蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测酶抑制率法分光光度法专家讲座

分光光度法原理介绍酶抑制率法(分光光度法)第1页吸光光度法:基于物质对光选择性吸收而建立分析方法,包含目测比色法和分光光度法。不一样物质因为结构不一样,所吸收光波长及吸收程度不一样,这就是物质对光选择性吸收第2页当一束强度为I0平行单色光经过一均匀吸收介质时，因为吸光物质分子与光子作用，一部分光子被吸收，一部分光子透过介质。设透过光强度为It，则透光率T定义为T=It/I0，而－lgT称为吸光度A，即Ａ＝－lgT=lgI0/It

入射光I0透射光It第3页测量某物质对不一样波长单色光吸收程度，以波长（）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制吸光度随波长改变可得一曲线，此曲线即为吸收光谱。不一样浓度同一物质，它最大吸收波长是不变，但吸光度随浓度增大而增大。

在最大吸收波优点测量吸光度，其灵敏度最高。第4页有色溶液对某一波长光吸收强度与有色物质浓度c及吸光溶液液层厚度b成正比，称为光吸收定律或朗伯－比尔定律，其数学表示式为A=εbc1.00.50ACA100500T%T式中：b为液层厚度，单位为cm；c为浓度，单位为mol.L-1；ε为摩尔吸光系数，单位为L.mol-1.cm-1。第5页光电比色法分光光度法（紫外-可见分光光度法）UV-VISUltraviolet

VisualSpectroscopy0.575光源单色器吸收池检测器显示I0It参比样品入射光I0透射光It第6页原理在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功效有抑制作用，其抑制率与农药浓度呈正比。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间改变值，计算出抑制率，经过抑制率能够判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在。第7页原理第8页试剂pH8.0缓冲溶液分别取11.9g无水磷酸氢二钾与３.２g磷酸二氢钾，用1000mL蒸馏水溶解。显色剂分别取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氢钠，用20mL缓冲溶液溶解，4℃冰箱中保留。第9页试剂底物：取25.0mg硫代乙酰胆碱，加3.0mL蒸馏水溶解，摇匀后置4℃冰箱中保留备用。乙酰胆碱酯酶依据酶活性情况，用缓冲溶液溶解，3min吸光度改变ΔA0值应控制在0.3以上。摇匀后置4℃冰箱中保留备用。第10页分析步骤样品处理：选取有代表性蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取样品1g，放入烧杯或提取瓶中，加入5mL缓冲溶液，振荡1~2min，倒出提取液,静置3~5min,待用。对照溶液测试：先于试管中加入2.5mL缓冲溶液，再加入0.lmL酶液、0.1mL显色剂，摇匀后于37℃放置15min以上（每批样品控制时间应一致）。加入0.lmL底物摇匀，此时检液开始显色反应，应马上放入仪器比色池中，统计反应3min吸光度改变值ΔA0样品溶液测试：先于试管中加入2.5mL样品提取液，其它操作与对照溶液测试相同，统计反应3min吸光度改变值ΔAt第11页结果计算

抑制率(%)=[(ΔA0-ΔAt)/ΔA0]×100式中：ΔA0对照溶液反应3min吸光度改变值；

ΔAt样品溶液反应3min吸光度改变值；第12页结果判定

结果以酶被抑制程度（抑制率）表示。当蔬菜样品提取液对酶抑制率≥50%时,表示蔬菜中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在，样品为阳性结果。阳性结果样品需要重复检验2次以上。第13页酶抑制率法对部分农药检出限农药名称检出限

mg/kg农药名称检出限

mg/kg敌敌畏0.1氧化乐果0.8对硫磷1甲基异柳磷5辛硫磷0.3灭多威0.1甲胺磷2丁硫克百威0.05马拉硫磷4敌百虫0.2乐果3呋南丹0.05第14页说明

葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响植物次生物质，轻易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整株（体）蔬菜浸提。对一些含叶绿素较高蔬菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提方法，降低色素干扰。当温度条件低于37°C，酶反应速度随之放慢，加入酶液和显色剂后放置反应时间应相对延长，延长时间确实定，应以胆碱酯酶空白对照测试3min吸光度改变DA0值在0.3以上，即可