醋酸巴多昔芬有关物质方法开发

前言一、治疗骨质疏松症的研究现状骨质疏松症（osteoporosis）是一种进行性骨骼疾病，骨密度降低和骨组织微结构改变是主要的变化标志，其发病因素有许多，但已确定的是骨重构过程失衡。骨质疏松症患者不仅容易骨折，而且难以修复，给患者带来疼痛、骨骼变形等多种问题，目前全球发病率已超过25%[1]。骨质疏松症是临床内分泌科较为常见的疾病，是由多种原因而导致的一种骨病，患者的骨组织会出现正常的钙化，骨质吸收的增加为多数患者骨组织减少的原因，患者的临床症状多表现为腰背疼痛、骨折、驼背以及呼吸功能下降等，严重者还可能会引发乳腺癌[2]，在人体老化的正常生理过程中，导致女性患者骨强度下降的主要原因之一就是女性因绝经而引起其雌激素水平明显下降。在对骨质疏松患者的临床治疗上，总结出该疾病具有发病率高、致残致死率高以及骨折风险高等的特点，而且患者的治疗依从性、临床诊断率和治疗率相对较低，在总体上的治疗效果并不十分理想[3]。根据我国一次大规模的流行病学调查显示，年龄在50岁以上的人群中，女性患有骨质疏松疾病的约占总数的20%左右，而男性则约为14%左右，尤其随着社会老龄化情况的加剧，患有骨质疏松症的人群呈现逐年上升的趋势，主要发病人群为中老年人和绝经后的女性，且年龄在60岁以上人群的发病率急剧升高，患病患者在总体上女性多于男性[4]。近年来，我国骨质疏松症的患病率逐渐攀升。一项大规模的全国流行病学调查显示，国内骨质疏松症总患病率为12.4%，总人数已超过1.6亿，是全球骨质疏松症患者最多的国家。此外，骨质疏松发病人群存在明显的“年轻化”趋势，预计到2020年，我国骨质疏松和低骨量患者人数将增加至2.8亿。随着骨质疏松的发病率的趋势的不断上升，对该类疾病患者的药物治疗方法也已经得到广泛的临床关注。临床上对骨质疏松症进行治疗的药物主要有对骨形成促进、对骨吸收抑制两大类。随着近些年来研究的不断深入，临床上开始从破骨细胞、成骨细胞的生物学研究方面入手，不断研究新型的药物对继发性骨质疏松、原发性骨质疏松疾病进行有效的预防和治疗，且取得了较为成功的进展。对骨质疏松患者的主要治疗方案为维生素D、钙剂联合抗骨质疏松药物进行治疗，抗骨质疏松药物主要包括雌激素、双膦酸盐类、甲状旁腺激素、雷洛昔芬以及醋酸巴多昔芬等[5-6]。中西药结合治疗在对骨质疏松症也已经得到了广泛应用[7]，主要包括补肾壮骨汤与阿仑膦酸钠联合、右归饮和盐酸雷洛昔芬联合等[8]。此外，对骨质疏松患者的药物合理使用剂量、临床不良反应等问题，仍需时刻注意。二、醋酸巴多昔芬研究现状醋酸巴多昔芬(bazedoxifene)是具有新化学结构的新一代选择性雌激素受体调节剂（SERM），在改善乳腺癌和子宫内膜组织安全性的同时又对骨和血脂有更好的疗效[9]。其化学名为1-[4-（2-氮杂环庚烷-1-基-乙氧基-苄基）]-2-（4-羟基-苯基）-3-甲基-1H-吲哚-5-酚醋酸盐，化学结构如图1所示。可以竞争性地抑制17α-雌二醇与ERα和ERβ的结合，对骨骼有雌激素激动剂活性，能改善脊椎和髋部的骨密度，故能显著降低骨质疏松症绝经妇女的椎骨骨折风险。单独使用对人乳癌细胞系无激动剂活性。主要适应证为预防和治疗绝经期后骨质疏松症[10]。目前进行的多中心的II期临床研究显示，巴多昔芬联合雌激素可预防骨质丢失，且不会刺激乳腺或子宫。空腹口服一次，巴多昔芬大约给药在2至3小时达到最大血浆浓度，消除半衰期为23至35小时。图1醋酸巴多昔芬的化学结构醋酸巴多昔芬片由惠氏制药公司（2009年10月辉瑞公司正式完成对惠氏公司的收购）研发并投入市场。醋酸巴多昔芬于2009年4月27日通过欧洲药监局EMA批准在意大利和西班牙上市，商品名为Conbriza；2010年7月在日本上市，商品名为Viviant；2013年10月获美国食药监局FDA批准，以商品名Duavee在美国上市。醋酸巴多昔芬片的商品规格为20mg/片[11]。2015年，国务院与国家食品药品监督管理局相继出台了一系列政策[11-13]，仿制药质量和疗效一致性评价是此次国家改革政策中的重点任务，仿制药与原研药的等效性是我国仿制药研发的重要评价指标，在醋酸巴多昔芬的研究中，还存在诸多的问题待解决。