大麻分子标记研究进展及其应用

大麻分子标记研究进展及其应用摘要：大麻是大麻科大麻属一至二年生草本植物，种植历史悠久，经济价值高。为有效利用大麻种质资源，满足我国大麻产业高速发展以及法医科学的需求，对大麻遗传多样性的研究，选育更多具有优良性状大麻品种、提高大麻品种鉴定能力是非常重要的。大麻分子标记分布广泛，直接决定大麻DNA水平上的遗传多态性，已成为大麻育种及遗传多样性等研究的重要工具。本文综述了近年来大麻分子标记相关研究，如SCAR、SSR等大麻分子标记的开发以及筛选的研究进展，分析对比每种分子标记的优缺点，并综述它们在大麻种质资源分析，标记辅助育种，遗传多样性研究等方面的应用。关键词：大麻；分子标记；种质资源；遗传多样性AdvancesinCannabicmoleculemarkersanditsapplicationAbstract:CannabissativaL.isanannualtobiennialherbofthecannabisoftheCannabinancewithlonghistoryofplantingandhigheconomicvalue.InordertoeffectivelyusethecannabisgermplasmresourcesandmeettheneedsoftherapiddevelopmentofthecannabisindustryinChinaandforensicscience,itisveryimportanttostudythegeneticdiversityofcannabis,tobreedmorecannabisvarietieswithexcellenttraits,andtoimprovetheabilityofcannabisvarietyidentification.CannabismolecularmarkersarewidelydistributedanddirectlyreflectgeneticpolymorphismsattheDNAlevel,andhavebecomeanimportanttoolforresearchincannabisbreedingandgeneticdiversity.Thearticlereviewsthecharacteristicsandtheresearchprogressofcannabismolecularmarkers,includingSCAR、SSRmolecularmarkers,etal.Theadvantagesanddisadvantagesofeachmolecularmarkerwereanalyzedandcompared,andtheirapplicationsinhempgermplasmresourceanalysis,marker-assistedbreedingandgeneticdiversityresearchwerereviewed.Keywords:CannabissativaL.;Molecularmarkers;Geneticdiversity;Germplasmresource1前言大麻（CannabissativaL.）为大麻科大麻属一年至两年生的草本植物，大部分为雌雄异株，广泛应用于医药和工业领域。根据四氢大麻酚（Tetrahydrocannabinol，THC）的所含比例ADDINNE.Ref.{F79F2A2F-04FF-4B04-98A9-4C3E60E65393}[1]，大麻可以被分为工业大麻和毒品大麻。大麻主要分布于亚洲中部，中国的西南及西北，欧洲的波兰、匈牙利等地ADDINNE.Ref.{83353F11-5AB0-42CC-B046-F0EAA540E718}[2]。我国大麻栽培历史悠久ADDINNE.Ref.{274C37A2-7299-4317-BA95-7094438E83EE}[3]，几千年来大麻被广泛用于油料，造纸，医药，纺织等方面。目前，中国的大麻种子和大麻纤维出口量居世界第一，我国大麻产业的发展是至关重要的。大麻分子标记在基因组上广泛分布并且数量丰富，不受组织类型，发育时期等因素和外界环境条件的影响。因其能够能客观、准确地检测大麻基因组水平上的遗传差异，分子标记已经成为如今分析大麻遗传多样性和差异性的最常用的手段。此外分子标记技术能够评价和描述不同大麻品种之间的亲缘关系，以此达到大麻种质资源鉴定的目的。