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文档简介

1.1.DNA断裂（DSB）2.CRISPR-Cas系统的碱基编辑工具（ABE、CBE等）体外细胞模型（HEK293、Hela、iPSC等）3.3.1碱基编辑（BaseEditing,利用融合蛋白（dCas9nCas9与脱氨酶结合）DNA3.1碱基编辑（BaseEditing,利用融合蛋白（dCas9nCas9与脱氨酶结合）DNARNA3.2脱靶效应（Off-TargetDNARNA3.3预测脱靶位点（PredictedOff-Target通过生物信息学工具（Cas-OFFinder、CCTop等）实验验证脱靶位点（EmpiricallyValidatedOff-Target通过高通量测序（如全基因组测序、靶向测序）或分子生物学方法（4.4.14.1.1gRNA4.1.2Cas-OFFinder、CCTop、CRISPRitzgRNA4.1.2Cas-OFFinder、CCTop、CRISPRitz允许的错配数：≤4bp（SpCas9系统PAM序列要求（NGG、NG等4.2.1（1）全基因组测序Illumina测序文库，进行全基因组测序（30×覆盖深度设计引物扩增预测脱靶位点（扩增子长度：200-300使用高通量测序（IlluminaMiSeq/NovaSeq）优势：高灵敏度，可检测低频突变（<0.1%）设计引物扩增预测脱靶位点（扩增子长度：200-300使用高通量测序（IlluminaMiSeq/NovaSeq）优势：高灵敏度，可检测低频突变（<0.1%）Cas9-nickaseDNA，与碱基编辑蛋白+gRNADNADigenome-seqDNA4.2.2RNARNA数据分析：DESeq2、EdgeR检测差异表达基因（DEGs）4.34.3.1SNV/Indel突变频率≥显著高于背景噪声（如未处理对照组）ANNOVarSnpEff（SNV/Indel突变频率≥显著高于背景噪声（如未处理对照组）ANNOVarSnpEff（Fisher精确检验或卡方检验评估突变显著性（p多重假设校正（Benjamini-Hochberg法）4.4目标位点信息（gRNA序列、PAM类型实验验证的脱靶位点（突变频率、功能注释RNA脱靶分析结果（如有结论与建议（gRNA或改用高保真碱基编辑器）5.5.1细胞系：HEK293T、Hela、iPSCDNA提取试剂盒（Qiagen测序文库构建试剂盒（NEBNextUltraDNA提取试剂盒（Qiagen测序文库构建试剂盒（NEBNextUltraPCR引物（针对靶向测序）5.2高通量测序仪（IlluminaPCR仪电泳系统（琼脂糖凝胶电泳生物信息学分析服务器（Linux系统）6.6.1全基因组测序：≥30靶向测序：≥1000RNA-seq：≥20Mreads/sample

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