DB36T+2219-2026淡水生物环境DNA监测技术规范+大型底栖动物

CCSZ06DB36江西省市场监督管理局发布DB36/T2219—2026I 12规范性引用文件 13术语和定义 14试剂和器材 25样品采集 36PCR扩增、测序与分析 47质量控制与评价指标 5DB36/T2219—2026本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由江西省生态环境厅提出并归口。本文件起草单位：江西省生态环境科学研究与规划院、中国科学院水生生物研究所、华中农业大学。本文件主要起草人：姚娜、张园眼、张萌、龚迎春、周琼、王军、冯兵、雷婷、徐茹、任俊达、赵子豪、张玉、朱佳琪、吴俊伟、李铭书、王强、刘赋斌、杨东、夏威、付思懿、肖火青、王启沛、甘甜、许曦、胡林凯、甘一民、李志龙、蔡鑫、万禀颢。DB36/T2219—20261淡水生物环境DNA监测技术规范大型底栖动物本文件规定了利用环境DNA（eDNA）宏条形码技术监测大型底栖动物的试剂和器材、样品采集、PCR扩增、测序与分析、质量控制与评价指标。本文件适用于湖泊、水库、河流和地下水的大型底栖动物监测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T29859生物信息学术语GB/T30989高通量基因测序技术规程GB/T35537高通量基因测序结果评价要求GB/T37874核酸提取纯化方法评价通则GB/T40226环境微生物宏基因组检测高通量测序法HJ494水质采样技术指导HJ1295水生态监测技术指南河流水生生物监测与评价（试行）3术语和定义GB/T29859和GB/T30989界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1大型底栖动物macrozoobenthos生活史的全部或至少一个时期栖息于河流、湖泊、水库、地下水的水底表面或底部基质中的大型动物。本文件特指不能通过500μm筛网的大型底栖无脊椎动物，主要包括节肢动物门等动物。3.2引物primer在DNA复制过程中，结合于模板链上并作为复制延伸的起始位点和/或终止位点的，具有一定长度和顺序的寡核苷酸链。DB36/T2219—202623.3聚合酶链式反应polymerasechainreaction（PCR）一种体外酶促合成特异DNA片段的分子技术，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便省时等特点。3.4环境DNAenvironmentalDNA（eDNA）通过从环境介质（水、土壤、沉积物等）或混合生物组织中提取的DNA。3.5DNA宏条形码DNAmetabarcoding利用高通量测序获取环境介质（如水、沉积物、土壤、空气等）或混合生物组织中的特定DNA片段，根据物种间特定DNA序列差异识别物种，获取物种组成和群落结构。3.6线粒体细胞色素c氧化酶I序列mitochondrialcytochromecoxidaseI(COI)sequence后生动物线粒体基因组上的线粒体细胞色素c氧化酶I对应的DNA序列。3.7DNA宏条形码技术DNAmetabarcodingtechnology利用高通量扩增子测序获取环境DNA的特定片段序列，根据物种间DNA序列差异识别物种，获取物种组成的技术。3.8扩增序列变体ampliconsequencevariants（ASV）DNA宏条形码技术中，通过生物信息学剔除PCR扩增和测序产生的错误序列后形成的独特DNA序列，即每条序列至少有一个碱基不相同，可以根据ASV的序列差异进行物种鉴定。3.9操作分类单元operationaltaxonomicunit（OTU）DNA宏条形码测序数据按照一定的序列相似性阈值进行聚类，获得的用于表征物种的分子水平的分类单元。4试剂和器材4.1试剂和材料所需试剂和材料如下：——DNA提取试剂或试剂盒；——PCR扩增试剂；DB36/T2219—20263——PCR扩增引物；——PCR产物纯化试剂盒；——凝胶电泳试剂：琼脂糖凝胶、TAE缓冲液、上样缓冲液等；——根据高通量测序平台选取相关试剂和材料。