目前，国内外测定醋酸巴多昔芬有关物质、含量的药物分析方法的文献较少，且研究种类与合成工艺路线有关，而多数文献中HPLC方法测得巴多昔芬主峰与相邻杂质的分离度较小[14]。为此，亟待建立能够有效分离和测定醋酸巴多昔芬有关物质、含量测定的HPLC方法为主的评价手段，以控制原料药中工艺杂质、降解杂质、基因毒杂质及残留溶剂等。三、高效液相技术在药品检验中的应用高效液相色谱技术（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）是以液体为主要流动相，通过高压输液系统，将隔离缓冲液和混合溶剂泵入色谱柱，使其能够完成样品检测的方式[15]。由高压输液泵、色谱柱、进样器、检测器和馏分收集器组成，发展初期主要被应用于化学行业各组分的分离中[16]。目前，该种检测技术已在多领域得到使用，如化学、工业和生化、医学、农业与商检、法检等，是检测化学、环境化学和生物化学中必不可少的技术手段。高效液相色谱仪是在愈来愈要求严格的药品检验行业中，有关物质的检测也越来越严格，随着高效液相技术的发展，高效液相色谱仪的特点也变得突出[17]，其中高分辨率、分析速度快等优点，用于药品检验中对样品的重复测定，且样品检测量相对极少。有关物质是指药品在生产制备过程中的起始物料、聚合体、中间体、副反应产物，以及药物在储存和运输过程中所产生的降解产物和杂质等。其中，大部分为有机杂质，也包括在制备过程中的残留溶剂等。有些物质可能会导致药物不稳定、疗效降低，有的甚至会危害到患者的健康。目前，我国药品质量标准中对药物有关物质的要求越来越高，为保证所生产的药物安全有效，尤其是在仿制药的研究过程中，对药物的制备、储存过程中的各环节进行有关物质检测是至关重要的。目前为止，在制药行业中检测有关物质最多的、最有效的方法就是高效液相色谱法。高效液相色谱技术是根据物质不同组分在流动相和固定相中分配系数的不同进而对不同组分进行分离分析的一种分离检测技术。在仿制药开发中若国内外药典及文献报道中没有列出药物的有关物质检测方法和含量测定方法，就需要我们根据药物的合成工艺、主要成分和杂质的结构、理化性质及杂质标准[18]等进行自主开发，此过程花费时间长、工作量大。因此，此次课题就需要我对所开发的方法进行比较，选择合适的方法进行优化，并完成方法学验证，得到合适的有关物质方法。四、本文研究思路本论文拟以醋酸巴多昔芬的有关杂质为研究对象，旨在建立醋酸巴多昔芬质量评价的方法，并寻求更加简洁、绿色、质量稳定及成本可控的工艺方法。为此，本文将开展以下的研究工作：通过对色谱条件进行优化，建立能够有效分离和测定醋酸巴多昔芬有关物质，有效测定醋酸巴多昔芬的HPLC方法。通过分析成品合成工艺路线可能产生的工艺杂质及降解杂质，并通过考察有关物质方法的专属性、耐用性、检测限、定量限、重复性和线性，来建立测定醋酸巴多昔芬有关物质的HPLC方法，为醋酸巴多昔芬质量控制提供稳定可靠的测定方法。

醋酸巴多昔芬有关物质测定方法开发目前，国内外对化学原料药的质量控制以HPLC高效液相色谱法及GC气相色谱法为主要评价手段，以控制原料药中工艺杂质、降解杂质、基因毒杂质及残留溶剂等，从而为生产质量安全、可控的原料提供质控依据。巴多昔芬(bazedoxifene)是新一代选择性雌激素受体调节剂（SERM），主要适应证为预防和治疗绝经期后骨质疏松症。醋酸巴多昔芬的化学名为1-[4-（2-氮杂环庚烷-1-基-乙氧基-苄基）]-2-（4-羟基-苯基）-3-甲基-1H-吲哚-5-酚醋酸盐。醋酸巴多昔芬片由惠氏制药公司（2009年10月16日辉瑞公司正式完成对惠氏公司的收购）研发并投入市场。目前，国内外测定醋酸巴多昔芬有关物质的药物分析方法的文献较少，且研究种类与合成工艺路线有关，而多数文献中巴多昔芬主峰与相邻杂质的分离度较小。为此，亟待建立能够有效分离和测定醋酸巴多昔芬有关物质的HPLC方法。1.仪器和材料1.1仪器Agilent1200型高效液相色谱仪（配置G1312B二元梯度泵，G1329A自动进样仪，G1316A柱温箱，G1315B二极管阵列检测器；美国）；Agilent1100型高效液相色谱仪（配置G1312A二元梯度泵，G1329A自动进样仪，G1316A柱温箱，G1314A紫外检测器；美国）；Waters2695-2996（配置Waters2695分离单位，Waters2996二极管阵列检测器；美国）；电子天平（CPA225D型，max=220g，d=0.1mg或max=100g，d=0.01mg；赛多利斯科学仪器有限公司。