雌激素对A549细胞行为的影响

PAGEIPAGE题目：雌激素对A549细胞行为的影响题目：雌激素对A549细胞行为的影响PAGE7PAGE摘要目的：探讨雌激素E2对A549细胞行为学的影响。方法：体外培养人肺腺癌A549细胞，以DMSO处理的A549细胞作为对照组，检测对照组的增殖、凋亡、迁移和侵袭情况；实验组分别进行10nM/μL、7nM/μL、5nM/μL、4nM/μL、3nM/μL、2nM/μL和1nM/μL浓度雌激素对A549细胞进行处理，选择合适的雌激素E2浓度经过传代培养后使用CCK8试剂检测A549细胞的增殖情况；通过AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒检测A549细胞的凋亡情况；通过细胞划痕-愈合的实验方法检测A549细胞迁移情况的变化；用Transwell实验来进行细胞侵袭实验，检测A549细胞侵袭能力的变化。通过对照组和实验组A549细胞在增殖、凋亡、侵袭和迁移方面的变化来显示出雌激素对A549细胞行为学的影响。结果：成功将A549细胞传代培养，与对照组相比雌激素在高浓度时细胞增殖能力明显受到抑制，在低浓度情况下细胞活性显著增强；雌激素作用与A549细胞后，细胞凋亡率显著被抑制；迁移和侵袭细胞的数量显著减少，迁移和侵袭受到抑制。结论：1nM/μL浓度的雌激素对A549细胞的增殖具有促进作用，也抑制了细胞的凋亡，与此同时1nM/μL浓度的雌激素对细胞的迁移和侵袭具有抑制作用。关键词：雌激素，人肺腺癌A549细胞，增殖，凋亡，迁移，侵袭

ABSTRACTObjective:ExploringtheeffectsofestrogenonA549cellbehavior.Methods:HumanlungadenocarcinomaA549cellswereculturedinvitro,andA549cellstreatedwithDMSOwereusedasacontrolgrouptodetecttheproliferation,apoptosis,migrationandinvasionofthecontrolgroup;theexperimentalgroupwasperformed10nM/μL,7nM/μL,5nM/μL,4nM/μL,3nM/μL,2nM/μLand1nM/μLconcentrationsofestrogentotreatA549cells,selecttheappropriateconcentrationofestrogenE2aftersubcultureanduseCCK8reagenttodetecttheproliferationofA549cells;TheapoptosisofA549cellswasdetectedbyAnnexinV-FITCapoptosiskit;themigrationofA549cellswasdetectedbytheexperimentalmethodofcellscratch-healing;thecellinvasionexperimentwasconductedbyTranswellexperimenttodetecttheinvasionabilityofA549cellsVariety.TheeffectsofestrogenonthebehaviorofA549cellswereshownbythechangesinproliferation,apoptosis,invasionandmigrationofA549cellsinthecontrolandexperimentalgroups.Results:TheA549cellsweresuccessfullysubcultured.Comparedwiththecontrolgroup,thecellproliferationabilityofestrogenwassignificantlyinhibitedathighconcentration,andthecellactivitywassignificantlyenhancedatlowconcentration;aftertheactionofestrogenandA549cell,theapoptosisrateincreasedsignificantly;Thenumberofmigratingandinvadingcellsissignificantlyreduced.Conclusion:The1nM/μLconcentrationofestrogencanpromotetheproliferationofA549cellsandalsoinhibittheapoptosisofcells,whilethe1nM/μLconcentrationofestrogencaninhibitthemigrationandinvasionofcells.Keywords:Estrogen,LungcancerA549cells,Proliferation,apoptosis,migration,invasion目录TOC\o\h\z一、前言 