4.2仪器和设备4.2.1样品采集及前处理设备要求如下：——大型底栖动物采集工具：彼得森采泥器、D形网、索伯网等；——水样采集工具及抽滤设备；——沉积物采样设备：抓斗式采泥器、柱状采泥器等。4.2.2实验室分析仪器和设备要求如下：——PCR仪：温控范围0℃~100℃,升温速度6℃/s，配套PCR管200μL；——核酸电泳仪：水平式；——凝胶成像分析仪；——冷冻干燥器；——微量紫外分光光度计；——混合纤维滤膜（孔径0.45μm）。5样品采集5.1采样点位设置5.1.1采样点位的布设原则：参照HJ1295中相关要求执行。5.1.2点位布设要求如下：——湖泊：根据区域内湖泊形态、水文状况、水生生物分布等因素的差异，将湖泊分为不同的小区域，如滨岸带、沿岸带、湖心区、主要河流出入口等，湖心区每2km2设置不少于1个采样点位，其他小区域设置不少于1个采样点位；——水库：将水库分为入库口、出库口、深水区等区域，各个区域设置不少于1个采样点位，库区每15km2设置不少于1个采样点位；——河流：将河流划分成河口区、下游河段、中游河段、上游河段，以及支流和干流的汇口区等区域，每个区域设置不少于1个采样点位。当河流宽度<50m时，在河流中部或靠岸一侧设置1个采样点位；当50m≤河面宽度<200m时，在河流两侧分别布设1个采样点位，等比例采集混合水样；当河面宽度≥200m时，在河流中部和左右两侧分别设置1个采样点位，等比例采集混合水样；——地下水：参照河流的采样点位设置方法执行。5.1.3参照点位及参照状态：参照HJ1295中相关要求执行。5.2采样频次与时间5.2.1根据监测目的和监测条件，结合河流和湖库水期、季节、大型底栖动物群落的变化，在保证获取具有时间代表性eDNA样品的前提下，确定最低的监测频次和监测时间。5.2.2根据实际监测任务需要，按水期、季度或月度选择监测频次和监测时间。针对重点关注区域和突发环境问题开展加密监测。DB36/T2219—202645.3样品采集5.3.1水体样品5.3.1.1大型底栖动物eDNA样品在距离岸边0.5m处采集。当水深≤0.5m时，在1/2水深处采样；当水深>0.5m时，在底质上0.5m处采样。将1L的灭菌采样瓶瓶口向上游来水方向，采集1L水样（根据水样浑浊程度增加或减少采样体积）。采样瓶装满后密封并做标记。每个采样点位至少有5个重复和1个阴性对照。5.3.1.2完成水体eDNA的过滤富集，滤膜低温(≤4℃)冷藏运输，当天返回实验室后-20℃~-80℃保存。未现场过滤的，水体低温（4℃)冷藏运输，并在6h内返回实验室，24h内完成过滤，滤膜-20℃~-80℃保存。当水体透明度较高时，适当增加滤膜滤水量，每张滤膜最多抽滤2L；当水体藻类明显较多时（如藻华暴发期滤膜容易堵孔，减少滤膜过滤水量同时增加样点的滤膜数量，每张滤膜抽滤体积减少至250mL；当水体泥沙/颗粒物较多时，静置后过滤，过滤条件参考藻华暴发期的过滤方法。5.3.2沉积物样品按照HJ494的规定采集至少100g的表层沉积物样品，收集在无菌清晰的塑封袋或采样瓶中，做好标记，置于车载冰箱4℃冷藏运输。每个采样点位至少有5个重复和1个阴性对照。5.4eDNA提取纯化和测定保存5.4.1eDNA提取纯化5.4.1.1滤膜样品（水样）：利用研磨珠和裂解液将滤膜振荡破碎，将破碎后的样品置于1.5mL离心管中，采用符合动物组织细胞DNA提取的商业化试剂盒完成，具体操作参考试剂盒要求。5.4.1.2沉积物样品：经均质器均质后冷冻干燥，用网筛过滤杂质并混合均匀。取0.25g样品置于1.5mL离心管中，采用符合动物组织细胞DNA提取的商业化试剂盒完成，具体操作参考试剂盒要求。5.4.1.3eDNA提取参照GB/T40226中的操作步骤，采用离心柱法和磁珠法等常规分子生物学操作提取DNA。5.4.1.4eDNA纯化采用符合要求的柱式PCR产物纯化试剂盒完成，具体操作参考试剂盒要求。5.4.2DNA测定保存5.4.2.1采用微量紫外分光光度计检测总DNA浓度。