分子标记还是大麻遗传图谱的构建和大麻品种纯度鉴定的重要工具。分子生物学的高速发展促使各种大麻分子标记被不断开发出来，这显著促进了大麻分子标记辅助育种技术成熟和广泛应用，极大提高了选育出优良大麻品种的效率，弥补了传统育种技术许多不足，如可预测性差，周期时间长，选择效率低。本文就近些年来大麻分子标记的开发筛选，以及用于大麻研究的主要几种分子标记的特点及应用进行综述。2大麻分子标记开发及筛选分子标记(Molecularmarkers)是指能在DNA水平上直接体现生物个体或是群体之间存在一定差异的特异性核苷酸片段。由于基因组上的各个部分，包括内含子和外显子区域，核基因组或细胞器基因组等，都可以成为分子标记的来源，因此分子标记的数量远比其他遗传标记更多。在早期研究ADDINNE.Ref.{E30520E6-0EDE-4537-B6D6-43D676B41049}[4]中细胞器基因组作为分子标记的一个重要来源，叶绿体DNA的一段位于tRNA基因trnL和trnF之间的低核苷酸多态性的基因间短保守序列被开发为分子标记用于鉴别不同的大麻品种。近年来类似的研究ADDINNE.Ref.{7B9AB6F9-DB85-4687-AEEA-7B3FB18C1AD4}[5]依旧活跃，一段687bp的序列从同样的基因间序列区域被鉴定出来开发为分子标记用于区分大麻科中的不同大麻品种。大麻叶绿体基因组及线粒体基因组在2016年被完整测序ADDINNE.Ref.{7A3191C7-A0DF-4111-968D-B4C7454BE354}[6,7]，这为未来更广泛地利用大麻细胞器基因组开发分子标记开辟了道路。在核基因组水平上，仅有的标记研究NE.Cms_InsertADDINNE.Ref.{3E1F7166-43E5-4F11-B6D3-F656D204B53E}[8]只集中在核糖体基因中的内部转录间隔区（ITSII），采用PCR技术扩增限制性片段长度多态性（RFLP）来作为分子标记用于鉴别大麻与其他物种。然而这些研究主要集中搜寻高度保守的大麻特异性序列而不是变异序列，主要用于法庭科学鉴定而不是用于育种的分子标记开发。在高通量测序时代到来之前，大麻基因组研究及遗传图谱绘制主要依赖于多基因作标记，例如RAPD和AFLP分子标记,但这些分子标记受环境条件影响较大，具有不稳定性且重复性较差。由于不同大麻品种的基因组存在巨大的变异性，使用这些分子标记去鉴定不同大麻品种受到极大的限制，因此一些像SSR和ISSR等多位点分子标记被开发用于大麻种群之间的遗传关系，研究大麻遗传的变异程度以及选择对于基因结构的影响，然而传统的大麻分子标记开发方式有着较长的开发周期，必须消耗大量的人力和物力，这导致分子标记的数量无法满足研究的需要，极大限制了大麻遗传多样性研究以及分子标记辅助育种技术的发展。随着高通量测序技术进步和成熟，在2011年首个大麻完整基因组及转录组序列数据ADDINNE.Ref.{23519163-82B3-42F8-A2F2-DA09FB1F24A8}[9]的发表为大规模分子标记的开发以及从全基因组的角度去研究大麻遗传的多样性开辟了道路。在基因组学时代，获得大量可公开的基因组DNA序列数据以及来自不同生物群类的表达序列标签（EST）成为可能。Ellis等ADDINNE.Ref.{3D056A13-03E8-49D6-8458-7154E79DDE39}[10]利用生物信息学工具分析收集得到的EST揭示，在所有不同大麻品种中这些序列是多态性SSR分子标记的一个重要来源。信朋飞等ADDINNE.Ref.{BB549B8F-295A-43B6-88D7-3C4255802070}[11]基于大麻转录组数据大规模开发EST-SSR分子标记，从3,624个EST中鉴定出4,577个SSR位点，一共3,442对互补引物被设计为EST-SSR分子标记。随机选择117个EST-SSR子标记在24个大麻品种中检测引物质量，多态率为74.36%。IncoronataGalasso等ADDINNE.Ref.{A937AFC4-C948-4E56-9882-1122BCAE234D}[12]利用生物信息分析工具MISA程序分析发现大麻基因组总共有407,491个SSR位点，大麻转录组中15,665个SSR位点。与传统方法，如SSR基因座必须从部分消化的小片段插入的DNA基因文库中分离出来相比，通过全基因组序列数据开发SSR分子标记节省及降低了大量的时间和成本。