4二、材料与方法 52.1实验材料 52.1.1细胞的来源 52.1.2试剂及相关耗材 52.1.3试剂配置 52.1.4实验仪器 62.2实验方法 62.2.1雌激素处理A549细胞 62.2.2A549细胞的增殖 72.2.3A549细胞的凋亡 82.2.4A549细胞的迁移——划痕愈合实验 82.2.3A549细胞的侵袭 9三、结果 93.1雌激素E2对A549细胞增殖的影响 93.2雌激素E2对A549细胞凋亡的影响 113.3雌激素E2A549细胞迁移能力的影响 112.2.4雌激素E2A549细胞侵袭能力的影响 13四、讨论 14五、结论 15参考文献 16致谢 18一、前言肺癌（lungcancer）是最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内[1,2]。且发病率逐年上升。据WHO每年的资料所显示，每年新发肺癌患者在世界上约有175万人，每年有160万人因肺癌去世，并且这个数字还在不断的上升中。从我国2015年癌症患者统计数据所显示，肺癌分别是女性和男性恶性肿瘤发病率的第二位和第一位，而死亡率在目前人类已知的癌症中使最高的，就目前的治疗手段来看，肺癌的主要治疗手段仍然是传统的手术治疗、化放疗等，但其治疗后健康情况较差，生存率较低[3,4]。因此，寻找新的肺癌的治疗切入点已成为待解决的关键问题。肺癌（lungcancer）全名是原发性支气管肺癌，主要病发于肺脏、支气管粘膜等部位，是最常见的原发性恶性肿瘤之一，在世界上[5]。依据病理学特点，肺癌可分为非小细胞癌（non-smallcelllungcancer,NSCLC）和小细胞癌（smallcelllungcancer,SCLC）。非小细胞癌占肺癌总体的75%以上，主要分为腺癌、鳞癌、肉瘤样癌和大细胞癌等。其中，鳞癌的发病率近年来呈现逐渐下降趋势，约占发病率的30%-40%；肺腺癌的发病率则呈现渐渐上升的趋势，约占肺癌发病率的40%-50%[6,7]，肺腺癌细胞分裂迅速，容易发生转移，通过放疗和化疗的治疗手段结果往往不是特别理想。肺腺癌往往在直径很小的时候就已经发生转移，患者发现时就已经处于Ⅲ期或Ⅳ期，没有治愈的可能。因此，科研人员将研究思路调整到分子靶向治疗。雌激素被划分为类固醇激素，它调节着人体的众多生理功能，是人体中不可缺少的激素[8,9]。细胞生长、增殖、发育和分化都需要雌激素的参与。雌激素除了对正常的人体细胞和生理过程产生影响外，它还在机体的肿瘤、代谢病、心血管疾病、神经退行性疾病、骨质疏松等疾病的病理过程发挥着重要作用[10]。近年来有数据表明，雌激素是非小细胞癌的重要驱动因素[11,12]。临床研究显示在体外和体内雌激素受体ERβ对非小细胞肺癌细胞的增殖有一定影响并波及人类肿瘤异种移植[13,14]。本研究综合国际相关领域的最新成果，拟通过细胞水平的研究，分析雌激素E2对肺癌细胞系的生物学行为影响。把肺腺癌A549细胞作为研究对象，研究经过雌激素E2刺激的A549细胞在增殖、凋亡、迁移和侵袭等行为学发生的变化。从而探讨雌激素对该细胞系生物学行为的影响[15]。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1细胞的来源人非小细胞肺癌细胞系A549（购自中科院上海细胞生物研究所）。2.1.2试剂与相关耗材无酶离心管、枪头（axygen公司）胎牛血清（Hyclone公司）1×PBS（Solarbio公司）0.25%Trypsin-EDTA（Solarbio公司）0.25%胰酶（不含EDTA）（Gibco公司）青霉素/链霉素双抗溶液（Gibco公司）雌激素（SIGMA公司）DMSO（sigma公司）DMEM高糖培养基（Hyclone公司）95%甲醛（上海生工生物公司）70%乙醇（上海生工生物公司）细胞凋亡试剂盒（上海碧云天公司）6孔板（axygen公司）96孔板（axygen公司）CCK8试剂（sigma公司）2.1.3试剂配置1×PBS（pH7.4）：使用称量天平称取NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.08g，KH2PO40.2g溶于800mLMilliQ水中，充分混匀，用HCl调pH至7.4，MilliQ定容至1L，室温保存备用。完全培养基：DMEM：90mL，胎牛血清：10mL，混匀，置于4°C保存备用。雌激素溶液：称取272.38mg的雌激素，加入到10ml的DMSO中，原液浓度为100nM/μL。然后用培养液稀释成合适浓度。