NBL-214e型，max=210g，d=0.1mg;Nimbus艾德姆衡器有限公司）；酸度计（FE28 METTLERTOLEDO）；数控超声波清洗器超声仪（KQ-500DE昆山市超声仪器有限公司）；循环水式多用真空泵（SHB-III，郑州长城科工贸有限公司）；强光稳定性试验箱（Lohorue-150TPS北京兰贝石恒温科技有限公司）；循环水式多用真空泵（SHB-III，郑州长城科工贸有限公司）；数显恒温水浴锅（HH-4，巩义市予华仪器有限公司）；电子天平（型号：YP30002，厂家：上海越平科学仪器有限公司，max=220g，d=0.1mg）。1.2试剂及药品醋酸巴多昔芬（批号：YGB-008-11）购于AOCS公司，纯度均大于98%。巴多昔芬异构体（批号：2490-021A3）、巴多昔芬三醇杂质（杂质3）（批号：2044-032A3）、巴多昔芬醛类杂质（杂质6）（批号：2044-032A3）、5-O-Benzylbazedoxifene（杂质4）（批号：2065-035A2）、巴多昔芬酮酰胺杂质（杂质5）（批号：2123-047A4），均购于TLC公司，纯度均大于98%。BXF-H4（4'-苯甲氧基-2-溴苯丙酮）、BXF-H5（4-苄氧基苯胺盐酸盐），均购于天津西恩思奥普德科技有限公司，纯度均大于98%。BXF-H3（3-甲基-5-苄氧基-2-(4-苄氧基苯基)-1H-吲哚）、BXF-H6（1-(2-(4-(氯甲基)苯氧基)乙基)氮杂环庚烷盐酸盐），均购于，纯度均大于98%。醋酸巴多昔芬、BXF-ZZ4(巴多昔芬氮氧化物)、BXF-ZZ1（2-(4-羟基苯基)-3-甲基-6-羟基-1H-吲哚）、BXF-H1（巴多昔芬，未成盐）、BXF-H2（1-[4-(2-(氮杂环庚烷-1-基)乙氧基)苄基]-5-(苄氧基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-3-甲基-1H-吲哚）、BXF-H7（1-[4-(2-(氮杂环庚烷-1-基)乙氧基)苄基]-5-(苄氧基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-3-甲基-1H-吲哚），均为实验室自制，纯度均大于98%。杂质及对照品信息表详见表1-1。乙腈为色谱纯（Mreda公司）；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸均为分析纯（天津福晨化学试剂有限公司）；超纯水由Filed超纯水器（Filed-P型，菲尔德北京科学仪器有限公司）制备。2.方法考察2.1色谱条件色谱柱为WatersXbridgeC18(4.6×250mm,5μm)。流动相为0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲盐溶液（用磷酸调节至pH为3.0）（A）-（B）乙腈，采用梯度洗脱程序：时间(min)/B%:0.01/10,10/10,40/60,43/60,55/90,64/100,65/10,70/10。流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量10μl；检测波长220nm。2.2对照品溶液的制备分别配制BXF-H2、BXF-H3、BXF-H4、BXF-H5、BXF-H6约1mg/ml的单一对照溶液；配制醋酸巴多昔芬约0.5mg/ml的单一对照溶液；配制巴多昔芬异构体、巴多昔芬三醇杂质、巴多昔芬醛类杂质、5-O-Benzylbazedoxifene、巴多昔芬酮酰胺杂质、巴多昔芬氮氧化物、BXF-ZZ1（2-(4-羟基苯基)-3-甲基-6-羟基-1H-吲哚）、BXF-H7约0.1mg/ml的单一对照溶液。精密量取醋酸巴多昔芬、BXF-ZZ1（2-(4-羟基苯基)-3-甲基-6-羟基-1H-吲哚）、BXF-H7、巴多昔芬酮酰胺杂质、巴多昔芬异构体、巴多昔芬氮氧化物各200μl，BXF-H2、BXF-H4、BXF-H5、BXF-H6各50μl，BXF-H3、巴多昔芬三醇杂质、巴多昔芬醛类杂质、5-O-Benzylbazedoxifene各100μl，于进样小瓶中混合，即得混合对照品溶液。