大胡蜂胰凝乳蛋白酶抑制剂cDNA克隆及序列的分析

大胡蜂胰凝乳蛋白酶抑制剂cDNA克隆及序列分析 论文（设计）题目大胡蜂胰凝乳蛋白酶抑制剂cDNA克隆及序列分析子课题题目摘要大胡蜂Vespa(Magnifica)magnificaSmith胡蜂科，(Vespoidea)黄胡蜂属(Vespa)，隶属于膜翅目(Hymenoptera)，是一类飞行迅速、分布广泛的昆虫。大胡蜂中的工蜂会分泌出蜂毒，蜂毒是由胺、多肽、酶等蛋白质组成的、带有芳香气味的混合物。被黄蜂叮咬后，局部伤口出现红斑、疼痛、肿胀、丘疹以及黑钉头似的等坏死性病变。同时，还会损伤人体的神经系统、循环系统、泌尿系统等系统。严重中毒时会直接使人致死。因此，研究大胡蜂的毒素成分对应对和应用蜂毒具有重要的意义。随着现代分子生物学技术的不断发展，使得对蜂毒的成分有了更进一步的了解。本论文通过使用Trizol试剂提取总RNA，再用SMART技术构建大胡蜂毒腺cDNA文库，最后经过克隆和测序。结果成功构建了大胡蜂毒腺cDNA文库，经过挑单克隆菌进行测序，获得编码胰凝乳蛋白酶抑制剂的cDNA序列。以此序列为模板，推测出对应的氨基酸序列，使用BLAST软件将该推导的氨基酸序列与蛋白质公共数据库比对。使得到的片段序列与已知同属物种序列进行相似性对比，以此来为研究大胡蜂毒素的组成成分，并为大胡蜂的资源利用提供基础理论数据。关键词：大胡蜂；毒素，胰凝乳蛋白酶抑制剂，序列分析AbstractVespa(Magnifica)magnificaSmithbelongstothefamilyVespoideaoforderHymenoptera.Itisawidelydistributedandrapidlyflyinginsect.Studyfoundthatbeevenomisworkerbeevenomglandsecretionofakindoffragrantsmell,amixtureofcomplicatedcomposition,mainlyconsistofamine,peptides,enzymesandotherproteins,bywaspstingslocalwoundcanappearafterthepain,redness,pimplesandlupus,orblacknailheadnecroticlesions,thebodyatthesametimeaccompaniedbyalloverthebodysuchasthecirculatorysystem,nervoussystem,urinarysystemdamage,seriouslypoisonedtodeath.Therefore,itisparticularlyimportanttostudythetoxiccomponentsofwasps,soastobettercopewithandapplybeevenom.Withthecontinuousdevelopmentofmodernmolecularbiologytechnology,thecompositionofbeevenomhasbeenfurtherunderstood.Inthispaper,totalRNAwasextractedbyTrizolreagent,andthenSMARTtechnologywasusedtoconstructtheVespavenomglandcDNAlibrary.Finally,itwasclonedandsequenced.ResultsthecDNAlibraryofwaspvenomglandwasconstructedsuccessfully,andthecDNAsequenceencodingchymotrypsininhibitorwasobtainedbysequencingmonoclonalbacteria.Usingthissequenceasatemplate,correspondingaminoacidsequenceswereinferred.BLASTsoftwarewasusedtocomparethederivedaminoacidsequenceswiththepublicdatabaseofproteins.Theobtainedfragmentsequenceswerecomparedwiththesequencesofknownspeciesofthesamegenus,soastostudythecomponentsofwaspstoxinandprovidebasictheoreticaldatafortheutilizationofwaspsresources.Keywords:wasp;toxin;Chymotrypsininhibitors;sequenceanalysis.