随着公共数据库中大麻基因组测序数据的不断地积累，大量的单核苷酸多态性(SNP)分子标记被开发出来。Sawler等ADDINNE.Ref.{CD4C9428-BED9-4E84-A1F1-3EB257F8F259}[13]基于大麻基因组测序数据开发出了14,031个SPN分子标记用于比较124个大麻样本。高通量测序技术以及生物信息学分析技术的发展极大提高了大麻分子标记开发的效率，降低了开发成本，推动了新型分子标记的开发，为大麻遗传性研究和分子标记辅助育种技术提供了更多的分子标记。不同分子标记方法的特点比较见表1。表1不同分子标记方法的特点比较Table1Thecharacteristicsofdifferentmolecularmarkermethod特点分子标记方法AFLPRAPDSACRSSRISSRSNP遗传特性显性/共显性显性共显性共显性显性显性/共显性多态性水平高中等高中等中等低可检测点数50-2001-1010-5010-1002-201检测基础专一PCR随机PCR专一PCR专一PCR专一PCR专一PCR检测基因组部位整个基因组整个基因组整个基因组重复序列区整个基因组整个基因组使用技术难度中等低低低低低DNA质量要求高低低低低低DNA用量100ng<50ng<50ng50ng<50ng<50ng费用高低中等高低高探针专一性引物随机引物专一性引物专一性引物锚定引物专一性引物遗传多样性检测一般普遍少少普遍少3大麻分子标记特点及应用3.1AFLP分子标记AFLP(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism)，即扩增片段长度多态性。AFLP分子标记技术是早年由Vos等ADDINNE.Ref.{8299CF71-77F9-4F60-8CF0-B08D50FAC82F}[14]研发的一种PCR标记技术。该技术使用两种限制性内切酶消化基因组DNA，然后将人工接头连接到DNA片段上，使得酶切片段相边接，作为PCR扩增的模板。然后在连接子互补链的两端添加1-4个经同位素标记的选择性核苷酸，并以其为引物进行选择性扩增，得到100-140个扩增片段，经电泳分离检测，获得长度不一的条带，根据条带的长度分析其多态性，进而显示基因组DNA的多态性。该方法所需DNA较少、有较高重复性和可靠性，但是必须使用同位素标记引物，所以操作难度和成本都较高，扩增时有一定假阳性和假阴性现象出现，无法对杂合子进行分析。AFLP分子标记技术在大麻雌雄异株的性别研究方面有着广泛应用。Flachowsky等[48]使用了两种雌雄异体的大麻进行了与性别相关的AFLP分子标记筛选，并使用了39种随机引物组合进行PCR扩增，其中20个随机引物组合可扩增出了1至3个雄性相关特异性条带。而后用其中8个引物组合检测了这两个大麻品种杂交产生的80个子一代大麻植株，在雄性后代中可扩增出多态性片段，但在雌性后代中未扩增出多态性片段，这间接表明大量的雄性连锁特异性标记与大麻雄性植株的完全共分离，大麻中存在雄性染色体也被间接证明了。吕佳淑等ADDINNE.Ref.{547BAAE5-CD69-40EF-9662-716E4C95E808}[15]利用AFLP分子标记技术，筛选65对引物对10个大麻品种进行检测，最终获得了一条大小为348bp的雄性连锁的特异性条带。此外郭丽等ADDINNE.Ref.{D2D683D0-D356-4DF8-9AA6-7B8D87B01974}[16]以11个雌雄异株大麻品种的基因组DNA为PCR扩增模版，用65对选择性引物筛选获得一条可用于大麻早期田间性别鉴定的736dp的雄性连锁特异性条带，这些条带可作为分子标记用于大麻早期性别鉴定的参考。Anne-MichelleADDINNE.Ref.{A477F959-5C2A-4F0D-AE40-2D1291079E6E}[17]等分析大麻X和Y染色体上的AFLP标记，来分析性染色体的结构，经染色体重组分析发现一个伪常染色体区域，揭示了雌雄同株的X染色体与雌雄异株的X及Y染色体的同源性。在大麻遗传多样性分析方面AFLP分子标记技术亦有广泛的应用。郭佳等ADDINNE.Ref.{C673194E-E91F-4695-81B5-3B8632C0A33D}[18]收集了11个地区的大麻品种作为实验材料进行大麻遗传多样性研究，从55对AFLP分子标记筛选出6对多态性较好的引物组合进行大麻遗传多样性分析，每对AFLP引物组合成功扩增出46～75条带，一共获得98条多态性条带和9条品种特异性条带，结果表明AFLP分子标记在大麻品种鉴定能力较强，证明了利用AFLP分子标记分析大麻遗传多样性是可行。