高能X射线FLASH照射临床前研究专家共识

旨在建立一套标准化的X-FLASH临床前研究体系，涵盖辐射剂量学、2014年，Favaudon团队在《ScienceTranslational研发团队搭建和验证的全球首台高能X射线FL规放疗(0.03~0.1Gy/s)相比，FLASH放疗将数十分钟的治疗过程压缩至亚秒级，其独特的时间生物学特性对现有辐射防护理论提出全新挑战。然而，该效应的分子机制、剂量响应规律及临床转化路径仍亟待系统阐明。细胞与动物实验衔接基础研究与临床转化，其地位不可替代。目究流程或共识供参考。本共识旨在构建一套规范化、操作性强的X-FLASH临床前研究操作体系。它系统整合了电离辐射剂量学、体外细胞实验、荷瘤小鼠模型辐照、健康小鼠辐照效应评估等关键环节的标准化流程与方法。通过提供严谨的剂量学控制、可重复的细胞与动物模型照射方案，为FLASH效应的生物学机制解析、FLASH照射设备的物理性能验证、以及基于生物效应的临床前研究设计，提供坚实且可复制的实验平台基础，助力研究者突破FLASH照射生物学研究的技术瓶颈，并为临床研究提供依据。一、X-FLASH加速器束流和剂量参数监测放射剂量学是放射治疗的基础，剂量的精确测定是X-FLASH照射临床前实验的基础性保障。考虑到各实验中心装置和技术条件的差异，X-FLASH照射目前缺乏统一的剂量学标准，本共识将针对细胞和小动物X-FLASH实验所需物理技术条件提出参考性建议。1.剂量学设备的选择、维护和检测本共识剂量学设备主要包括相对剂量监测(束流监视)和绝对剂量测定(吸收剂量测量)设备。X-FLASH束流监测是确保X-FLASH照射辐射剂量准确性和治疗安疗通常使用平板型穿透气体电离室，其约在100μs内接受超过0.1Gy通道),具有监视剂量分布对称及非对称变化的功能。探测器探头及R2>0.999的剂量线性，重复性的变异系数小于1%。实验前，需提前标定参考点吸收剂量与监视器跳数之间的关系。束外监视器是指探头安装在X射线束斑外的监视器，通常用于监视射束泄漏剂量的情况，也可以对射束的特征进行间接测量。由于泄漏剂量比例较低，束外监视器探头受照剂量率显著小于束内探头，且可以通过调整距离和角度对探头受照剂量率进行调整，因此多数现有剂量探测器都可用于束外监视器。但束外监视是一种间接测量方法，受各种干扰因素影响，特别容易受到不同样品的散射剂量干扰，在更换不同样品时需谨慎评估其对监视器探头的影响。监视器探头的输出电信号经过前端放大电路放大后，进入硬件反馈电路进行滤波、积分、数字化和比较等分析，最终输出控制信号给加速器控制系统以进行束流调整或关停等动作。需要关注的信号特征包括束流积分值(跳数)、束斑对称及非对称变化、瞬时剂量率、平均剂量率、双通道监视器的一致性等。2.剂量监测设备维护与检测剂量监测设备需要开展定期的检查和维护，建议交付时对其测量重复性、剂量线性、剂量率线性等关键性能进行检测，包括射野的平坦度、对称性以及安全联锁功能验证，并每月进行相关参数的月检。通常重复性要求在±1%以内，剂量线性在±2%以内，剂量率线性在±5%以内。具体测量计算方法可参考GB15213-2016的相关内容。考虑到当前X-FLASH设备现状，对相关参数做出如下建议，并在每次实验前对剂量监测设备进行测试，确定其工况正常(表1)。检测项目检测标准(%)检测方法剂量均匀性“剂量线性率“剂量率线性率“射束平坦度”射束对称性”曲线”算剂量率)使用EBT系列胶片，置于模块下5cm位置处，照射后扫描射束范围80%区域中心轴剂量曲线，与基准曲线作对比使用EBT系列胶片，置于模块下5cm位置处，照射后计算20%～820cm×20cm,源轴距为95cm处所测得3.X-FLASH剂量测量用剂量计(主要分为离线和在线两种),将剂量计探头放置在模拟样品量值。剂量率特性，在使用剂量测量设备时需十分通道的本底变化不超过±1%,如出现本底剧烈变化应停止使用并追溯会显著影响输出值，最大影响可能超过10%待5min,其灰度每分钟变化率将<1%,采用固定5min的等待时间进行标定和测量，也可以获得3%~5%的测量不确定度。