（正式版）DB37∕T 2841-2016 《鸭坦布苏病毒半套式R∕T -PCR检测方法》

DB37/T2841—2016鸭坦布苏病毒半套式RT-PCR检测方法2016-10-18实施2016-10-18实施IDB37/T2841—2016本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学。本标准主要起草人：刁有祥、唐熠、陈浩、冯强、提金凤。DB37/T2841—2016鸭坦布苏病毒半套式RT-PCR检测方法本标准规定了鸭坦布苏病毒半套式RT-PCR(反转录-聚合酶链式反应)检测方法的样品采集和保存、样品处理、试剂及仪器、检测步骤、结果判定等。囊液中坦布苏病毒的核酸，也适用于鹅和其他动物坦布苏病毒核酸的检测。生物安全柜、PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外凝胶成像仪、微量移液不得倒流；电泳区与其他操作区域相互隔离。操作者应接受过实验室生物安全培训、分子生物学实验室检测技术培训。熟悉防止RNA降解、核酸3.1.2rTaqDNA聚合酶(5U/μL);3.1.55×M-MLVB3.1.6dNTPs(2.5mmol/L,10mmol/L);3.1.81.5%琼脂糖凝胶，见A.1;3.1.10溴化乙锭(10μg/μL),见A.3;3.1.11核酸电泳加样缓冲液，见A.4;3.1.12商品化的DNA分子量标准，要求在100bp～2000bp之间，有5条以上的指示条带；工DB37/T2841—201623.1.13已知的坦布苏病毒鸭胚尿囊液制作的阳性对照标准品；3.1.14用高压灭菌的蒸馏水作为阴性对照标准品。反转录所需随机引物检测所需引物上游引物5455F:5’-ATGGATGAAGCYCATTTCAC-3’;下游内侧引物5371R:5’-CCAAAGTTGGCYCCCATCTC-3’;下游外侧引物5861R:5’-AGCACACGGCAATCTCAT-3’,扩增片段长度为277bp。4操作程序4.1样品的采集和处理4.1.1样品的采集死亡鸭采集卵泡膜、脾和脑等组织样品，进行分别处理或同时处理；活鸭采集咽喉或泄殖腔拭子。4.1.2样品的保存样品应放在含有抗生素的pH值7.0～7.4的等渗磷酸盐缓冲液(PBS,附录B.1)内(无PBS可用25%~50%甘油盐水，见附录B.2)。抗生素的选择视当地情况而定，组织和咽喉拭子悬液中应含有青霉素(2000IU/mL),链霉素(2mg/mL)、庆大霉素(50μg/mL)和制霉菌素(1000IU/mL),加入抗生素后pH值应调至7.0～7.4。在室温放置1h～2h内样品应尽快处理，不能处理的可在4℃存放24h,也可于低温条件下保存(-70℃贮存最好)。4.1.3病料的处理样品处理在生物安全柜中进行，咽喉或泄殖腔拭子，置于200μL含有抗生素的pH值7.0～7.4等渗磷酸盐缓冲液中；研碎的组织用含抗生素pH值7.0～7.4的等渗PBS溶液配成10%～20%(g/mL)的悬液。样品液经8000r/min离心10min,取上清液作为检测材料。4.2对照设置每次检测，用相应的阳性对照标准品和阴性对照标准品，至少设置一个或一个以上的阴性对照和阳4.3RNA提取4.4反转录反应体系RNA5μL,5×M-MLVBuffer2μL,随机引物1μL,dNTPs(10mmol/L)0.5μL,RNA酶抑制剂0.54.5反转录条件DB37/T2841—201634.6PCR反应10×PCRBuffer2.5μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL,引物5455F(100μmol/L)和5861R(100μmol/L)94℃预变性5min;94℃30s,50℃30s,72℃30s,进行30个循环；72℃延伸5min。4.6.2套式PCR反应10×PCRbuffer2.5μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL,引物5455F(100μmol/L)和5731R(100μmol/L)94℃预变性5min,94℃30s,50℃30s,72℃30s,进行30个循环；72℃延伸5min。。在位于凝胶中央的孔加入DNA分子量标准。加样后，按照5V/cm电压，电泳20min～40min(每次电泳时，每隔10min观察一次。当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶下2/5处时，可停止电泳)。电泳后，4.8结果判定阳性对照出现相应大小的扩增条带，且阴性对照无此扩增条带时，判定检测有效；否则判定检测结果无效，不能进行判断。坦布苏病毒半套式PCR产物的大小为277bp。如果在阳性对照出现277bp扩增条带，阴性对照无条带出现(引物二聚体除外)时试验成立。被检样品出现277bp条带为坦布苏病毒阳性，否则为阴性(附录C)。4(规范性附录)相关试剂的配制A.11.5%琼脂糖凝胶的配制琼脂糖1.5g0.5×TAE电泳缓冲液加至100mL微波炉中完全融化，待冷至50℃~60℃时加入溴化乙锭(EB)溶液5μL,摇匀。倒入电泳板上，凝固后，取下梳子，备用。A.21×TAE电泳缓冲液的配制A.2.1配制0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂)溶液(pH8.0)乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂·2H₂O)灭菌双蒸水氢氧化钠调pH至灭菌双蒸水加至羟基甲基氨基甲烷(Tris)242冰醋酸57.10.5mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂)溶液(pH8.0)100灭菌双蒸水加至1000gmLmLmL50×TAE电泳缓冲液灭菌双蒸水加至A.3溴化乙锭的配制溴化乙锭灭菌双蒸水加至20mgA.4核酸电泳加样缓冲液(10×)聚蔗糖灭菌双蒸水DB37/T2841—20165溴酚蓝0.1g二甲苯青0.