胡尊红等ADDINNE.Ref.{66E89D96-638A-4C39-A0B1-653392F5758F}[19]利用AFLP分子标记以及生物信息学工具对12个来源不同的大麻品种进行遗传多样性分析。结果揭示了大麻的分布存在地域差异性特点，中国云南地区的大麻品种的遗传多样性水平最高。3.2RAPD分子标记RAPD(RandomamplifiedpolymorphismofDNA)，即随机扩增片段长度多态性，是一种基于PCR扩增技术的可以对整个未知序列基因组进行多态性分析的DNA分子标记技术。该技术以样品基因组DNA为PCR扩增模版，采用随机单引物进行随机扩增，经电泳检测后得出的扩增条带，根据不同条带的长度的多态性进一步反映基因组DNA的多态性。RAPD分子标记技术操作简易、所需DNA量较少、不必设计特异引物并且不存在种属限制ADDINNE.Ref.{C08B5E93-CCA6-4553-951C-E4B3111AC6BA}[20]，但是该技术受实验条件的影响较大，导致该技术的重复性及稳定性较差，这一定程度限制了RAPD分子标记的广泛应用。在早期研究中Vidya等ADDINNE.Ref.{ACB8BD83-3DFA-4CF1-A148-93EEBB437FE0}[21]利用RAPD分子标记技术分析了来自澳大利亚的51个大麻品种和2个麻蛇草品种的多态性。根据这些大麻品种间的遗传亲缘关系，可将51个大麻品种分为四个群类，此外结果还表明大麻品种和蛇麻草品种基因组DNA存在巨大差异。进一步说明，在基因组水平上，大麻与同科不同属的植物之间差异较大，并且不同地区的大麻品种的遗传背景存在较大差异。陈其军等ADDINNE.Ref.{7081DFA8-712E-404B-9F36-DB9FB414E56D}[22]利用RAPD分子标记技术研究严格雌雄异株大麻‘云麻一号’得到一条大约2.5kb的雄性连锁特异性片段，对这条片段进行克隆以及测序后转化为SCAR分子标记。宋书娟等ADDINNE.Ref.{201C7369-C07D-41E8-A33F-B76E2AF5BDCE}[23]提取5株雌性大麻和5株雄性大麻的基因组DNA作为PCR扩增模版，使17条随机引物进行随机扩增，最终获得到一条820bp的雌性连锁特异性条带，该条带可用于大麻的性别鉴定。苏友波等ADDINNE.Ref.{C3128E1F-895C-4F0A-9EF0-AF117BC26FA3}[24]以一种野生型大麻和一种栽培型大麻的基因组DNA为PCR扩增模版，从280个随机引物中筛选得到了42条能够更好地扩增出多态性条带的引物，该研究为未来利用RAPD分子标记技术分析大麻多样性提供了更多高多态性的引物。汤志成ADDINNE.Ref.{F662CB8A-5BFB-4EDA-856B-B26CBD9B009E}[25]建立了大麻RAPD标记的优化体系，选取12个中国野生大麻品种和4个栽培型大麻为实验材料，利用14条RAPD引物共扩增出106个条带，其中79条为多态性条带，多态率为74.52%，而后基于RAPD的聚类分析，将这些大麻品种分为3给类群，分布呈地域性特点。3.3SCAR分子SCAR（Sequencecharacterizedamplifiedregions）即序列特异性扩增区，SCAR分子标记是由PARD和AFLP等分子标记发展而来。该技术通过将筛选得到的特异性标记片段回收并克隆后对片段两端的序列进行测序，根据测序数据在原引物的末端增加多个碱基，设计为更长的PCR双引物，因此SCAR分子标记的引物更长且与模板DNA完全互补，所以具有更高的特异性，对PCR反应条件要求更高，能够减少引物结合位点之间的相互竞争，增加了SCAR标记的专一性及退火温度，获得更加可靠的可重复条带。SCAR标记的重复性高，操作快速简便，成本低廉，为共显性标记，能有效区分纯合子和杂合子ADDINNE.Ref.{9AB10A54-A6C3-4FB4-A7CB-550A468F422D}[26]。该分子标记技术适用于大量样品的快速检测分析ADDINNE.Ref.{08F8E824-2D4E-4826-97A8-C008F7CE0C84}[27,28]，已经成为能够直接应用于大麻分子标记辅助育种以及大麻基因作图和基因定位研究的首选分子标记。