4%多聚甲醛：使用称量天平称取4.0g多聚甲醛于适量的0.01MPB中，不停搅拌至溶解，以0.01MPB定容至100mL，用NaOH调pH至7.0，4°C保存备用。0.1MPBS（pH7.4）：使用称量天平称取Na2HPO4·12H2O3.5g，NaH2PO4·2H2O2.9g，以ddH2O溶解并定容至1000mL，调PH至7.4。0.01MPBS（pH7.2）：使用称量天平分别称取NaCl8.0g，KCl0.2g，KH2PO4·2H2O0.24g，Na2HPO4·12H2O1.44g，于ddH2O中溶解、定容至1000mL。0.25%胰蛋白酶：使用称量天平称取0.25g的胰蛋白酶粉末，用PBS在容量瓶中定容至1000ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存。0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液：称取0.25g的胰蛋白酶粉末和0.02g的EDTA，用PBS定容到1000ml，调节PH值为7.2-7.4，用0.22微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存。2.1.4实验仪器SW-CJ-1F超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）移液器（Eppendorf公司）CO2细胞培养箱（Thermo公司）超净工作台（AIRTECK公司）倒置相差显微镜（Olympus公司）Centifuge5417R冷冻离心机（Eppendorf公司）恒温磁力搅拌器（Biocote公司）快速混匀器（金坛市恒丰仪器厂）制冰机（SANYO公司）超净工作台（AIRTECK公司）酶标仪（ThermoFisher公司）水浴锅（金坛市恒丰仪器厂）流式细胞仪（ThermoFisher公司）压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）SAGA-10TJ超纯水机（南京易普易达科技发展有限公司）电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）JC-S型数显恒温三用水箱（上海成顺仪器仪表有限公司）全自动细胞计数器（ThermoFisher公司）2.2实验方法2.2.1雌激素处理A549细胞将实验所需的完培、胰酶、PBS等物品从4℃冰箱中取出，放在超净工作台上复温。准备好需要使用的离心管、移液器和一次性滴管等，放置与超净工作台上[16]。从CO2培养箱中取出细胞培养瓶，在超净工作台中将瓶内的旧培养基转移到15ml离心管中。使用PBS溶液清洗细胞培养瓶两次。加入合适的胰酶，以覆盖培养瓶为宜。室温，5min。将离心管中的旧培养基加入培养瓶使胰酶停止消化；并用一次性滴管吹打，将培养瓶上贴壁生长的A549细胞吹打下来，转移至15mL离心管中，使用离心机1000rpm离心5min。吸去上清，用PBS清洗细胞培养瓶两次，转移至离心管，再次离心，1000rpm，5min。弃上清，加入1mL完培将离心沉淀的细胞吹打重悬；在两个培养皿中加入5mL完培，并将离心管中的细胞平均转移到两个皿中，使用十字交叉混匀法令细胞快速分散，放入5%CO2培养箱中37℃培养[17]。3小时后观察到细胞贴壁，将完培倒出，重新加入含有不同浓度雌激素E2的完培。本次实验选用七个浓度梯度，分别是10nM/μL、7nM/μL、5nM/μL、4nM/μL、3nM/μL、2nM/μL和1nM/μL，而对照组中也加入相同体积的DMSO，从而参与对照实验。2.2.2A549细胞的增殖在48h后对传代的细胞进行计数。将培养皿中的旧培养液转移到干净离心管中，将配置好的0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液加入1mL到培养皿中，静置消化5min。将离心管中的旧培养液倒入培养皿中使胰酶终止消化，使用一次性滴管轻轻地吹打细胞使细胞从壁上脱落形成细胞悬液。取10μl细胞悬液滴加到计数板中，全自动计数仪计数。同时将使用移液器在每孔内加入100μl细胞悬液的96孔板，放入CO2培养箱中培养3h，使A549细胞贴壁生长。3h后在96孔板中的每孔内加入10μlCCK8溶液，在加入CCK8溶液时注意动作轻缓不要产生气泡，防止影响OD值的测量，将96孔板放入CO2培养箱中37℃继续培养2h；使用酶标仪测量培养后的细胞OD值，波长为450nm。以细胞培养时间为横坐标X轴，OD值为纵坐标Y轴做出折线图便于结果的分析。分析细胞的增殖情况。2.2.3A549细胞的凋亡从4℃冰箱中将AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒、离心管、PBS取出放置于超净工作台上复温备用；从培养箱中取出细胞培养皿，将培养皿中的旧培养液倒入干净离心管中留用，加入能够覆盖细胞表面的0.25%胰蛋白酶消化3min；3min后在倒置显微镜下观察，当细胞收缩变圆后加入离心管中的旧培养液停止消化，使用一次性滴管将A549细胞从培养皿壁上冲洗下来形成细胞悬液。