目录第一章前言 第一章前言1.1胡蜂的研究与分类1.1.1胡蜂的研究胡蜂，又称马蜂、地王蜂、黄蜂、大土蜂、草蜂等，隶属于膜翅目(Hymenoptera)细腰亚目(Clistogastra)，完全变态，是一类具有社会性行为的肉食性昆虫类群。胡峰食性广泛、食量大、飞翔和捕食迅速。通常被广泛应用于林业、农业害虫的防治，目前主要被用来作为体型较大害虫的天敌[1]。从很早以前人们就开展了对胡蜂的研究，根据文字可靠记载，我国对于某些胡蜂的生物学习性、种类的简单描述和利用比国外早1000多年。即便在科学高速发达的今天，关于胡峰的有些资料也仍然存在着较高的科学价值。如在春秋战国时期，《诗经》和《尔雅》中就有“螟蛉有子，蜾赢负之”的记载。可以表明，我国在西周时期就已经开始了对胡蜂的研究，另外在后来的汉代、晋代、宋代、元代、明代都有胡峰的相关记录。当前，国外对于胡蜂毒素的基因研究主要集中在过敏原性大分子量蛋白[2]，胡蜂的活性成分及药理作用的研究表明，以胡蜂为原料药制备的涂膜剂具有脑缺血再灌注损伤的预防保护作用[3]，耐缺氧和抗心肌缺血作用和镇痛、抗凝、抗血栓形成作用[4]。但现今学术研究中，仍然缺乏胡蜂相关药理机制临床研究与应用，古代民间偏方是有关胡蜂的药理应用的主要依据，缺乏可靠的科学依据。因此展开胡蜂的抗炎、抗肿瘤、抗病毒及免疫调节等作用的实验，探索胡蜂多种药理活性的作用机制，以得出活性作用物质的化学结构，为胡蜂资源的可持续利用提供科学依据的工作迫在眉睫。相信随着科研工作者的不懈努力和生物技术的不断进步，胡蜂资源在不久的将来一定会为人类社会带来贡献。1.1.2胡蜂的分类胡峰种类繁多，很多种类在19世纪的时候就已经被命名了，到目前为止，全世界已知胡蜂大约有6000多种，可能全世界约还有1500种胡蜂未知已经发现的与农林业有关的有马蜂科、胡蜂科、蜾赢科，其中蜾赢科仅古北区已知就有130个属，约1600种[5]。我国胡蜂分类学研究与国外相比，处于一个相对滞后的水平，16世纪到19世纪，部分国外的学者就对我国的胡蜂进行采集、鉴定，并发表了许多新种。胡经甫先生在1941年编写的《中华昆虫名录》中就总结了国外学者在中国采集并发表的胡蜂新种，报道中国有胡蜂145种，其中包括38个变种。在后来刘崇乐对我国的胡蜂资源进行调查，发表新种6种。20世纪80年代，中国科学院研究员李铁生对我国的胡蜂进行系统研究，出版了《中国农区胡蜂》[6]和《中国经济昆虫志·胡蜂总科》[7]，在《中国经济昆虫志·胡蜂总科》中，他总结了我国胡蜂总科共有7科37属150种，另外，也对云南、四川、福建、西藏等省份的胡蜂资源进行调查。董大志对云南的胡蜂进一步研究，发表新种6个，共记录分布于云南的胡蜂122种，并认为我国已记载的胡蜂有200多种[8-9]。石达恺报道台湾胡蜂28种。能乃扎布在撰写的《内蒙古昆虫》中记载了内蒙古胡蜂总科3科72种[10]。1.2大胡蜂的形态特征胡蜂为完全变态昆虫，包括卵、幼虫、蛹和成虫4个发育阶段，各个发育阶段身体形态各异。胡蜂卵呈椭圆形、光滑、乳白色，在每个巢室中有1枚，卵外层具薄膜，其内充满液体，基部有一丝质柄把卵固着悬吊在巢室上，因此人们通常可观察到大胡蜂幼虫倒吊于巢室，却不会落下来。幼虫体态粗胖，两端偏尖，梭状，白色，无足，幼虫的消化道在中肠部由围食膜形成一个封闭的囊，不与排泄孔相通，排泄物被贮存在这囊中，化为蛹后这个囊干硬变黑，然后随着蜕掉的皮一起脱去。蛹常为黄白色，蜂蛹的颜色随着蛹的生长发育逐渐变深，头、胸、腹分化明显，主要器官均可见，蛹不进食，在巢室内羽化成蜂，用上颚咬破室口后钻出。胡蜂成虫一般体长为25-45mm，最长可达50mm。其头部由头颅、触角、和口器部分组成，头颅为一几丁质化的硬骨骼组成的颅壳，正面官近似三角型，前后扁平，光滑、毛稀，呈棕色。触角丝状，向端部均匀收缩，两触角窝之间呈三角形隆起，额沟明显，两触角柄节、梗节和鞭节三分之二处为黄褐色，其余皆为褐色。头部上端两边各有一大型复眼，中间部分凹陷呈肾形。