大麻中的大麻四氢酚（THC）等化学物质的含量在雌株上远高于雄株ADDINNE.Ref.{F39598AD-EBCE-4432-ADB7-482F1F3B8F3F}[29]，为了在大麻植株早期性别鉴定中筛选出雌株，近年来大麻SCAR分子标记广泛应用于大麻性别鉴定的研究。李仕金等ADDINNE.Ref.{E04E0003-DB1D-4764-9B3F-DD53A5F7C28D}[30]以‘云麻一号’大麻的基因组DNA为模板，从随机选取的200个RAPD引物中筛选出能在大麻雌株和雄株之间出现差别的RAPD引物，经PCR扩增得到一条长度约429dp的与大麻雄性连锁的条带，该条带稳定性高并且最为明显，克隆后根据测序结果合成的2条SCAR分子标记，并用该标记准确地鉴别了9个大麻品种花期已知性别和花期未知性别的大麻植株。姜颍等ADDINNE.Ref.{D2967C57-D7F3-41D1-9E56-817EFD770C6A}[31]选用工业大麻‘火麻一号’为研究对象，从42个RAPD引物中筛选出了一条与雄性相关的特异性条带，经6个工业大麻品种的检验，以测序数据为基础合成的两条SCAR分子标记引物，利用它们能够准确鉴定花期已知性别和花期未知性别的工业大麻雌株和雄株。SCAR分子标记能够提供的信息位点比PARD分子标记更多，因此可以成为对大麻早期性别鉴定的稳定可靠的工具。但是经PARD标记回收、克隆和测序等步骤开发的SCAR分子标记周期长，需要耗费大量人力物力，SCAR分子标记还存在对PCR反应条件过于敏感的缺点，这很大程度上限制了SCAR分子标记的应用范围。3.4SSR分子标记SSR(Simplesequencerepeats)，即简单重复序列，又称微卫星DNA，由Moore等ADDINNE.Ref.{729FB0D3-E56D-4FAF-9518-1ED8ECC70987}[32]于1991年提出，是指基因组中由1至6个核苷酸组成的基本单位经多次串联重复组成的一段长度为100dp以下DNA序列，相同类型的微卫星DNA随机分布在真核生物和原核生物基因组的不相同的位置上。SSR位点的重复次数不同或是重复程度的不完全性，使得每个SSR分子标记具有高度多态性，SSR位点两端多为相对保守的单拷贝序列。SSR分子标记开发的方法主要有构建文库筛选法ADDINNE.Ref.{EE8DC2FA-4BB9-412A-B298-84490392FA0A}[33]，富集技术筛选法ADDINNE.Ref.{D59C76C6-2FB9-4B63-9D73-F1FC85E46FB0}[34]，PCR技术筛选法，筛选数据库法。以PCR扩增技术为基础的SSR分子标记技术以其操作简易，节约检验样本和试剂，重复性高等优势,逐渐成为目前大麻遗传多态性，亲缘关系研究以及构建DNA指纹图谱和遗传图谱的重要工具。但是SSR分子标记的两端的引物存在一定的物种特异性，需要利用引物设计软件设计引物，使得分子标记的开发费时耗力，这在一定程度上限制了该标记在早年的应用。基因组学时代，通过生物信息学工具分析大麻基因组测序数据开发SSR分子标记的方法效率更高，成本更低，进一步推动了SSR分子标记的广泛应用。CS1基因座是第一个被发表的大麻SSR位点。Hsieh等ADDINNE.Ref.{26C84B09-3B0F-46B2-A92E-48E08C62C604}[35]用该基因座对108份大麻样品进行研究，发现该SSR位点具有高度多态性，重复单位个数为4到41之间且杂合度较高，可用于大麻种属鉴定及不同大麻品种间遗传关系的分析。Shirley等ADDINNE.Ref.{8617DF86-5AFF-44E6-B041-0DA627536049}[36]以CS1位点为基础，构建了一个大麻种子的公共数据库用于鉴定不明来源的大麻种子。张庆滢等ADDINNE.Ref.{47B41FC3-3D81-4E5D-99D8-CB8DA2BE95AF}[37]从45对大麻EST-SSR引物中优选出能够鉴别野生型及栽培型大麻品种的19对引物，并将其用于30个大麻品种的，具有高度鉴定能力的DNA指纹图谱的构建，还通过SSR聚类分析了所有大麻品种的遗传亲缘关系和遗传分布，表明具有工业用途的中国大麻来源广泛，遗传多样性高。信朋飞等ADDINNE.Ref.