A就是一个典型例子。作为只有几十个核苷酸残基组成的聚合物，核酸适配体的构象受环境条件影响较大，pH值、离子强度、干扰离子等的变化都有可能影响核酸适配体与目标物的亲和力。另外，实际样品中可能存在的核酸酶也可能影响到适配体结构的稳定性。因此，核酸适配体在实际应用中的适应性是一个急需解决的问题。另外，小分子核酸适配体的常规筛选策略是将小分子固定在固相载体上，利用SELEX技术筛选与固定化小分子有较高亲和力的寡核苷酸。但是，这种连接可能会掩盖或破坏小分子的结构特征或电荷分布，从而使这些寡核苷酸与游离小分子的亲和力可能并不高[53]。解决这一问题的思路之一是尝试研究能够对游离化合物进行适配体筛选的方法。核酸适配体的前景展望核酸适体（Aptamer）是一类新型的识别分子。与单克隆抗体相比，其分子量较低(15-50碱基)，没有免疫源性和毒性，可通过化