复眼下部为近似三角形或盾形骨片，即唇基，唇基隆起，端缘中央凹人，两侧呈齿状突出。具粗刻点和稀短毛。唇基的下部为口器部分，最上部为一舌状上唇，有口盖作用，两侧具有一对上颚，上颚坚硬粗壮，上部具有1粗齿，下部具有3个端齿，中部为刃状[11]。胡蜂成虫胸部通常为黑褐色，两端部较细，中部呈圆柱形，胸部分前胸、中胸和后胸3节。前胸背板倾斜向基部，两肩角呈脊状突出，光滑，有细浅刻点和短毛。中胸背板发达，具有不同程度凸起，两边生有一对椭圆形的翅基片，有一对膜质前翅位于翅基片上，其后翅在后胸上，后翅较小，前翅发达，翅脉特化，黑褐色，前缘和基部色略深。3节胸部各生1对足，为前、中、后足，足基节、股节黑色，胫节、跗节淡棕色，其各足强壮且细长，反应灵敏，健壮有力，一般用于抓捕取食，修筑巢穴。成虫腹部为圆锥形或披针形。雌蜂6节，雄蜂7节。第1节基部与并胸腹节相连，呈截状或坡状，多数种第1节收缩呈柄状。背板半圆筒形，腹板扁平，背板近中部两侧常可见一对侧瘤。腹部第2节背、腹板中部最宽。雌蜂3-5节、雄蜂3-6节向端部逐渐变窄，常可以伸缩。腹部末端节近三角形，着生有外生殖器。外生殖器雌、雄各异，雌蜂外生殖器为一根可伸缩的螯针，雌蜂的螯针由坚硬的产卵管形成，端部尖细，向基部逐渐变粗如针状，当蜇刺人、畜或其他动物时可排出毒液。产卵管基部与腹腔内的毒囊由导管相通，毒囊上通有分泌酸性液的酸腺，毒囊端部由一一根导管与碱腺一起通人螯针。无蜇刺目标时，酸、碱腺是分开的，蜇刺时酸、碱腺同时进人蜇刺目标，互相作用弓|起毒性发作（如图1.1-1.2）。图1.1大胡蜂的形态（背面）图1.2大胡蜂的形态（侧面）1.3大胡蜂的地理分布根据大胡蜂所适应的温度、降水量和饮食习性，推测它潜在分布区[12]，表明西南地区和东北部地区为其分布的核心区域。在国外分布于朝鲜、日本（北海道一九州）及欧洲（法国[13]）。1.4大胡蜂的毒素及蛰伤后处理1.4.1大胡蜂的毒素早期国外科学家研究发现蜂毒是由工蜂的毒腺分泌出来的一种主要由胺、多肽、酶及其他蛋白组成具有芳香气味的混合物，成分较为复杂[14]。其中胺类小分子物质主要是去甲肾上腺素、多巴胺、组胺、五羟色胺（5HT）等[15]；多肽类的有缓激肽、蜂毒明肽(apamin)、蜂毒肽(melittin)、抗菌肽等[16]。蜂毒肽可以与生物膜发生作用，从而会使生物膜出现一系列改变。近年来对于其药理作用及其作用机制的研究增多，进展良好且在不断更新。有研究报道蜂毒肽具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗菌和抗辐射等多种药理学作用。胡蜂毒素成分的蛋白电泳显示，其蛋白浓度在23、34和43kD处较高，经鉴定发现这3种主要成分分别为抗原-5蛋白(antigen-5protein)，透明质酸酶(hyaluronidase)和磷脂酶A1(phospholipaseA1)，它们是胡蜂毒素中3种主要蛋白成分，也是被胡蜂蜇后导致人和动物发生过敏反应的主要过敏原[17]。大胡蜂蛰伤后表现雌蜂身上有一根坚硬的长螫针，在遇到袭击或干扰时，会群起攻击，蛰伤处会出现红肿、疼痛，12～48h加重，肿胀疼痛范围扩大，可溃破形成不同大小的溃疡面。在被胡蜂蛰伤后几小时内，产生快速扩大的皮疹，机体胸闷、呼吸困难、恶心呕吐，部分患者会出现腹泻。也可能会出现过敏反应，出现过敏性休克，这也是前期被胡蜂蜇伤致死的主要原因。部分患者甚至会出现溶血现象，此时尿呈茶色到酱油色，腰疼、肾功能改变，后期可表现不同程度贫血。毒素直接作用于肾小管上会损伤肝脏，表现为全身水肿、尿贫。另外，免疫复合物沉积致肝细胞坏死损伤肝，血清酶升高。同时还会不同程度的影响神经系统和心血管系统[18]。1.4.2蛰伤后处理被胡蜂蜇伤后，若毒针残留在伤口，应立即将毒针取出，在患处用1％醋酸或稀醋水，3％硼酸涂洗。