件允许的情况下同时在实验中对每个照射对象的后端放置胶片，并及时扫描存档，实现每次实验中剂量的可追溯性。二、实验前剂量标定在开展细胞实验和小鼠实验前，需要采用胶片(EBT4:总剂量≤10Gy,EBT-XD:总剂量>10Gy)和电离室对X-FLASH设备进行剂量标1.装置状态评估在无样品条件下连续出束10次，穿透电离室反馈跳数(monitorunit,MU)变异程度，若变异程度<±1%,表明装置状态稳定，可进行2.照射野(1)细胞实验：根据细胞照射的目标区域范围，确定照射野尺寸，照射野需大于细胞照射的目标区域范围，并保证目标区域内的剂量分(2)小鼠放射性损伤模型：根据照射的目标区域范围，确定照射野尺寸(图1)。不同辐照部位的射野范围推荐如下：①全脑照射(放射性脑损伤模型):1.2cm(头脚方向)×2cm(左右方向),射野头侧界为双耳缘、连线。②全胸腔照射(放射性肺损伤模型):2cm(头尾方向)×4cm(左右方向),射野头侧界为双耳缘连线。③全腹腔照射(放射性肠损伤模型):4cm(头尾方向)×4cm(左右方向),射野尾侧界为肛门。④皮肤照射(放射性皮肤损伤模型):选择小鼠单侧后腿作为辐照区，2cm(头脚方向)×3cm(左右方向),下界为膝关节，辐照前小鼠固定时，辐照区域后腿尽量外展，使小鼠腹腔远离射野。⑤全身照射(放射性造血系统损伤模型):8cm(头脚方向)×5cm(左右方向),覆盖小鼠全身。全身照射全身照射全脑照射全胸腔照射全腹腔照射图1小鼠放射性损伤模型辐照范围示意图(3)小鼠肿瘤模型：皮下移植瘤模型推荐2cm(头脚方向)×3cm(左右方向),原位肿瘤模型的照射野需根据目标区域范围确定照射野尺寸。3.照射剂量(1)细胞实验：目标剂量设定为6~10Gy(EBT4胶片的剂量线性范围在1~10Gy),且所有EBT4胶片均已经过医用直线加速器与金刚石电离室校准其"剂量-灰度相关性"。(2)小鼠放射性损伤模型：目前FLASH照射临床前研究多采用单次大剂量照射，分割照射模式下FLASH效应的剂量范围尚不明确。由于FLASH照射放射性损伤的动物模型照射剂量标准尚未建立，结合已发表文献，对不同放射性损伤模型单次照射的推荐剂量(EBT-XD的标定剂量，所有EBT-XD胶片事先均使用医用直线加速器与金刚石电离室校准"剂量-灰度相关性")范围如下：①放射性脑损伤模型：10~30(3)小鼠肿瘤模型：依据肿瘤模型的放射敏感性选择照射剂量，避免处方剂量过低或过高，导致肿瘤照射后不退缩或快速消失，无法有效监测肿瘤体积变化。4.辐照剂量标定(1)扫描EBT4或EBT-XD胶片本底：将胶片裁剪成适当大小，正面朝上(事先在胶片正面右上角做标记)置于扫描仪中心位置，按扫描仪操作规范流程扫描胶片本底的灰度值。细胞实验：基于细胞照射所需的源靶距(SSD)调节胶片照射的SSD。选择与培养瓶(或培养皿)细胞贴壁面厚度一致的固体水模，将其置于照射野的中心位置，将EBT4胶片固定于水模之上，胶片背面为射线入射方向，且胶片中心与射野中心重合(图2)。①当采用水平束照射时，若模拟培养瓶内贴壁细胞受照(培养瓶内注满培养基),则在胶片贴壁细胞受照(培养皿中不加培养基),则胶片的射线出射面无需额外区(dosebuild-upregion,DBR)的总厚度达到2cm)。水平束照射准直器准直器固体水模EBT4胶片胶片照射的SSD。选择与小鼠辐照区域厚度一致的固体水模，将X-FLASH照射出束的同时开始计时(同时记录X-FLASH照射的跳数与脉冲数，即"胶片跳数"与"胶片脉冲数"),开始照射后5min扫量-灰度相关性",依次读出照射野面积80%范围内红、绿、蓝3个通道的剂量，以及胶片中心5mm×5mm范围内红、绿、蓝3个通道的剂量(3个通道的剂量差异应<3%,如果>3%则提示胶片质量不佳，需更换胶片重新标定)。此外，细胞照射目标范围内的剂量波动应<5%,射野平均剂量/胶片跳数),以及"射野中央5mm×5mm范围内剂量平封口膜封口以避免细胞污染。对于厚度<1mm的细胞(或类器官),可道深度的2cm厚亚克力板中，将细胞沉降区置于照cm。