把细胞悬液吸取到离心管内，1000rpm离心5min，弃上清；加入1mLPBS缓慢吹打重悬，再次离心清洗细胞，重复一次；吸取大约4×105个细胞加入到1.5mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，将100μL1×BindingBuffer加入离心管轻轻吹打混匀；加入5μLAnnexinV-FITC和10μL碘化丙啶（PI）StainingSolution，轻轻混匀；24℃用铝箔避光孵育10min，随后加入400μL1×BindingBuffer混匀后冰浴，在孵育10min内重悬细胞两次以加强染色效果；使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，AnnexinV-FITC使染色后的细胞在屏幕上为绿色荧光，碘化丙啶(PI)使染色后的细胞在屏幕上为红色荧光，因此凋亡细胞仅显示为绿色荧光，坏死细胞则显示为绿色荧光和红色荧光，未被荧光染色的细胞为正常细胞。使用CellQuest软件收集并整理数据，绘制双色散点图（two-colordotplot），以FITC为横坐标，碘化丙啶（PI）为纵坐标[18]，分析细胞凋亡数据。2.2.4A549细胞的迁移——划痕愈合实验使用Marker笔和直尺在6孔板背后均匀的横穿过孔地画出3条横线，每条间隔0.5cm；在每孔内加入处理后的A549细胞大约5×105个，5%浓度CO2培养箱37℃过夜培养；用10μL枪头在培养皿中用力均匀的划痕，划痕与用Marker笔所划的线垂直，PBS贴壁沿壁加入，清洗两次，将划下的细胞清理干净，加入2mL无血清的DMEM培养基，维持细胞状态；放入5%浓度的CO2培养箱中37℃培养。在24h、48h、72h三个时间点测量一次细胞运动的距离，拍照；数据处理：划痕愈合面积=0h面积-每个时间点面积，以此算出平均数和标准差，以拍摄的时间为横轴，划痕愈合百分比为纵轴（单位%）作图，并比较实验开始0时与实验结束72h时实验组与对照组的照片[19]。2.2.5A549细胞的侵袭在超净工作台上将Matrigel4℃融化，以DMEM培养基为溶剂将Matrigel稀释成300μL/mL的浓度，放置于-20℃冰箱备用；取出冰箱内冻存的Matrigel，4℃融化，取100μL的液体铺于Transwell的碳酸聚碳酸酯膜小室上，刚把聚碳酸酯膜浸湿是最佳状态，保存在37℃的环境下，直到Matrigel聚合成凝胶为止；每孔内加入200μL的无血清DMEM培养基让胶重构；在Transwell下面的小室内加入完全培养基600μL/孔；在每个上室孔中准确加入1×105个细胞，细胞悬液体积100μL，5%CO2培养箱37℃培养24小时；24h后将上室液体去除，小心取出上室，将膜上未穿过膜的细胞用湿棉签擦去,PBS洗涤两次；4%浓度甲醛固定30分钟，Giemsa染色15min，使用PBS溶液清洗2次以上，干燥，将微孔滤膜取出，使用倒置显微镜直接观察通过聚碳酸酯膜的细胞[20]；在每个聚碳酸酯膜的中心部位和膜周围随机取三个视野，清数穿过聚碳酸酯膜微孔的细胞数量。三、结果3.1雌激素对A549细胞增殖的影响与对照组相比，在24h后检测细胞OD值，当雌激素浓度在高浓度情况下，A549细胞显著活力降低，A549细胞增殖受抑制，而当雌激素浓度在1nM/μL时，细胞活力增强，细胞增殖得到促进，因此选用1nM/μL雌激素进行后续研究图1:DMSO和E2雌激素刺激后A549的增殖A、C：100×；B、D：200×图2:CCK8检测OD值图33.2雌激素对A549细胞凋亡的影响对处理后的A549细胞使用AnnexinV-FITC和碘化丙啶（PI）进行染色，然后借助流式细胞仪检测被DMSO和雌激素处理后的A549细胞凋亡情况，结果表明雌激素组细胞凋亡率（8.38%）明显小于DMSO对照组的凋亡率（17.33%），差异具有统计学意义，表明1nM/μL浓度的雌激素对A549细胞的凋亡具有抑制作用。图4:流式细胞仪分析A549细胞凋亡3.3雌激素对A549细胞迁移能力的影响在进行划痕实验后，更换培养基进行迁移培养。在相同时间内比较细胞迁移距离的差异来判断细胞迁移能力，分别在细胞培养0h、24h、48h和72h拍照。使用软件分析，我们很明显的可以看到24h后DMSO组的细胞已经发生了迁移，而E2组还未发生。在48h后E2组的细胞多于DMSO组。72h后DMSO组大量细胞发生凋亡，E2组的细胞数量并没有大量减少。通过柱状图可以很明显的看到雌激素实验组的迁移距离明显小于DMSO实验对照组，说明1nM/μL浓度的雌激素对A549细胞的迁移具有抑制作用。