大理苍山杜鹃根际微生物的研究

.前言苍山又名“点苍山”,共有十九座山峰，最高峰海拔可达4000多米，是云岭山脉南端的主峰,由于是低纬度亚热带地区的高山，海拔高低悬殊,气候垂直分异明显，种属密度较大,孕育了丰富的植物种群和多样的植被类型,有较多珍稀濒危植物种类[1]。苍山分布的22种珍稀濒危植物中，特有种7种，杜鹃属植物就占了5种,其中3种是模式标本[1]。本实验中蓝果杜鹃（Rhododendroncyanocarpum）、棕背杜鹃（Rhododendronfictolacteum）、苍山杜鹃（Rhododendrondimitrium）和似血杜鹃（Rhododendronhaematodes）为珍稀濒危种，其中蓝果杜鹃、苍山杜鹃和似血杜鹃为苍山特有种[2]。根际微生物是地球上最复杂、类群最多的微生物群落之一，它是指存在于植物根系表面及其附近土壤中的微生物[3]。根际微生物的生命活动在“植物—土壤—微生物”之间的复杂关系中发挥了重要作用[4]。近年来，利用植物根际微生物来提高植物抗逆性的研究已经取得了一定的进展。目前已经有大量的有益菌种被筛选出来用于商业化生产，在提高作物抗逆性方面起到了重要的作用[3]。根际微生物的存在可提高杜鹃花幼苗移栽成活率，并能促进杜鹃花生长及养分的吸收[5,6]。21世纪以来，对生物多样性的保护、自然资源的合理利用以及生态环境恶化的减缓和控制已成为一项不可忽视的任务,特别是对珍稀濒危物种资源的保护越来越受到人们的重视，自从大理州苍山被批准为“国家级自然保护区”后，苍山的珍稀濒危植物资源就得到了初步的保护，这不仅为珍稀濒危植物资源的繁殖提供了环境条件、更为其保护及合理开发利用提供了理论依据[1]。国内目前对杜鹃花的引种驯化研究已经有显著成果，但对于大理苍山地区的杜鹃研究还大多数局限在资源调查方面，关于大理苍山杜鹃根际微生物的研究还未有相关报道。本研究拟从对蓝果杜鹃、苍山杜鹃、似血杜鹃和棕背杜鹃根际微生物进行初步研究，采集苍山4种珍稀濒危杜鹃根部土壤，选用6种培养基，采用平板稀释涂布法分离获得其根际微生物，纯化后进行传统形态观察、再结合生理生化反应、DNA测序结果对其进行初步鉴定，得出部分数据。研究结果可为大理州苍山珍稀濒危杜鹃的保护与引种驯化提供新的理论依据。2.材料与方法2.1实验材料2.1.1苍山4种珍稀濒危杜鹃蓝果杜鹃（Rhododendroncyanocarpum）：生长在海拔3000-4000米的云杉或冷杉林下的常绿灌木或小乔木，喜凉爽湿润的气候，生长在PH值为5.5-6.5之间的酸性土壤[7]。苍山杜鹃（Rhododendrondimitrium）：生于海拔3000米针阔叶混交林中，属灌木，是大理苍山的东坡地带的特有种。似血杜鹃（Rhododendronhaematodes）：产于高山灌丛中或山顶及溪谷中的常绿小灌木，生境海拔3200-4000米；年平均温约7℃，极端最高温约25℃，土壤为暗棕壤——漂灰土。棕背杜鹃（Rhododendronfictolacteum）：生于海拔3250-4300米的高山岩坡灌丛中或针叶林下的常绿灌木，喜凉爽湿润的气候。土壤要求富含腐殖质、疏松、湿润及PH在5.5-6.5之间。2.1.2土样于2019年6月、7月、8月三个月份从苍山洱海国家级自然保护区3000m—4000m的地区采集4种珍稀濒危杜鹃根际2-4mm的土壤，并将土壤装入密封袋中封存，做好标记，4℃冰箱保存，尽早做分离实验。2.1.3培养基培养基配方见附录。2.1.4试剂及仪器设备所用试剂、仪器设备见附录。2.2方法2.2.1根际微生物的初步分离培养分别准确称取蓝果杜鹃、苍山杜鹃、似血杜鹃以及棕背杜鹃根际土壤样品各1g，然后分别加入到100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，摇床培养3d（温度28℃，转速150r/min），作为种子液，取1mL富集溶液加入9mL无菌水中，稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6六个稀释梯度，采用稀释涂布平板法对微生物进行分离培养，分别取1mL稀释液至6种固体培养基上，每个梯度重复三次，标记，放置于28℃恒温恒湿培养箱中培养。1-4d内连续对培养基进行观察，当培养基内没有出现新菌株的长出时，终止培养，放入4℃冰箱暂存。2.2.2根际微生物的纯化在自然状态下将各培养基上出现的菌落形态及其在显微镜下（细菌菌落需进行染色）对其孢子形态、菌丝体进行观察，对具有形态差异的菌株进行纯化，采用平板划线法分别接到对应的固体培养基上，放置于28℃恒温恒湿培养箱中培养24~48小时，相同条件反复进行3次纯化，舍弃培养基内的相同菌株，然后接种至牛肉膏蛋白胨斜面内，4℃冰箱暂存。