{F57CAAF8-ECDC-4277-BC3E-FC4B0ECE3940}[38]利用生物信息学工具分析公共数据库的大麻转录组数据，搜寻到了4,577个SSR位点，共开发了3,442个SSR分子标记，并从中优选出45个最具代表性的SSR分子标记用于研究115份大麻样品的遗传多样性，将这些大麻品种明显划分为四个组群，然后分析不同组群的遗传距离及组群内的遗传关系，研究表明生长在不同区域的大麻在种质资源方面存在较大差异，该研究为大麻种质资源的研究和利用提供了更加有效的新方法。3.5ISSR分子标记ISSR(Inter-simplesequencerepeat)即锚定简单重复序列，由Zietkiewicz等ADDINNE.Ref.{6F5522FE-C72C-4835-91D4-489CD4E872CC}[39]人首次提出，是基因组DNA中2个相邻SSR位点之间的一段单拷贝序列。该技术将经过锚定的SSR序列设计为引物，然后通过PCR反应扩增加锚的SSR位点间隔距离较小的DNA序列，经电泳检测获得ISSR分标记。此外，SSR序列和锚定碱基是随机选择的，无需SSR序列的测序数据。与其他分子标记相比ISSR分子标记的引物更长，在PCR反应中退火温度和专一性更高，因此在实验中的重复性更强，具有不必提前获得基因组测序数据，DNA用量少和引物设计简易的优势。然而ISSR分子标记需要耗费一定时间去找到最佳的PCR扩增反应条件，此外该分子标记是显性分子标记，不能有效辨别纯合子和杂合子。Mareshige等ADDINNE.Ref.{B5845F5C-3F4E-4AA3-82B1-DA46FF9B5ACA}[40]采用ISSR分子标记构建ISSR指纹图谱，并成功鉴别高效液相色谱(HPLC)法所难以区分的性状差异较大的大麻品种，为大麻品种的鉴定提供了新方法。李娜等ADDINNE.Ref.{D936A7FD-C544-4BDD-A08A-E9AD4A5A4933}[41]采用ISSR分子标记技术研究了来自中国云南和内蒙两地的毒品大麻品种的遗传多样性，研究结果表面两地毒品大麻是具有高度多态性的，所获得的多态性性条带对于在法庭科学中鉴别毒品大麻样品的发源地及种属分类具有一定的价值。Zhang等ADDINNE.Ref.{CCCDD76C-796A-4F17-A375-B936C46C65DF}[42]使用ISSR分子标记和染色体标记分析了中国27个大麻品种的遗传多样性，成功揭示了27个大麻品种之间的遗传关系，根据大麻品种之间的遗传距离将它们分为了4个群类。3.6SNP分子标记SNP(Singlenucleotidepolymorphism)即单核苷酸多态性，由LanderE等ADDINNE.Ref.{B8801460-1454-4CAF-AFAC-C02DED47CB56}[43]于1996年提出，是由在基因组水平的上同一核苷酸位置上发生的突变所产生的DNA序列多态性。SNP分子标记具有较好的遗传稳定性，在基因组上的数量丰富且分布广泛密度高，突变富有代表性以及可以高通量自动化分析，等位基因频率易于分析。开发SNP分子标记的方法主要有探针技术，分子信标法，Taqman技术ADDINNE.Ref.{EA81B479-0106-430F-8BDC-57A80AB1FFDB}[44]，直接测序法等。由于高通量测序的成熟与普及，直接测序法以其快速，准确等优点逐渐成为SNP分子标记开发的主要方法。Rotherham等ADDINNE.Ref.{9417C2DD-24BD-4898-ACB2-46E31E6EFF86}[45]为开发一种鉴别毒品大麻和工业大麻方法，利用SNP分子标记技术对94个大麻样本和10个非大麻植物样本进行检验，所获得的4个SNP标记与四氢大麻酚酸合成基因连锁，该等位基因在毒品大麻是纯合的，而在工业大麻上是杂合的，并成功利用该标记鉴别了94个大麻样品中的毒品大麻和工业大麻。陈璇等ADDINNE.Ref.{F9C47471-0894-4E54-AB4F-78A321C66ADA}[46]采用高通量测序技术对一株野生型大麻和一株栽培型大麻进行全基因组的重测序，将获得的重测序数据与公共数据库中的参考基因组数据进行比对，共2,264,150个SNP位点被检测到，对SNP位点进行分型统计后，分析两个品种之间的SNP位点差异，发现栽培型大麻的杂合度略低于野生型大麻，间接表明栽培型大麻的驯化程度不高。Joson等ADDINNE.Ref.{1908280E-A6F3-4359-8DE0-53BDBA0B82BA}[47]利用14,031个SNP分子标记分析了81种毒品大麻和43个工业大麻样品，研究结果表明毒品大麻和工业大麻在基因组水平上存在显著差异，而且不仅仅体现在四氢大麻酚（THC）合成基因之间的差异，体现了SNP分子标记在大麻遗传结构分析方面具有独特优势。