如果较轻未出现呼吸困难及吞咽者，均口服氯苯吡胺，每日每kg体重0.35mg，分3次口服，所有患儿均肌注肾上腺素，每kg体重0.1mg最大量1mg，同时用大量维生素C200-300mg加10％葡萄糖液静脉滴注，对于有休克、病情较重的患者按抗休克处理上氧补液等抢救，有呼吸困难及吞咽困难的患者，用大剂量可的唑8-10mg/kg，加入10％葡萄糖液1-2倍，静脉滴注，西咪替丁每日20~30mg/kg。分3次静脉注射。常规准备气管切开仓及气管插管[19]。1.5大胡蜂的资源价值虽然胡蜂蜂毒可以致人死亡，但是大胡蜂又是一把双刃剑，还有食用价值和药用价值等。1.5.1食用价值许多胡蜂的幼虫和蛹可供人类食用，营养价值较高，世界上许多民族有食用胡蜂幼虫和蛹的习俗，在日本，常加调料煮吃，或做成胡蜂罐头出售；在墨西哥，有生吃胡蜂与烤吃等[20]。在云南，胡蜂幼虫和蛹是不可错过的美食，蛋白含量高，营养价值高，各种餐厅、饭店也有胡蜂菜系在售，价格高昂。食用蛋白含量高，脂肪含量低的基胡蜂(V.basalis)幼虫、蛹和成虫，凹纹胡蜂(V.velutinaauraria)和黑尾胡蜂(V.tropicaducalis)的毒素有助于抗辐射及治疗关节炎；矿质元素含量丰富的金环胡蜂(V.mandariniamandarinia)幼虫、初化蛹、老熟蛹和成虫可以延缓衰老、补充铁预防贫血。通常，胡蜂幼虫食用价值高于幼虫，主要是因为口感较好且不含有蜂毒。次外，经过分析测定发现，胡蜂中含有微量的镉(Cd)0.09-0.36μg/g，虽然镉含量在国家食品污染物标准限量(0.1-1.0μg/g)内，但是尽量少食用[21]。1.5.2药用价值胡蜂的药用价值在古今民族药著都有相关记载，如在《神农本草经》、《本草纲目》、《中国民族药志要》、《千金翼方》、《本草纲目拾遗》、《常见药用动物》、《傣药》都有记录，典籍中胡蜂的药理作用主要有几下几个方面：治风头，祛风，解毒，除蛊毒；祛风除湿，治疗风湿、类风湿性关节炎；大风疠疾须眉堕落，皮肉已烂成疮者；消肿解毒；用治痈肿疮毒、蜘蛛和蜈蚣咬伤，蝎子蛰伤等；治痈肿，丹毒，风疹；轻身益气，补虚羸伤中，久服令人光泽好颜色不老。用鲜活胡蜂泡制的胡蜂酒，为景颇族传统药酒，在祛风除湿上有一定的疗效，常用于治疗风湿及风湿性关节炎；陆马蜂的毒素可以抑制细胞分裂、杀害和治疗肿瘤细胞[22]；基胡蜂毒素中的十四肽阳离子(MastoparanB)能作为中华民族民间降压药物，同时也用于研究MP-B引起心血管阻塞机制；基胡蜂富含人体必需脂肪酸(EFA)，如亚麻酸、亚油酸等，可以降血脂、抗肿瘤、调节免疫能力、改善视力等[23]。1.6生物防治价值在生物防治上，可以利用胡蜂防治农林害虫[24]。胡蜂处于昆虫世界的食物链顶端，是大多数农林害虫昆虫的天敌，能有效的捕食和杀死农林害虫，主要是捕食和杀灭鳞翅目幼虫，如棉铃虫(Heliothisarmigera)和菜粉蝶(Artogeiarapae)，也能捕食蝗虫和金龟等小型昆虫。胡蜂生物防治技术的运用成功的案例较多，例如，据报道湖南省石门县在利用胡蜂进行生物防治棉铃虫时，仅一个市乡就节省开支12.76万元；河南虞城县利用亚飞马蜂(Polisteshebraeus)和陆马蜂(P.rothneyigrahmigrahmi)对棉铃虫进行生物防治，取得了显著效果；湖北、安徽、浙江等地都曾利用胡蜂对农林害虫进行生物防治，也取得了良好成绩[25]，由此可见利用胡蜂对农林害虫进行生物防治可以取得良好的生态和经济效益。1.7大胡蜂胰凝乳蛋白酶抑制剂胰凝乳蛋白酶是一种分解蛋白质的消化性酶。胰凝乳蛋白酶的活性部位主要包括Ser195，His58，Asp102三个关键残基。His57主要作用是碱催化作用，Ser195的作用是亲和催化作用。隶属丝氨酸蛋白酶，胰凝乳蛋白酶裂解蛋白质主要是切断在芳香族氨基酸的羟基处的肽键。在麻蝇幼虫，家蚕和烟青虫等昆虫中发现了胰凝乳蛋白酶抑制剂，能停止、阻止或降低胰凝乳蛋白酶的活性。胰凝乳蛋白酶抑制剂广泛存在于微生物、豆科植物、禾本科植物、节肢动物和哺乳动物等体内。当前市场上的胰凝乳蛋白酶主要为牛胰中分离提纯的一种蛋白水解酶，分解能力强，毒性低，副作用小。