2.3供试品溶液的制备2.3.1500µg/ml溶液：精密称取10mg，置于20mL容量瓶中，加乙腈-水（50:50）适量，超声5min，放冷，再加乙腈-水（50:50）稀释至刻度，摇匀，经0.22μm微孔膜过滤，即得供试品溶液（500µg/ml）。2.3.21000µg/ml溶液：精密称定BXF-1902200125.05mg置于25ml容量瓶，加50%乙腈溶液溶解，在超声波清洗仪中超声3min，放冷，再加50%乙腈溶液稀释至刻度线，摇匀，经微孔膜过滤，既得。2.3.35µg/ml溶液：精密量取1ml“2.3.2”中500µg/ml的溶液于100ml容量瓶中，加50%乙腈溶液稀释至刻度线，摇匀，既得。2.3.40.25µg/ml、0.1µg/ml、0.05µg/ml溶液：精密量取1ml“2.3.3”中5µg/ml溶液分别于20ml、50ml、100ml容量瓶中，加入50%乙腈稀释至刻度，摇匀，既得。2.3.510µg/ml溶液：精密量取1ml“2.3.3”中1000µg/ml溶液于100ml容量瓶中，加入50%乙腈稀释至刻度线，摇匀，既得。2.3.60.5µg/ml、0.2µg/ml、0.1µg/ml溶液：精密量取1ml“2.3.5”中10µg/ml的溶液于20ml、50ml、100ml容量瓶，加入50%乙腈稀释至刻度，摇匀，既得。2.4方法学的考察通过对色谱条件进行优化，建立能够有效分离和测定醋酸巴多昔芬有关物质的HPLC方法，通过分析成品合成工艺路线可能产生的工艺杂质及降解杂质，考察专属性、耐用性、检测限、定量限、重复性，来建立测定醋酸巴多昔芬有关物质的HPLC方法，为醋酸巴多昔芬质量控制提供稳定可靠的测定方法。2.4.1专属性考察为验证本试验方法对降解产物的专属性，对醋酸巴多昔芬分别进行酸、碱、高温、光照、氧化、水破坏实验，考察降解产物与主成分及已知杂质的分离情况，用来验证拟定的有关物质测定方法的可行性。破坏前供试品精密称取10mg醋酸巴多昔芬样品，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件下测定，色谱图及数据见图1-4、表1-3。a酸破坏试验精密称定NaOH4.01528g，用超纯水溶解至100ml即得到1mol/LNaOH溶液；精密量取9ml盐酸，用超纯水溶解至100ml得1mol/LHCL溶液。精密称取BXF样品10.21mg，至20ml容量瓶，用50%乙腈溶解，在超声波仪器超声3min，取出，放冷，用50%乙腈定容至刻度线，加入1mlHCL溶液，摇匀，放置两小时，之后加入1mlNaOH溶液，将得到的溶液按“2.1”项下色谱条件测定，色谱图及数据见图1-5、表1-4。b碱破坏试验分别精密量取BXF样品10.43mg至20ml容量瓶，用50%乙腈溶解，在超声波仪器超声3min，取出，放冷，用50%乙腈定容至刻度线，加入1ml“a”中NaOH溶液，摇匀，放置30min。之后加入1ml“a”中HCL溶液，得到的溶液按“2.1”项下色谱条件测定，色谱图及数据见图1-6、表1-4。c氧化破坏实验精密称取10.49mgBXF样品至20ml容量瓶中，用50%乙腈溶解，在超声波仪器超声3min，取出，放冷，用50%乙腈定容至刻度线，加入30%过氧化氢溶液1ml，摇匀，放置约2h，得到的溶液按“2.1”项下色谱条件测定，色谱图及数据见图1-7、表1-4。d光照破坏实验精密称取9.35mgBXF样品至20ml无色容量瓶中，用50%乙腈溶解，在超声波仪器超声3min，取出，放冷，置5000±50.0Lx光照下照射约5h，用50%乙腈定容至刻度线，得到的溶液按“2.1”项下色谱条件测定，色谱图及数据见图1-8、表1-4。e高温破坏实验精密称定10.26mgBXF样品至20ml容量瓶中，用50%乙腈溶解，在超声波仪器超声3min，取出，放冷，用50%乙腈定容至刻度线，用100℃水浴加热约5h，取出，放冷，用50%乙腈定容至刻度线，得到的溶液按“2.1”项下色谱条件测定，色谱图及数据见图1-9、表1-4。