4展望SCAR、SNP、ISSR等新型分子标记的开发及应用，为大麻育种和法医科学等领域的研究提供了新的思路和更多更好的方法。每一种分子标记的优点和缺点都各不相同，在未来的研究中使用多种分子记技术的结合能够有效提高实验结果的准确率和可靠性以及大麻种质资源鉴定的效率。基于基因组DNA中的单核苷酸多态性（SNP）和插入和缺失（InDel）位点开发的第三代分子标记和靶基因共分离，与生物的表型性状有着紧密的关系，受遗传背景影响较小，能够成为分子标记辅助育种技术可利用的十分理想的分子标记，因此大麻SNP及InDel分子标记的开发和研究将会成为未来的热点和重点。大麻分子标记技术随着生物信息学和高通量基因组测序技术迅猛发展，大麻核基因组和细胞器基因组以及转录组测序数据不断累积，提高了特定性状相关的标记的可用性，大规模开发大麻各类分子标记打下了坚实基础。进一步寻找与开发大麻重要经济性状关系密切的分子标记，构建新的遗传连锁图谱，对重要性状基因的精准定位，以及整合大麻分子标记研究数据建立公共数据平台，将为大麻分子辅助选择育种提供参考，大幅度提高育种效率，满足大麻产业高速发展的需要。ADDINNE.Bib参考文献赵越，孙宇峰，韩承伟，等.分子标记技术在工业大麻性别分化研究中的应用进展[J].作物杂志,2019,3:20-23.宋宪友.雌雄同株大麻资源的引进与评价利用研究[J].中国麻业科学，2011,33(06):277-280.BoniniSA,PremoliM,TambaroS,etal.Cannabissativa:Acomprehensiveethnopharmacologicalreviewofamedicinalplantwithalonghistory[J].JournalofEthnopharmacology,2018,227:300-315.WilkinsonMLA.ThedetectionandpersistenceofCannabissativaDNAonskin[J].SciJustice,2000,40(1):11–14.DiasVHG,RibeiroASD,MelloICT,etal.GeneticidentificationofCannabissativausingchloroplasttrnL-Fgene[J].ForensicScienceInternational:Genetics,2015,14:201-202.WhiteKH,VergaraD,KeepersKG,etal.ThecompletemitochondrialgenomeforCannabissativa[J].MitochondrialDNAPartB,2016,1(1):715-716.OhH,SeoB,LeeS,etal.TwocompletechloroplastgenomesequencesofCannabissativavarieties[J].MitochondrialDNAADNAMappSeqAnal,2016,27(4):2835-2837.GSiniscalcoGigliano.IdentificationofCannabissativaL.(Cannabaceae)usingrestrictionprofilesoftheInternalTranscribedSpacerII(ITS2)[J].SciJustice,1998,4(38):225-230.HarmVan,BakelJMSA,JonathanEPage.ThedraftgenomeandtranscriptomeofCannabissativa[J].GenomeBiology,2011,12(10):1-18.EllisJR,BurkeJM.EST-SSRsasaresourceforpopulationgeneticanalyses[J].Heredity,2007,99(2):125-132.GaoC,XinP,ChengC,etal.DiversityanalysisinCannabissativabasedonlarge-scaledevelopmentofexpressedsequencetag-derivedsimplesequencerepeatmarkers[J],PLoSOne,2