第二章实验材料与方法2.1实验材料2.1.1材料（大胡蜂）的收集本实验材料大胡蜂采集自云南省普洱市江城县大碑村。2.1.2试剂引物；组织总RNA提取试剂盒；OligotexmRNAMiniKit试剂盒；SMARTPCRcDNASynthesisKit试剂盒；pDONR222载体；大肠杆菌E.coliBL21感受态细胞；TaqDNA聚合酶；氯仿；异丙醇；乙醇；琼脂糖等其它生化试剂。2.1.3仪器PCR仪、冷冻离心机Centrifuge5417R、常温离心机Centrifuge5418、结晶生物安全柜AirstreamAC2-4S1、电子天平TB-215D、恒温摇床、移液枪、高温灭菌锅等2.1.4试剂配制琼脂糖电泳试剂：(1)电泳缓冲液TAE(Tris-乙醇)：0.04MTris-乙醇，1mMEDTA。(2)TAE储存液(50×)：242gTris碱，57.1ml冰乙酸，100ml0.5MEDTA(pH8.0)，补加水至1L。(3)溴酚蓝指示剂(6×)：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖。(4)溴化乙锭(EB-DNA染色剂，10mg/ml)：EB为强诱变剂并具有中度毒性，使用时需要带上手套。LB培养基：10gNaCl，10g蛋白胨，5g酵母提取液，双蒸水补加至1L。固体培养基：加琼脂粉15g/L，20分钟灭菌处理后在超净工作台倒平板备用。LB培养基：临用前加卡那霉素100mg/L。2.2操作方法2.2.1组织总RNA提取1.取50-100mg金环胡峰组织，用液氮和研磨器皿充分磨碎或用匀浆器进行匀浆处理，并加入到1ml的裂解液RL中，组织的体积不能超过裂解液RL体积的10％。2．将上述样品进行漩涡震荡混匀，并孵育2-3分钟，温度条件为室温，从而使核酸蛋白体完全解离。3．每1mlRL裂解液中加入氯仿0.2ml，再剧烈振荡使样品颜色变为乳白色，室温放置2-3分钟。4．再进行离心操作，12000rpm，4℃离心10分钟，此时样品会分成三层：上层的水相中为RNA。因此把上清液转移到新的管中，进行下一步操作。5．加入1/2倍体积无水乙醇，颠倒混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和可能出现的沉淀一起转入吸附柱RB(吸附柱套在收集管内）。6．12000rpm，4℃离心1分钟，弃掉废液，将吸附柱重新放回收集管。7．加500μl的去蛋白液RP，离心条件与转速为12000rpm，4℃，离心30-60秒，弃掉废液。8．加入600μl漂洗液RW（先检查是否加入无水乙醇）再次进行离心，离心条件与转速为12000rpm4℃，离心30-60秒，弃掉废液。9．加入600μl漂洗液RW，12000rpm4℃离心30-60秒，弃掉废液。10．将吸附柱RB放回收集管中，12000rpm离心1-2分钟，除尽漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。11．将吸附柱RB放入一个新的RNasefree离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-100μlRNasefreeH2O(65-70℃水浴中预热效果更好)，室温放置2分钟，12000rpm4℃离心1分钟洗脱。洗脱体积越大，洗脱效率越高，但是浓度会降低，如果想要提高浓度，则可以减少洗脱体积，但是洗脱体积不要低于30μl，洗脱体积过小降低RNA产量。2.2.2RNA的检测选用吸光值检测法：用紫外分光光度计检测RNA的纯度（OD260/280>1.8）和得率（1OD260=40μg/mlRMA）。用OligotexmRNAMiniKit试剂盒（Qiagen，美国）根据标准说明书纯化mRNA，用紫外分光光度计检测RNA的纯度和得率。2.2.3cDNA合成和基因文库的构建用SMARTPCRcDNASynthesisKit试剂盒（Clontech，美国）合成cDNA，并根据本试剂盒含有从mRNA反转录到cDNA以及扩增cDNA所必须的全部试剂以及操作说明进行操作。第一链合成用SMARTScribeMMLV逆转录系统进行，两端引物名称及序列分别为：5'测序引物及序列：5'CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG3'3'测序引物及序列：5'AGCGGATAACAATTTCACACAGG3'PCR反应如下：先在94℃使双链变性，再循环如下过程：92℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次，循环结束后72℃保持7min合成不完全的双链末端。最后PCR产物连接到PET-28a载体，转化到感受态大肠杆菌E.coliBL21中。PCR产物与PET-28a载体连接图2.1pDONR222载体示意图1.取一个灭菌的0.2ml微量离心管，加入4μl的PCR产物混合液，0.5μlT4DNA连接酶，1μlpDONR222载体，1μl连接酶缓冲液，3.5μlddH2O，反应总体系为10μl。2.震荡混合后的液体，再进行短暂的离心，将其置于16°C水中过夜。3.将连接后的产物用来转化感受态细胞，或者存放置4°C冰箱备用。质粒的转化热激法转化实验步骤：1．制备选择性培养基平板：在融化的250mlLB固体培养基中（冷却至55℃左右）加入Kana至终浓度50μg/ml，混匀后倒入灭菌后的培养皿中；将制备好的感受态细胞放于冰上融化；将44μl感受态细胞加入约1μl质粒DNA，轻轻混匀，在冰上放置30分钟；4．