f水破坏实验精密称定10.64mgBXF样品至20ml容量瓶中，用50%乙腈溶解，在超声波仪器超声3min，取出，放冷，用50%乙腈定容至刻度线，加入1ml超纯水，放置约5h，得到的溶液按“2.1”项下色谱条件测定，色谱图及数据见图1-10、表1-4。空白溶液：50%乙腈溶液，按“2.1”下的色谱条件测定，色谱图见图1-3、。对照品溶液：“2.2”项下14种混合溶液，按“2.1”下的色谱条件测定，色谱图及数据见图1-2、表1-2。2.4.2耐用性考察不同柱温考察分别称取醋酸巴多昔芬及其有关杂质，按照“2.2”项下方法制备混合对照品溶液，除色谱柱温分别调节至25、30、35℃进行考察，其余同“2.1”项下色谱条件，记录并分析所得到的混合对照品溶液的HPLC色谱图。不同流速考察分别称取醋酸巴多昔芬及其有关杂质，按照“2.2”项下方法制备混合对照品溶液，除流速分别调节至0.8、1.0、1.2ml/min进行考察，其余同“2.1”项下色谱条件，记录并分析所得到的混合对照品溶液的HPLC色谱图。2.4.3重复性考察为验证本试验方法对有关物质测定的精密度，为同一实验员操作，故测定的结果为重复性，以此用来验证拟定的有关物质测定方法的可行性。重复性试验空白溶液乙腈：直接取用HPLC级别。供试品溶液：精密称定醋酸巴多昔芬供试品共六份，分别为10.30mg，10.11mg，10.36mg，9.63mg，9.99mg，10.24mg，照“2.3”项配制出供试品溶液。对照品溶液：系统适应性溶液：取“2.2”项下BXF、BXF-H2、BXF-H3、BXF-H4、BXF-H5、BXF-H6各200µl，混合。13种混合溶液：取“2.2”项下混合溶液。按“2.1”项下色谱条件进样。2.4.3检测限、定量限考察通过考察检测限和定量限，得出有关物质被检出的最低浓度。检测限、定量限试验取“2.3”项下所制备的0.05µg/ml，0.10µg/ml，0.2µg/ml，0.25µg/ml，0.5µg/ml，5µg/ml，10µg/ml，500µg/m，1000µg/ml，按上述的色谱条件分别注入高效液相色谱仪中，记录色谱图。2.5样品的HPLC有关杂质测定精密称取10mg醋酸巴多昔芬样品，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液；分别称取醋酸巴多昔芬及其有关杂质，按照“2.2”项下方法制备混合对照品溶液，在“2.1”项下色谱条件下，记录并分析所得到的醋酸巴多昔芬样品及混合对照品溶液的HPLC色谱图（详见图1-1,1-2,1-3）。根据醋酸巴多昔芬合成工艺路线图（详见图1-1）及可能产生的降解杂质，分析其有关杂质（详见表1-1）。 表1-SEQ表1-\*ARABIC1醋酸巴多昔芬成品杂质汇总表序号杂质名称结构式来源分类1醋酸巴多昔芬BazedoxifeneAcetate-100mg（纯度：99.57%）CAS：198481-33-3分子式: C30H34N2O3.C2H4O2；分子量: 530.65原料主成分2巴多昔芬异构体BazedoxifeneImpurity2-25mg（纯度：99.3%）TLCNo:B-487工艺杂质巴多昔芬异构体,取代时重排的产物3巴多昔芬三醇杂质BazedoxifeneTriolImpurity,BazedoxifeneImpurity3-25mg（纯度：99.3%）CAS：104599-10-2TLCNo:B-489工艺杂质工艺杂质，醚键断裂或未取代（原研杂质，裂解产物，WAY-144179）4BazedoxifeneImpurity6-25mg（纯度：99.7%）TLCNo:B-4812降解杂质降解杂质，苄位甲基氧化（原研杂质，WAY-395588醛类）续表1-1序号杂质名称结构式来源分类55-O-Benzylbazedoxifene,BazedoxifeneImpurity4-25mg（纯度：99.4%）CAS号: 328933-58-0,TLCNo:B-4810工艺杂质工艺杂质，苄基只脱除1个6BazedoxifeneImpurity5-25mg（纯度：98.9%）TLCNo:B-4811降解杂质降解杂质，苯并吡咯双键开环，（原研杂质，WAY-192640酮酰胺）7巴多昔芬氮氧化物Bazedoxifene-N-OxideCAS号:1174289-22-5分子式: C30H34N2O4；分子量: 486.62降解杂质降解杂质，N-氧化物，（原研杂质，WAY-160546N-氧化物）82-(4-羟基苯基)-3-甲基-6-羟基-1H-吲哚，CAS:91444-54-1分子式: C15H13NO2；分子量: 239.27工艺杂质BXF-H3(PM1)脱苄基产物续表1-1序号杂质名称结构式来源分类94-苄氧基苯胺盐酸盐,CAS:51388-20-6SM1SM1104'-苯甲氧基-2-溴苯丙酮,CAS:35081-45-9SM2SM2111-(2-(4-(氯甲基)苯氧基)乙基)氮杂环庚烷盐酸盐,CAS:223251-25-0SM3SM3123-甲基-5-苄氧基-2-(4-苄氧基苯基)-1H-吲哚,CAS:198479-63-9PM1PM1131-[4-(2-(氮杂环庚烷-1-基)乙氧基)苄基]-5-(苄氧基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-3-甲基-1H-吲哚,CAS:198480-21-6PM2PM2续表1-1序号杂质名称结构式来源分类14巴多昔芬（未成盐），CAS:198481-32-2PM3PM3151-(4-(苄氧基)苯基)-2-((4-苄氧基)苯基氨基丙烷-1-酮工艺杂质PM1反应中间态图1-SEQ图1-\*ARABIC1醋酸巴多昔芬合成工艺路线图3.结果与讨论3.1专属性考察3.1.1图1-2醋酸巴多昔芬14种混合溶液的色谱图1.BXF-H62.巴多昔芬酮酰胺杂质3.巴多昔芬异构体4.BXF-H55.巴多昔芬醛类杂质6.BXF-ZZ1（2-(4-羟基苯基)-3-甲基-6-羟基-1H-吲哚）7.巴多昔芬8.巴多昔芬氮氧化物9.巴多昔芬三醇杂质10.5-O-Benzylbazedoxifene11.BXF-H213.BXF-H714.BXF-H3表1-SEQ表1-\*ARABIC2对照14种混合溶液序号名称保留时间理论塔板数分离度1BXF-H63.2927520/2杂质5酮酰胺11.0825393145.503BXF-H1异构体12.056702184.024BXF-H512.871504024.905杂质6醛类13.903509264.696BXF-ZZ119.5184739018.577BXF25.3802692512.058BXF-ZZ4氮氧化物31.110283428.50续表1-2序号名称保留时间理论塔板数分离度9杂质3裂解产物35.941162112011.2911BXF-H241.26878541724.28121314BXF-H4BXF-H7BXF-H343.17748.92358.4877775273621021853617.0222.0622.03图1-SEQ图1-\*ARABIC250%乙腈溶液的色谱图图1-SEQ图1-\*ARABIC3未被破坏的醋酸巴多昔芬供试品的色谱图图1-SEQ图1-\*ARABIC4酸破坏醋酸巴多昔芬的色谱图图1-SEQ图1-\*ARABIC5碱破坏醋酸巴多昔芬的色谱图图1-SEQ图1-\*ARABIC6氧化破坏醋酸巴多昔芬的色谱图图1-SEQ图1-\*ARABIC7光照破坏的醋酸巴多昔芬的色谱图图1-SEQ图1-\*ARABIC8高温破坏的醋酸巴多昔芬的色谱图图1-SEQ图1-\*ARABIC9水破坏的醋酸巴多昔芬的色谱图表1-SEQ表1-\*ARABIC3未被破坏醋酸巴多昔芬供试品样品名称归属杂质保留时间相对保留时间峰面积峰面积%未破坏供试品BXF-H513.1100.5157.9130.05BXF25.450100015680.54299.52杂质3裂解产物35.9461.41223.8950.15表1-SEQ表1-\*ARABIC4破坏试验数据汇总样品名称归属杂质保留时间相对保留时间峰面积峰面积%酸降解BXF-H513.0580.5178.7730.05BXF25.2461.00016619.01299.48杂质3裂解产物35.9471.42421.8710.13碱降解BXF-H512.9820.5207.7260.05杂质6醛类13.8230.55324.6380.16BXF24.9781.00015128.70896.95杂质3裂解产物35.6871.42989.9280.58氧化降解BXF-H512.2260.48996.2190.56BXF24.9821.00016112.72793.34杂质3裂解产物35.6821.42864.6030.37续表1-SEQ表1-\*ARABIC5样品名称归属杂质保留时间相对保留时间峰面积峰面积%光降解BXF-H512.9160.5189.6220.06BXF24.9141.00015327.75999.58高温降解BXF-H512.8720.52010.5100.06BXF24.7521.00016585.94499.59杂质3裂解产物35.1481.42010.7930.06水降解BXF-H512.8720.52211.1870.06BXF24.6731.00017286.89799.60杂质3裂解产物35.1451.42412.6180.07表1-SEQ表1-\*ARABIC6专属性试验汇总专属性样品质量（mg）降解后总峰面积降解前总峰面积物料平衡/回收率(%)未降解9.70/15756.145/酸降解10.1916677.801/100.40碱降解10.9015605.110/88.15光降解9.3115392.659/101.15氧化降解10.5217262.338/101.12高温降解10.3116653.962/99.68水降解10.6117355.899/100.18对醋酸巴多昔芬供试品分别进行降解试验的结果表明：醋酸巴多昔芬在酸、光、水、高温降解条件下基本稳定，无明显降解产物，在碱降解条件下，约降解9.592%，主要降解产物为杂质6醛类杂质、杂质3裂解产物，物料平衡/回收率（%）为88.20%，超出限度（90%-110%）；醋酸巴多昔芬在氧化降解条件下，约降解6.18%，主要降解产物为BXF-H5、杂质3裂解产物。3.2耐用性考察3.2.1色谱柱温的选择图1-SEQ图1-\*ARABIC10醋酸巴多昔芬14种混合溶液的色谱图图1-SEQ图1-\*ARABIC11醋酸巴多昔芬柱温为25℃的色谱图图1-SEQ图1-\*ARABIC12醋酸巴多昔芬柱温为35℃的色谱图分别考察了柱温25、30、35℃的分离效果。结果表明，柱温25、30℃时，14种化合物的分离度良好，而35℃时降解杂质杂质6与BXF-H5(SM1)分离度较差，故选择色谱柱温25-30℃。3.2.2不同流速考察图1-SEQ图1-\*ARABIC13醋酸巴多昔芬流速为0.8ml/min的色谱图图1-SEQ图1-\*ARABIC14醋酸巴多昔芬流速为1.2ml/min的色谱图分别考察了流速为0.8、1.0、1.2ml/min的分离效果。结果表明，1.0、1.2ml/min时，14种混合物的分离度良好，而0.8ml/min时巴多昔芬醛类杂质与BXF-H5分离度较差，故选择流速1.0-1.2ml/min。3.3重复性考察表1-SEQ表1-\*ARABIC7重复性考察中供试品数据名称称样量/mgA主峰A总峰A杂质1tR=3.278minA杂质2tR=3.278minA其他单杂供试品110.301815312218180361244814736/供试品210.111743444617468991098811465/供试品310.3617845371178701431292511847/供试品49.6316812088168352531035912806/供试品59.991705549517075812861911698/供试品610.241748609617507206922111889/表1-SEQ表1-\*ARABIC8重复性考察对照品数据名称A对照杂质1/%杂质2/%其他单杂/%总杂/%杂质检出个数对照114351970.0090.010/0.0192对照214161770.0080.008/0.0162对照314136720.0090.008/0.0182对照414156560.0070.009/0.0162对照513249170.0070.009/0.0152对照617449060.0050007/0.0122平均/0.0070.009/0.016/RSD%/19.013.3/14.4/BXF的有关重复性试验结果表明：杂质1和杂质2的含量%均小于0.05%（忽略限度），故杂质峰面积RSD%的小于20%即可，实验结果表明该方法重复性良好。