2.2.3细菌的革兰氏染色[8]2.2.4细菌的生理生化实验[8]2.2.5真菌显微及菌落形态用接种针在培养基上挑取少许目的菌株的菌苔（包含基内菌丝）放于载玻片上的无菌水中，进行制片，在高倍镜下对菌株的产胞结构进行观察拍照。2.2.6杜鹃根际微生物DNA的提取将纯化后的目的菌株：细菌接到牛肉膏蛋白胨液体培养基内28℃，150r/min摇床中培养过夜，取1mL培养液加入1.5mL的离心管中；真菌用无菌手术刀刮取纯培养中的菌丝放于1.5mL的EP管中，均参照各自试剂盒说明书的步骤提取目的菌株DNA，并对其进行相应编号，对提取的DAN进行跑胶。将提取的DNA放入﹣20℃冰箱里保存。细菌DNA测序所采用的扩增引物为1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）和引物为27F（5’-AGAGTTTGATCCTGCTCAG-3’）；真菌测序所采用的扩增引物为ITS1F（5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3'）和ITS4（5’CTTGGTCATTTAGACGAAGTAA3'），将提取的DNA送至生工测序。3.实验结果3.1土样采集结果2019年6月、7月、8月采集了4种杜鹃根际土样，具体情况见表1，部分杜鹃种类图片如图1所示。表1四种杜鹃土样采集结果杜鹃根际土样种类土样采集时间及份数7月（份）8月（份）9月（份）蓝果杜鹃根际土样345苍山杜鹃根际土样364似血杜鹃根际土样344棕背杜鹃根际土样356总计121919注：四种杜鹃生长海拔3000m~4000m图1杜鹃花图片3.2根际微生物初步分离纯化结果通过对4种珍稀濒危杜鹃的根际微生物进行初步分离、统计结果（见表2），共计得到162株菌株。表2初筛分离菌株数培养基类型杜鹃种类及分离结果（株）蓝果杜鹃苍山杜鹃似血杜鹃棕背杜鹃牛肉膏蛋白胨25141015马丁氏培养基33高氏一号培养基51448依姆歇涅次培养基17蛋白胨培养基15硅酸盐培养基2总计97281423对初筛菌株纯化后，复筛得到40株菌株，结合传统形态观察，其中有26株细菌（见表3），14株真菌（见表4），复筛获得的部分菌落、菌苔形态特征如图2、图3所示。图2细菌菌落及菌苔形态注：a-b:牛肉膏蛋白胨培养基;c-d:高氏培养基;e-f:蛋白胨培养基;g-i:马丁氏培养基;j-k:依姆歇涅培养基;l:硅酸盐培养基.表3细菌分离纯化菌株情况表培养基种类细菌种类及编号蓝果杜鹃苍山杜鹃似血杜鹃棕背杜鹃牛肉膏蛋白胨培养基Ng1、Ng2、Ng3、Ng4、Ng5、Ng6Ns1、Ns3、Nx2、Nx3Nb1、Nb2、Nb3、Nb4马丁氏培养基Mg1、Mg3、Mg4高氏一号培养基Gg1、Gg3、Gg4Gs2-Gb3、Gb4依姆歇涅茨培养基Yg1蛋白胨培养基Dg1硅酸盐培养基G图3真菌菌落及菌苔形态注：A-E:马丁培养基;F:蛋白胨培养基;G-I:依姆歇涅培养基.表4真菌分离纯化菌株情况表培养基类型真菌种类及编号蓝果杜鹃苍山杜鹃似血杜鹃棕背杜鹃牛肉膏蛋白胨培养基马丁氏培养基MG1、MG2、MG3、MG4、MG5、MG6、MG7、MG8、MG9高氏一号培养基依姆歇涅茨培养基YG1、YG2、YG3、YG4蛋白胨培养基DG1硅酸盐培养基3.3纯化后细菌的形态学观察结果通过对复筛的26株细菌的菌落形态特征，如含水状态、透明度、菌落颜色、菌落边缘整齐度等进行观察，结果见表5。表5纯化后细菌的平板形态学观察结果序号编号含水状态菌落透明程度菌落颜色菌落正反面颜色菌落边缘1Ng1很湿不透明乳白色相同不整齐2Ng2很湿不透明乳白色相同整齐3Ng3较湿不透明乳白色相同不整齐4Ng4湿不透明乳白色相同不整齐5Ng5较湿不透明乳白色相同整齐6Ng6较湿稍透明淡红色相同不整齐7Ns1较湿不透明乳白色相同整齐8Ns3湿不透明乳白色相同不整齐9Nx2很湿不透明乳白色相同整齐10Nx3很湿不透明乳白色相同整齐11Nb1湿不透明乳白色相同不整齐12Nb2较湿不透明乳白色相同不整齐13Nb3湿不透明乳白色相同不整齐14Nb4很湿不透明乳白色相同整齐15Mg1较湿不透明乳白色相同不整齐16Mg3湿不透明乳白色相同整齐17Mg4很湿不透明黄色相同整齐18Gg1很湿不透明乳白色相同整齐19Gg3湿不透明乳白色相同整齐20Gg4较湿不透明乳白色相同整齐21Gs2湿不透明浅黄色相同不整齐22Gb3很湿不透明乳白色相同整齐23Gb4较湿不透明浅黄色相同不整齐24Yg1很湿不透明乳白色不同整齐25Dg1很湿不透明乳白色不同不整齐26G很湿透明无色相同整齐注：N:牛肉膏蛋白胨培养基;M:马丁培养基;G:高氏一号培养基;Y:依姆歇涅茨培养基;D:蛋白胨培养基;G:硅酸盐培养基;G(g):蓝果杜鹃;s:苍山杜鹃;x:似血杜鹃;b:棕背杜鹃.3.4细菌的革兰氏染色结果对26株细菌进行革兰氏染色结果显示见表6，典型的革兰氏染色阴、阳性结果如图4、图5所示。