热激：将离心管放置42℃水浴，热激90秒；5．冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置2-5分钟；6．复苏：每管加400μlLB培养基，在37℃摇床温和摇动温育45-60分钟，使细菌复苏；7．布皿：取适当体积均匀涂布于含有、抗生素（Kana）的LB平板；8．培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时即可观察到白色的菌落，即为转化子。一个金环胡蜂核糖体L17c蛋白cDNA文库就此构建成功。2.2.4PCR扩增与DNA测序PCR反应体系的配制实验所需要的PCR反应体系为20μl（如表2.1），首先在EP管板上摆好所需数量的EP管(相互之间隔一排摆放，有利于实验的操作)盖上EP管的盖子，分别用笔在EP管盖子上进行标号。根据表1一个反应体系的数据计算出所需要配制的试剂的量，就是分别乘以要配的数量，拿2000μl的EP管，然后使用移液枪吸取不同的试剂，配制好后使用移液枪将其在2000μl的EP管中混匀。其次利用100μl的移液枪，将量程调至20μl，分别加入每个100μlEP管中。最后使用经过消毒的牙签挑取ZEO单克隆抗性菌落到EP管中（此时注意为了确保模版进入体系，挑取单克隆菌落时观察牙签是否挑到，放入EP管后应反复摇动牙签，也需注意牙签不能放置过久，以免体系液体被吸取，影响实验结果）。与此同时应在一次性培养LB培养基底部画出格子并标上序号，待挑取单克隆抗性菌时牙签在格子里面碰一下，以达到再次培养细菌备用（确保EP管中放入的细菌与LB培养基上序号一致），待全部挑取之后，在无菌工作台上把LB培养基进行封口处理，放入37℃恒温培养箱培养10~15h备用。表2.1PCR反应体系表试剂 加入量2×TaqPCRMasterMix 10μl引物M13F 0.5μl引物M13R 0.5μl无菌水 9.0μlDNA模板 ZEO单克隆菌总体系 20μl注意：（1）以上实验步骤均需在无菌工作台中完成；（2）使用移液枪吸取不同试剂时一定要换枪头，否则会引起试剂污染或实验不准确；（3）模板加样完后，要及时放回冰箱冷藏；（4）实验过程中要佩戴手套；离心插上低速离心机的电源，然后使用低速离心机对配制好的样品进行短暂离心，让样品都能在EP管的底部，离心完后进行吹打，使体系内成分能够充分混匀，从而让其在进行PCR时更好的反应。注意：使用离心机时两边要平衡，使用完毕后要切断电源开关。PCR反应体系温度与时间打开PCR仪(如图2.2所示)，将离心好后的样品放入PCR仪中，盖上盖子，开始设计程序的温度、时间以及循环次数为30个循环（表2.2）。图2.2PCR仪PCR反应条件设置完毕后，按开始键进行反应，要观察反应是否已经开始，保证其正常运行。PCR反应完后，PCR仪会显示着4℃保存的页面，此时便可打开PCR仪的盖子将样品取出放置在EP管板上，取出的样品要放入冰箱中冷藏。表2.2PCR过程条件表反应过程 温度 时间预变性 94℃ 2min变性 94℃ 30s引物退火 55℃ 30s 30×引物延伸 72℃ 60s最后延伸 72℃ 10min保存 4℃ 60min注意：（1）不能中途取出样品，一定要等反应完成（4℃保存时才可取出）；（2）使用完PCR仪后要切断电源。2.2.5电泳检测条件配胶称取琼脂糖0.9g，加入锥形瓶中，用量筒量100ml的1×TAE缓冲液也加到锥形瓶中，接下来就摇匀，放入微波炉中加热至溶液无气泡、色泽均匀，清晰明亮完全溶解时用是抹布取出。待其冷却到65℃左右，然后使用移液枪加入10μlEB，轻轻摇匀。最后将溶液倒入插好梳子的胶板中，待其冷却，成凝胶后备用。点样将配好的胶放入电泳槽中，往电泳槽中倒入一定量的缓冲液（1×TAE）至刚好将凝胶淹没，电泳装置如图2.3所示。使用10μl移液枪先加DNAMarker，然后将已经过PCR反应的样品（与Marker体积一致）分别加入到每个孔中。电泳点样完成后，盖上电泳槽盖，接通电泳仪和电泳槽，设置电泳过程中所需要的数据：电压：120V，时间：20分钟左右。最后按开始键开始电泳。图2.3电泳装置紫外光观察26分钟后关闭电源，将凝胶从电泳槽中取出，将凝胶放入紫外透射仪下，利用电脑扫描图像并且使用手机拍照，保存图像。注意：（1）使用微波炉时要小心，应该将溶液摇匀，防止加热中液体会流出来；（2）一定要带好实验所需要的手套，避免皮肤接触EB，EB是有毒性的、强致癌性物质；（3）点样时要换枪头，以免试剂污染；（4）紫外灯下观察时，尽量不要眼睛直对紫外灯，紫外光有辐射，会伤害身体；（5）加入EB摇晃时瓶口不要朝向自己，以免溅到。PCR检测待测样品将产物跑琼脂糖凝胶电泳检测插入片段长度，挑选插入片段长度<1000bp条带以及相对应的一次性LB培养基上的克隆菌在无菌工作台上挑取放1ml的EP管中，EP管中事先加入500μl的LB液体培养基(此液体培养基应加入坑生素，防止长出杂菌）一式两份（一份送去测序，一份放在4℃冰箱中保存），测序用AppliedBiosystemsDNA测序仪(ABI3730XL，USA)测序（北京三博远志生物技术有限公司）。2.2.6序列比对所有cDNA序列都用NCBI的BasicLocalAlignmentSearchTool软件进行比对（/Blast.cgi)。E-value设置为﹤le-6。