样本DNA浓度不低于1ng/μL，最佳浓度范围为10ng/μL～100ng/μL。OD260nm/OD280nm比值介于1.8～2.0之间，OD260nm/OD230nm大于2.0。eDNA在-20℃及以下保存，避免反复冻融。5.4.2.2利用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析DNA完整性，有单一且清晰明亮的主带，无弥散状降解。6PCR扩增、测序与分析6.1宏条形码引物选择6.1.1大型底栖动物通用扩增引物选取参照表1。表1大型底栖动物常用宏条形码扩增引物信息GGWACWGGWTGAACWGTWTAY45℃~55℃TAAACTTCAGGGTGACCAAAAGGWACWGGWTGAACWGTWTAY45℃~55℃TAIACYTCIGGRTGICCRAARDB36/T2219—202656.1.2宏条形码扩增产物用1%～2%的琼脂糖凝胶电泳检测。若样品出现多个条带，需纯化PCR产物，纯化过程参考GB/T37874。PCR产物通过1%～2%琼脂糖凝胶电泳检测，判断PCR反应存在特异性扩增，以及扩增过程中产生的引物二聚体信息。电泳后，PCR产物在相应的DNA条形码序列长度位置出现一条单一的目的条带，阴性对照无条带。6.1.3宏条形码扩增产物在-20℃以下温度条件下保存，保存时间不超过一年。6.2高通量测序6.2.1参照GB/T30989和GB/T35537相关规定对宏条形码扩增产物进行测序。6.2.2每个样本的预期有效序列数不低于500000条。6.3生物信息学分析6.3.1序列处理要求如下：a）同一批试验数据，生物信息学分析流程及关键参数保持一致；b）通过搜索特定序列（去除测序接头adaptor、样品索引index和引物），并基于碱基识别质量（>Q20，参考）和序列长度（>预期长度的70%，参考）进行序列修剪；c）根据每个样品的Index将序列分配到不同的样品中。6.3.2序列聚类及质量控制要求如下：a）选用OTU或ASV方法进行序列聚类和质量控制，获得分子分类单元，并过滤掉PCR扩增过程中产生的嵌合体序列；b）OTU方法：将相似性高于或等于阈值（相似性阈值一般为0.97）的序列合并成OTUs，将序列比对到每个OTU的代表性序列，获得每个OTU在每个样品中出现的序列数；c）ASV方法：每个独特的序列即为一个ASV，根据生物信息学方法过滤潜在的PCR和测序错误的ASV序列，将序列比对到每个ASV，获得每个ASV在每个样品中出现的序列数。6.3.3过滤低丰度的分子分类单元：过滤低丰度（如序列数为1～5）的分子分类单元（可能为假阳性、污染序列或未去除的嵌合体）根据实际监测需求调整过滤的丰度阈值。6.3.4序列注释：将分子分类单元的序列与条形码公共数据库和本地数据库比对分析，获得物种注释信息。物种注释方法和物种鉴定阈值（主要是序列相似性≥98%）的选择，综合考虑选用的条形码片段、参考数据库的完整性及数据用途。6.3.5结果统计要求如下：a）检出判定：分子分类单元在某一位点不少于2/3的生物重复样品中检出。每个样品只保留相对丰度>0.01%的分子分类单元；b）相对丰度：每个位点检出的分子分类单元的相对丰度为所有生物重复样品中相对丰度的平均值；c）统计表：每个样品的生物多样性统计表由分子分类单元（如OTUs或ASVs）名称、序列、物种注释信息、序列数和相对丰度组成。7质量控制与评价指标7.1质量保证与控制7.1.1野外质量野外样品采集与运输做好记录和交接，并防止样品的交叉污染。7.1.2实验室质量实验室样品交接时，办理正式交接手续，由接收样品的工作人员记录其状态，检查是否异常或是否DB36/T2219—20266与相应检验方法中描述的标准状态有所偏离。实验室应建立送检样品的唯一识别系统，保证任何时候的样品识别不会发生混淆。7.2质量控制参数7.2.1阴性对照：在样品采集、DNA提取和PCR扩增阶段分别设置不少于3个阴性对照，适当设置测序的阴性对照。7.2.2阳性对照：将不少于10个已知物种的DNA等摩尔混合，作为PCR扩增的