在每个培养瓶(或培养皿)的底面(外侧)贴一张EBT4胶片，以实学、生产和检定及其他科学实验的标准化小鼠。小鼠周龄一般为6~8周，体质量18~20g。(1)麻醉：在动物实验中，有效的麻醉不仅是保证实验顺利进行的关键环节，也是保证动物福利的一项基本要求。麻醉方式：根据麻醉过程中所使用麻醉药物的种类数量，可分为单纯麻醉和复合麻醉，对于健康小鼠辐射损伤建模，因即时损伤小，痛苦少，为方便固定，推荐选择全身单纯麻醉。麻醉药物选择：实验动物全身麻醉药物的选择需根据实验类型、动物种类及药物特性综合考量。注射药物(如丙泊酚)可用于短时、低创伤实验，但需注意剂量依赖的呼吸抑制风险。优先考虑对动物心肺功能影响小、代谢快、安全性高的药物，确保麻醉过程平稳可控，同时严格监测生理指标以应对呼吸抑制、低体温等并发症。提前准备好1ml注射器及针头，推荐麻醉药物见文献，根据造模目的自行选择。进行X-FLASH照射，因加速器机房温度低，要避免动物出现麻醉后失温死亡。实验结束后注意观察小鼠麻醉恢复情况，使用加热垫保温有助于缩短恢复时间。(2)小鼠放射性损伤模型构建小鼠固定：进行X-FLASH照射需固定小鼠体位，保证靶器官、靶组织位于射野内。小鼠固定所需材料包括：①放射实验用透明亚克力固定板(厚度约2mm),板上预先标示射野中心(十字线中点)和范围(射野的头脚、左右界线)。②医用压敏胶带。③弹性束缚带(直径约5cm)。④生物补偿物膜(厚度超过DBR)。全身照射因射野限制，可根据照射设备条件，选择定制专用全身照射固定装置。固定步骤：将麻醉后的小鼠以俯卧位(腹侧向下)置于亚克力固定板上，调整固定板为水平位，确保小鼠脊柱与固定板纵轴保持平行，小鼠身体尽量伸展。根据解剖标志，使照射野覆盖靶区组织。小鼠入射方向覆盖生物补偿膜。①全脑照射：将小鼠头部与中心十字线延长线方向对齐，避免颅骨偏移，射野头侧界为双眼后眦连线。若加速器为水平出束或拟行颅脑部位照射，需在照射板侧缘预置弹性束缚带，使其绕过小鼠上门齿进行垂直牵引，防止头部重力性下垂导致的体位偏移。使用压敏胶带固定四肢，对于上肢，压敏胶带固定小鼠前肢肘关节近端，粘贴力度以皮肤轻微凹陷为度，下肢粘贴膝关节远端，保持后肢自然伸展。②全胸腔照射：小鼠脊柱与中心十字线对齐，射野头侧界为双耳缘连线。使用压敏胶带固定四肢，对于上肢，压敏胶带固定小鼠前肢肘关节近端，粘贴力度以皮肤轻微凹陷为度，下肢粘贴膝关节远端，保持后肢自然伸展。③全腹腔照射：小鼠脊柱与中心十字线对齐，射野尾侧界为肛门。使用压敏胶带固定四肢，对于上肢，压敏胶带固定小鼠前肢肘关节近端，粘贴力度以皮肤轻微凹陷为度，下肢粘贴膝关节远端，保持后肢④皮肤照射：小鼠一侧股骨与中心十字线对齐，射野脚侧界为膝关节。使用压敏胶带固定四肢和尾部，辐照侧后腿尽量外展，使小鼠腹腔远离射野。⑤全身照射：小鼠脊柱与中心十字线对齐，小鼠中心与射野中心重叠，保证射野覆盖小鼠全身。使用压敏胶带固定四肢，对于上肢，压敏胶带固定小鼠前肢肘关节近端，粘贴力度以皮肤轻微凹陷为度，下肢粘贴膝关节远端，保持后肢自然伸展。固定后检验：固定后应对固定效果进行评估。评估麻醉深度：观察小鼠是否麻醉过浅或射野内组织移位；评估体位稳定性：胶带是否粘紧，有无脱落风险(水平束照射时需重点关注)。小鼠照射：将固定好小鼠的亚克力固定板置于准直器后方相应SSD处，射野中心与亚克力固定板中心重合。照射组小鼠根据前叙剂量标定参数，给予目标脉冲数的X-FLASH照射或常规剂量率照射；对照组小鼠除不出束照射以外，其余处理方式(包括放置位置、等待时间等)均与照射组小鼠保持严格一致。(3)荷瘤小鼠辐照实验皮下移植瘤模型：小鼠后腿外侧是首选的肿瘤接种部位，主要原因是：①该部位易于精确定位、固定和照射，显著降低了因呼吸运动或体位变化导致的靶区不确定性。②肿瘤生长及放射反应(如体积变化、局部皮肤/组织反应)在体表易于观察和量化。③避免X-FLASH照射损伤重要脏器(肠道、肺、肝脏等),影响小鼠的存活。照射前固定时，小鼠一侧股骨与中心十字线对齐，射野脚侧界为膝关节。使用压敏胶带固定四肢和尾部，辐照