第三章实验结果3.1大胡蜂毒腺总RNA的紫外鉴定和电泳结果将提取的大胡蜂毒腺总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明：其28S和18SrRNA条带清晰、尖锐。28S条带明显宽于18S条带（如图3.1）。使用紫外分光光度计检测mRNA纯度和完整性，结果表明：紫外测定OD260/OD280的比值为2.01，说明提取的大胡蜂毒腺组织总RNA完整性较好，无降解。综合琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测结果表明：提取的总RNA质量较好，符合cDNA建库要求，可进行后续实验步骤。图3.1大胡蜂毒腺总RNA的琼脂糖凝胶电泳图3.2单克隆抗性菌结果ZEO+抗性甘油菌在抗ZEO+固体培养基中，放置于恒温培养箱，确保在无菌环境中过夜培养，有效避免杂菌污染后，可明显观察到有单克隆ZEO+抗性甘油菌落生长（如图3.2），且长势良好，ZEO+抗性甘油菌的生物学特征明显，为独立的抗克隆菌落，无相互污染，完全达到挑取单克隆菌的要求。图3.2过夜培养后的ZEO+甘油菌菌落3.3PCR扩增结果选取长势良好，远离其它菌株的单克隆，用上述引物进行PCR。通过琼脂糖凝胶电泳检测其PCR扩增产物，结果如下图所示（如图3.3）。如图可见清晰、无拖尾、无杂质的DNA条带，符合送样标准，即可将该PCR产物送样测序。321Marker750500750500400300200100图3.3单克隆菌PCR电泳图（1-3均为PCR产物电泳结果，选取2号PCR结果进行测序）3.4大胡蜂毒腺cDNA序列分析使用Clontech公司的SMARTPCRcDNASynthesisKit试剂盒，我们成功构建了一个独立克隆的cDNA文库。通过挑单克隆，挑选插入片段长度<1000bp条带，送去北京三博远志生物技术有限公司测序，测序用AppliedBiosystemsDNA测序仪(ABI3730XL,USA)。获得了编码，获得了编码大胡蜂胰凝乳蛋白酶抑制剂的cDNA序列。该cDNA的全长序列如下：AGAATGCAATATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGTTGGAAGAATATAAAGAAAGTAATCATGTCTCGCGTCATTATCGCTCTTCTTGTCCTTGTGGCGATCGCTTCTGCCTTCCCATCCCAGTCAACCAATTGTGGGGAGAACGAAGAATTTAATACCTGTGGTTCAGCTTGTGAGCCTTCTTGTGGAGTTAAAACAAATATTTGTACTTTGCAATGCATAATAGGGTGCCAATGTAAGCAAGGATATCTTAGAGCTGGTAATGGCGCATGCGTTTCTCCTAATAACTGTTAAAGAGAATTAAAAGATTCTATTAAATTAGGAGAAGTACTATATATTAAATATCACTTAATGTTATACTCAAACGTTTACCGTTCCTACAACATTTTATATACTTAAAATTTTATTCATTTCTTCGATCTTATACATGTAGCTGTTACATTACTATAAATAAAATACGTTATTTTATCGTGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCCAACTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTATAAGAAAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTTGCCATCCAGCTGATATCCCCTATAGTGAGTCGTATTACATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCAGCTCTGGCCCGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGATCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCACGCAGTTGCCGGCCGGGTCGCGCAGGCGAACTCCCGCCCCCACGGCTGCTCGCCGATCTCGGTCATGGCCGGCCCGGGAGGCGTCCCGGAAGTTCGTGGACACGACCTCCGACCACTCGGCGTACAGCTCGTCCAGGCCGCGCACCCACACCCAGGCCAGGTGTGTCGGCACACTGTCTGACCGCGC大胡蜂胰凝乳蛋白酶抑制剂cDNA由771个碱基组成，包含一个294个碱基的开放阅读框(ORF)，编码了一个含有97个氨基酸残基的多肽。该多肽经过NCBI序列的数据库比对结果表明：该序列与胡蜂科马蜂属的造纸胡蜂（PolistesdominulaChrist）序列有较高的相似性，Identity为73%，表明该多肽为胰凝乳蛋白酶抑制剂的同源物。该序列的ORF（开放阅读框）序列为ATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGTTGGAAGAATATAAAGAAAGTAATCATGTCTCGCGTCATTATCGCTCTTCTTGTCCTTGTGGCGATCGCTTCTGCCTTCCCATCCCAGTCAACCAATTGTGGGGAGAACGAAGAATTTAATACCTGTGGTTCAGCTTGTGAGCCTTCTTGTGGAGTTAAAACAAATATTTGTACTTTGCAATGCATAATAGGGTGCCAATGTAAGCAAGGATATCTTAGAGCTGGTAATGGCGCATGCGTTTCTCCTAATAACTGTTAA上述开放阅读框编码一个含有97个氨基酸残基的多肽，其多肽序列为：MLFYNANFVQKSWKNIKKVIMSRVIIALLVLVAIASAFPSQSTNCGENEEFNTCGSACEPSCGVKTNICTLQCIIGCQCKQGYLRAGNGACVSPNNC将构建好的cDNA文库进行挑单克隆送往北京三博远志生物技术有限公司测序。代表性区域测序结果下图所示（如图3.4）。该峰图以4种颜色代表A、T、G、C四种碱基序列，峰的高低说明信号的强弱，峰的宽窄则表示分离效果，由该代表性区域测序结果峰型图可以明显看到峰型对称、尖锐，波峰与波谷清晰，峰与峰之间的距离均匀，峰型整齐清晰，无双峰、套峰、底峰等不良峰型，读长达800bp，有效碱基起始序列精准，无干扰峰、重叠峰、降解峰等，可信度强，序列模板未见特殊结构，例如Poly结构、发卡结构等，无衰减和中断，走势平缓下降。由此可分析，该测序结果与预期结果相同，并且达到明显的理想效果。结果表明本次成功的构建了具有较高质量的cDNA文库。图3.4代表性区域测序结果峰型图