表6革兰氏染色结果序号菌株编号菌体形态革兰氏染色结果1Ng1圆形G﹣2Ng2棒状G＋3Ng3杆形G﹣4Ng4杆形G﹣5Ng5杆形G﹣6Ng6短棒状G﹣7Ns1圆形G＋8Ns3杆形G＋9Nx2杆形G﹣10Nx3椭圆形G﹣11Nb1杆形G＋12Nb2杆形G＋13Nb3杆形G＋14Nb4杆形G﹣15Mg1杆形G﹣16Mg3椭圆形G﹣17Mg4短棒状G﹣18Gg1杆形G﹣19Gg3椭圆形G﹣20Gg4棒状G﹣21Gs2杆形G﹣22Gb3棒状G﹣23Gb4椭圆形G﹣24Yg1球形G＋25Dg1椭圆形G＋26G椭圆形G﹣注：N:牛肉膏蛋白胨培养基;M:马丁培养基;G:高氏一号培养基;Y:依姆歇涅茨培养基;D:蛋白胨培养基;G:硅酸盐培养基;G(g):蓝果杜鹃;s:苍山杜鹃;x:似血杜鹃;b:棕背杜鹃;“G＋”表示革兰氏阳性；“G﹣”表示革兰氏阴性菌.图4革兰氏阴性菌显微图(100×)图5革兰氏阳性菌显微(100×)3.5纯化后真菌的显微及菌落形态结果对分离纯化出的14株真菌进行PDA纯培养、产胞结构及分生孢子显微结构结果记录，如图6所示。图6真菌的PDA纯培养、产胞结构及分生孢子显微结构图注：A-N:PDA纯培养;a-n:产胞结构;1-14:分生孢子.3.6细菌的生理生化结果对26株细菌生理生化特性进行鉴定，结果见表8。表8细菌生理生化鉴定菌株编号V-P甲基红吲哚葡萄糖发酵乳糖发酵蔗糖发酵Ng1+-++⊕+eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)Ng2+-++eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)Ng3+-++eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)Ng4+-++eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)Ng5+-++eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)Ng6+-++eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)Ns1+-++eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)Ns3+--+eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)Nx2+-++eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)Nx3+-++eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)Nb1+-++eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)Nb2+-++eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)Nb3+-++eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)Nb4+-++eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)Mg1+-++eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)Mg3+-++eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)Mg4+--+eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)Gg1+-++eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)Gg3+-++eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)Gg4+-++eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)Gs2+--+eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)-eq\o\ac(○,-)Gb3+-++⊕-eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