（图4、图5）图5:A549细胞的划痕愈合百分比图6:A549细胞的迁移40×倍境下观察3.4雌激素对A549细胞侵袭能力影响我们通过使用软件计算穿过铺有Matrigel滤膜的孔室的细胞数来判断A549细胞的侵袭能力，结果由柱状图所示：雌激素实验组平均的侵袭细胞数明显低于DMSO处理的对照组，结果提示我们雌激素对A549细胞的侵袭具有抑制作用。（图6、图7）图7:A549细胞平均穿膜数图8200×倍境下观察四、讨论大多数肺癌患者都是因为非小细胞癌日常难以发现，在发现以后往往已经处于Ⅲ期或者Ⅳ期，情况危重，失去手术治疗的机会，往往只能给予维持生命的治疗、放疗、化疗等传统治疗[21,22]。传统的放疗等治疗手段因为缺乏特异性的缘故，肺腺癌细胞被杀伤的同时，健康的细胞也会受到损伤，众多的机体不良反应由此发生。针对患者肿瘤肿瘤基因型中的致癌途径和驱动因素，靶向治疗比针对肺腺癌患者的非靶向治疗更加有效[23]。但是靶向治疗也有一定的缺陷，单个药物的个体靶向治疗方法仅能治疗那些已知的具有异常分子构成致癌引起的患者。想要为更多的患者群体提供有效的治疗就要求众多的科研工作者确定更多的致癌途径或因素来进行针对性的抑制[24,25]。雌激素（Estrogen）是女性主要产生的荷尔蒙之一，主要在雌性的卵巢和胎盘分泌产生，维持雌性众多生理活动，雌激素在一些疾病的治疗方面也具有重要作用，临床上被用来治疗乳腺癌等疾病[26]。也有研究证明雌激素的水平过高也会增肌妇科疾病的发病率，雌激素也会加速青少年的骨闭合，使孩子的身高停止发育[27,28]。已有大量的研究证明两个经典雌激素受体：ERα和ERβ在正常的肺组织和肺癌特别是肺腺癌中有所表达，我们推测这就是导致女性肺癌的发病率高于男性的因素之一[29]。在本实验中，我们利用细胞行为学实验，通过雌激素对A549细胞进行处理，进而检测细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭验证这一观点。在雌激素对A549细胞成功处理后，细胞的活力增强，促进细胞增殖，同时细胞的凋亡也被抑制了。但是本次实验也还有很多的不足之处，在1nM/μL浓度的雌激素处理后，细胞的迁移和侵袭被抑制。这不符合肺腺癌自身易转移的特性。我猜想这可能与本次实验选用的雌激素浓度有关系，在增殖实验中因为1nM/μL的雌激素处理A549细胞后活力最强，因此在后续的实验中我选择了相同浓度，而没有将剩下的浓度梯度做完，所以我们可以猜测不同表达量的雌激素对A549细胞的行为具有不同的影响，当然也可能是其他的物质促进了肺腺癌细胞的迁移和侵袭，这方面以后的研究中可以进一步探讨。因此，我们可以猜测雌激素可以在肺腺癌患者的产生新的效果，通过雌激素治疗，抑制早期肺腺癌的转移，从而使传统的手术疗法获得更好的效果。结论1nM/μL浓度的雌激素对A549细胞的增殖具有促进作用，也抑制了细胞的凋亡，与此同时1nM/μL浓度的雌激素对细胞的迁移和侵袭具有抑制作用。参考文献[1]TorreLA,SiegelRL,JemalA.Lungcancerstatistics[J].Advancesinexperimentalmedicineandbiology,2016,893:1-19.[2]SiegelRL,MaJ,ZouZ,etal.Cancerstatistics[J].CACancerJClin,2014,64:9-29.[3]HouJ,SunE,ZhangZH,etal.Improvedoralabsorptionandanti-lungcanceractivityofpaclitaxel-loadedmixedmicelles[J].Drugdelivery,2017,24(1):261-269.[4]ChenW,ZhengR,BaadePD,etal.CancerstatisticsinChina,2015[J].CACancerJClin,2016,66(2):115-132.[5]郭惠琴.怎样让肺癌患者活得更久[J].江苏卫生保健,2015(15):23.[6]仙米斯亚.阿布力孜.新医大一附院2005年-2010年维吾尔族恶性肿瘤住院患者的疾病构成及变化[D].新疆医科大学,2011.[7]HouJ,SunE,ZhangZH,etal.Improvedoralabsorptionandanti-lungcanceractivityofpaclitaxel-loadedmixedmicelles[J].Drugdelivery,2017,24(1):261-269.[8]陈海霞.17β-羟类固醇脱氢酶2及孕激素受体B亚型在子宫内膜息肉中的表达及意义[D].郑州大学,2011.[9]SardenberRAS,MelloES,YounesRN.The

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