第四章分析讨论大胡蜂的毒素是工蜂毒腺分泌出来的一种具有芳香气味的、成分复杂的混合物，经过一系列的实验探究人类已经分理得到其主要成分由胺、多肽、酶及其他蛋白组成，其中胺类小分子物质主要是去甲肾上腺素、多巴胺、组胺、5－羟色胺等；多肽类的有缓激肽、蜂毒明、蜂毒肽、抗菌肽等。随着现代分子生物学技术的不断发展，其分子结构和主要生理生化活性也已有所了解。但是除此之外大胡蜂毒素内还存在许多含量微小的成分，也包括一些尚未被发现的具有重要生理及药理作用的物质。但由于该成分的含量低，并且难提取、难保存，提取工作存在一定难度。所以从基因角度出发则可较为有效的解决这一实际问题。目前，比较可行而且应用较多的方法主要还是

cDNA

文库的筛选。

cDNA

文库只代表一定时期一定条件下正在表达的基因，是整个真核基因组中的少部分序列。由于每个

cDNA

克隆只代表一种

mRNA

序列，因此在基因克隆过程中出现假阳性的概率比较低，所以

cDNA

文库的构建已成为当前分子生物学研究和基因工程操作的基础。本论文的实验材料是云南省禄丰县采集而来，我们先对采集来的材料进行预处理，使其组织不被破坏，并带回实验室。然后从大胡蜂毒腺组织中提取总RNA，通过mRNA反转录成cDNA的方法合成大胡蜂毒腺基因，并将其克隆到pDONR222载体上。并且进行文库筛选测序，得出与预知序列相同的序列。根据全长cDNA中推导出氨基酸序列，使用NCBI的BasicLocalAlignmentSearchTool软件与蛋白质公共数据库进行比对。序列比对结果表明：克隆出来的胰凝乳蛋白酶抑制剂cDNA序列与已知的胡蜂科马蜂属的造纸胡蜂（Polistesdominula）序列有较高的相似性。说明本实验所构建的文库质量完全可以进行功能基因的cDNA克隆。要构建一个高质量的cDNA文库，获得高质量的mRNA是至关重要的，所以处理mRNA样品时必须仔细小心。因此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。在建库时，可根据不同的研究目的选择合适的反转录酶和方法，以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与pDONR222载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。双链cDNA克隆前应注意进行末端修饰和分级分离，在克隆时应注重掌控cDNA和载体的比例。本论文所使用的质粒载体pDONR222简单快捷，操作方便，重组效率高，可直接进行功能表达筛选。为了达到提高cDNA拷贝数，本论文采用了PCR技术接到cDNA文库，PCR技术不仅可加大低丰度mRNA的cDNA克隆几率，并且能较好的将微量的RNA或为数不多的几个细胞，建立为含量较大的cDNA文库。在本实验研究的操作过程中，在电泳时发现有时不会出现相应的条带，这是因为RNA极易降解。RNA的提取是本实验的基础步骤也是本试验成功的前提。在实验时所提取得大胡蜂毒腺RNA，测OD时并未得到很好的峰型，电泳检测结果的条带也非常得浅，说明所提取的RNA多数已经降解。所以在进行第二次提取RNA的时候，对实验的操作步骤进行了改进，为避免RNA污染和降解，带口罩进行实验操作，防止RNA被唾液淀粉酶降解。及时更换手套，使用不含RNase的塑料和玻璃器皿，配制溶液应使用无RNase的水。另外还发现，在挑菌时若碰到单菌落周围的菌落，也会使电泳结果出现错误，所以在实验过程中应小心的挑选单菌落，保证得到单克隆。药用胡蜂的应用与疾病在古今民族药著上都有记载，随着生活条件的日益进步，我们对于胡蜂的了解更加的深入，这将有助于大胡蜂的开发利用以及更深入的研究大胡蜂的生物效应。通过分析大胡蜂的基因并构建其毒素基因cDNA文库，进一步研究它们的理化性质、作用机理，研究大胡蜂多种药理活性的作用机制，得出活性作用物质的化学结构，将为大胡蜂资源的可持续利用提供科学依据，为深入研究此种胡蜂毒素的成分、基因及其功能提供了一个平台，为寻找新的活性组分和后续的研究打下基础。

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