)Gb4+-++eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)Yg1+--+eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)Dg1+-++eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)+eq\o\ac(○,-)G+-++⊕+eq\o\ac(○,-)+⊕注:（1）V-P反应，呈红色为阳性，用“+”表示;不呈红色者为阴性，用“-”表示（2）甲基红试验，红色，为阳性反应，用“+”表示；橘黄或黄色，为阴性反应，用“-”表示（3）吲哚试验，乙醚层呈现玫瑰红色，为阳性反应，否则阴性反应，阳性用“+”表示，阴性用“-”表示（4）糖发酵试验，与对照管比较，接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，用“-”表示；培养液呈黄色，结果为阳性反应，用“+”表示；培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，用“⊕”表示；杜氏小管内没有气泡为阴性反应，用“eq\o\ac(○,-)”表示。实验结果显示细菌对蛋白胨和几种糖类作为碳源的利用情况各不相同。26株菌株均能利用葡萄糖产生乙酰甲基甲醇，占测试菌株的100％；吲哚试验中除Ns3、Mg4、Gs2、Yg1不能利用蛋白胨产生色氨酸酶外，其余菌株均能利用蛋白胨产生色氨酸，占测试菌株的84.6％；糖发酵试验中Ng1、Nx2、Nx3、Nb2、Nb3、Gb4、Yg1、Dg1、G这9株菌均能利用葡萄糖、乳糖和蔗糖产酸，占测试菌株的34.6％；Ng1、Gb3、G这3株菌能利用葡萄糖既产酸又产气，占测试菌株的11.5％。3.7菌株分子生物学鉴定结果3.7.1细菌DNA提取结果对复筛的26株细菌菌株进行DNA的提取，结果全部提取到。DNA提取检验部分结果如图7所示。图7细菌DNA抽提检验结果3.7.2真菌DNA提取结果对14种真菌菌株进行DNA提取，14株真菌中提取到DNA的有10株。真菌DNA提取检验结果如图8所示。图8真菌DNA抽提检验结果3.8测序结果3.8.1细菌DNA的测序结果将提取的26株细菌的DNA进行16srDNA双向测序。其中21株细菌获得序列，对其在NCBI核酸序列数据库用BLAST进行序列比对，测序出的21株细菌分别属于4个属。用MEGA7.1软件对21株细菌序列构建系统发育树，结果如图9所示。图921株细菌的系统发育树3.8.2真菌DNA的测序结果14株真菌测序10株，4株未提取到DNA,测序10株真菌均属于青霉属，推测青霉属在蓝果杜鹃根部土壤内属于优势属。4、分析与讨论苍山具有优越的自然环境和特殊的地理位置,因而孕育了丰富的植物种群和多样的植被类型。在苍山植被中，杜鹃占据着极为重要的地理位置,组成了高山杜鹃灌丛带，构成了常绿阔叶林带的优势种[2]。根际微生物是指紧密附着于根际土壤颗粒中的微生物，细菌是根际微生物中数量最多的类群[9]。根际微生物对土壤稳定性、养分、结构和植被生态恢复有着举足轻重的作用，目前对根际微生物的研究主要集中在微生物群落结构和多样性以及微生物功能两个方面[10,11]。土壤微生物区系分布具有明显的季节变化，春季的真菌与放线菌数量均达到最大值，而细菌数量则在夏季达到最大值[12]。本实验中微生物数量顺序为细菌>真菌>放线菌，可能采样多集中于夏季，故而细菌数量相比其他微生物要多。本实验中未筛选到放线菌，可能与①放线菌适宜生活在PH呈中性或微碱性且含水量低的土壤中,而杜鹃花适合在pH呈酸性的土壤中生长，且实验采集回来的5种杜鹃花土样PH值为5.5～6.0，可能不适合放线菌的生长，所以本实验未分离到放线菌[13,14]。②苍山地处低纬高原，属亚热带高原季风气候，11~4月为干季，5~10月为雨季[15]。可能采样时处于连续降雨的季节，土壤中放线菌的数量可能由于地表含水量的增多而减少。从苍山杜鹃、似血杜鹃和棕背杜鹃中未筛选到真菌，其原因可能是：①苍山杜鹃种类的垂直分布和替代现象明显，反映了植被带垂直更替的规律性[2]。一般土壤的真菌种类和数量随着海拔高度的升高而降低[16]。本实验采集的四种杜鹃中，蓝果杜鹃相比其他三种杜鹃分布最广。推测蓝果杜鹃适应性比其他三种杜鹃要强，可能选取的六种培养基适合蓝果杜鹃自然生存条件，所以本实验筛选到蓝果杜鹃的根际微生物比其他三种杜鹃要多。下一步可能要对土壤的理化因子进行探究。②土壤含水量对真菌多样性和种类有一定影响，土壤含水量过高或过低，真菌数量均明显下降[17]。采样时由于处于连续降雨的季节，土壤中真菌的数量可能由于地表含水量的增多而减少。测序出的21株细菌分别属于4个属，其中