014,9(10):e110638.GalassoI,PonzoniE.InSilicoExplorationofCannabissativaL.GenomeforSimpleSequenceRepeats(SSRs)[J].AmericanJournalofPlantSciences,2015,06(19):3244-3250.SawlerJ,StoutJM,GardnerKM,etal.TheGeneticStructureofMarijuanaandHemp[J].PLOSONE，2015,10(8):e133292.VosP,ReneCornelisJosephusHogers,MarjoBleeker,etal.AFLP:anewtechniqueforDNAfingerprinting[J].Nucleicacidsresearch,1995,23(21):4407-4414.吕佳淑，赵立宁，臧巩固，等.大麻性别相关AFLP分子标记筛选[J].湖南农业大学学报(自然科学版),2010,36(02):123-127.郭丽，张海军，王明泽，等.大麻雄性基因连锁AFLP分子标记的筛选及鉴定[J].中国麻业科学,2015,37(01):5-8.AnnemichelleFaux,AliceBerhin,etal.Sexchromosomesandquantitativesexexpressioninmonoecioushemp(CannabissativaL)[J].Euphytica,2014,192(2):183-197.郭佳，裴黎，彭建雄，等.应用AFLP检测大麻遗传多样性[J].法医学杂志,2008,24(05):330-332.胡尊红，郭鸿彦，胡学礼，等.大麻品种遗传多样性的AFLP分析[J].植物遗传资源学报,2012,13(04):555-561.LavertyKU,StoutJM,SullivanMJ,etal.AphysicalandgeneticmapofCannabissativaidentifiesextensiverearrangementsattheTHC/CBDacidsynthaseloci[J].Genomeresearch,2019,29(1):146-156.VidyaJ.etal.RAPDanalysisdistinguishesCannabissativasamplesfromdifferentsources[J].ForensicScienceInternational,1996,79(2):113-121.陈其军，韩玉珍，傅永福，等.大麻性别的RAPD和SCAR分子标记[J].植物生理学报,2001,27(02):173-178.宋书娟，刘卉，邵宏.大麻性别连锁的特异DNA标记的初步研究[J].中国药物依赖性杂志,2002,10(03):182-184.苏友波，朱颖，林春，杨明.大麻RAPD分子标记的引物筛选[J].中国麻业,2002,24(5):4-5.汤志成.野生大麻种质资源遗传多样性分析[D].云南农业大学,2013.张贵芹，裴黎，马原，等.大麻的DNA分析检验技术[J].中国法医学杂志.2007，04:255-257.LiM,YangH,LiF,etal.Amale-specificSCARmarkerinCalamussimplicifolius,adioeciousrattanspeciesendemictoChina[J].MolecularBreeding.2010,25(3):549-551.孙保娟，李植良，黎振兴，等.SCAR标记转化失败的原因和对策[J].分子植物育种,2010,8(03):589-594.陈璇，杨明，郭鸿彦.大麻植物中大麻素成分研究进展[J].植物学报,2011,46(02):197-205.李仕金，辛培尧，郭鸿彦，等.大麻雄性相关RAPD和SCAR标记的研究[J].广东农业科学,2012,39(24):151-154.姜颖，冯乃杰，王晓楠，等.工业大麻雄性相关RAPD和SCAR标记的筛选与鉴定[J].作物杂志,2019,03:66-72.李雪林，梁华，张泽民，等.分子标记技术在植物遗传育种中的应用进展[J].河南科技大学学报(农学版),2004,24(2):69-72.AkkayaMS,BhagwatAA,Cr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