3.4检测限、定量限考察表1-SEQ表1-\*ARABIC9检测限、定量限结果浓度保留时间拖尾因子理论塔板数s/n500µg/ml23.6283.4276529039.615µg/ml24.2881.0140762302.910.25µg/ml-124.1841.003921813.940.25µg/ml-223.9980.983815314.690.1µg/ml-123.8691.02434927.650.1µg/ml-223.8420.93432738.040.05µg/ml-123.8101.04465913.300.05µg/ml-223.7200.95390033.65续表1-SEQ表1-\*ARABIC10浓度保留时间拖尾因子理论塔板数s/n1000µg/ml22.3734.4742038543.4710µg/ml23.5641.0441012644.300.5µg/ml-123.5280.954186653.820.5µg/ml-223.3591.014166044.820.2µg/ml-123.4221.014187913.680.2µg/ml-223.3540.974413716.350.1µg/ml-123.3011.01432918.450.1µg/ml-223.4301.02411406.32对不同浓度的醋酸巴多昔芬进行检测的结果表明：供试品浓度为0.5mg/ml时，其忽略限0.05%溶液两针的s/n分别为13.94，13.69（均大于10），即定量限小于忽略限浓度，满足《化学药物杂质研究的技术指导原则》；供试品溶液浓度为1.0mg/ml时，其忽略限0.05%溶液2针s/n均大于10，即定量限小于忽略限浓度，满足《化学药物杂质研究的技术指导原则》；定量限（s/n）大于等于10，对应的BXF溶液浓度为0.25µg/ml（供试品浓度0.5mg/ml的0.05%，供试品浓度1.0mg/ml的0.025%）；检测限（s/n）大于等于3.3，对应的BXF溶液浓度为0.05µg/ml（供试品浓度0.5mg/ml的0.01%,供试品浓度1.0mg/ml的0.005%）3.5HPLC方法的建立及样品测定3.5.1HPLC方法的建立通过对色谱条件pH、色谱柱、柱温、流速的考察，选择“1.2.1”项下色谱条件为最终的醋酸巴多昔芬样品的HPLC有关杂质检测方法。3.5.2样品的HPLC有关杂质测定分别测定了醋酸巴多昔芬样品及14种混合对照品溶液的HPLC色谱图见图1-3及图1-2，根据醋酸巴多昔芬合成工艺路线图（详见图1-1）及可能产生的降解杂质，对样品HPLC有关杂质进行控制。其测定结果详见图1-2。4.结论通过分析成品合成工艺路线可能产生的工艺杂质及降解杂质，并通过对专属性、耐用性、重复性、检测限、定量限进行考察，结果表明该方法的专属性、耐用性、重复性、检测限、定量限良好，此方法，可以作为一种稳定可靠的醋酸巴多昔芬有关物质分离和测定的方法。PAGE24PAGE全文主要研究工作总结醋酸巴多昔芬主要用于绝经后的妇女骨质疏松症的治疗，为巴多昔芬的醋酸盐。本论文针对国内外大多文献对醋酸巴多昔芬API质量评级体系不完善的现状展开了研究：建立了测定醋酸巴多昔芬有关物质的HPLC方法。为此对全文的研究工作进行总结，主要有：通过优化色谱条件，建立了分离及测定醋酸巴多昔芬有关物质的HPLC方法。考察了此方法的专属性、耐用性、检测限、定量限，结果表明该方法的专属性、耐用性、精密度、灵敏度良好，可用于醋酸巴多昔芬有关物质的测定，适用于醋酸巴多昔芬原料药的质量控制。参考文献[1]陶红慧.骨质疏松研究近状[J].世界临床药物,2008,29(4):229-234.[2]MuhammadA,MadaSB,MalamiI,etal.Postmenopausalosteoporosisandbreastcancer:Thebiochemicallinksandbeneficialeffectsoffunctionalfoods.BiomedPharmacother,2018(107):571-582.[3